微生物限度檢查作業(yè)指導(dǎo)書(shū)

1、 文件編號(hào) 文件版本號(hào) 微生物限度檢查作業(yè)指導(dǎo)書(shū)負(fù)責(zé)部門(mén) 品管部頁(yè) 碼1010目的：建立微生物限度檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，為微生物檢驗(yàn)人員提供正確的操作方法。范圍：適用于輔料、內(nèi)包材料和所有產(chǎn)品的微生物限度檢查。職責(zé)：檢驗(yàn)人員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。參照標(biāo)準(zhǔn)：GB/T4789.3-2003,GB/T4789.15-2003,GB/T4789.2-2003內(nèi)容：1 概述微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。供試品一般按批號(hào)隨機(jī)抽樣；抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量（以備復(fù)檢）。檢驗(yàn)的全過(guò)程，均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再

2、污染。2 儀器與用具恒溫恒濕培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴、高壓蒸汽消毒鍋、電熱恒溫干燥箱；試管、錐形瓶、量筒、培養(yǎng)皿（90mm）、刻度吸管、研缽；托盤(pán)天平或電子天平、鑷子、剪刀、酒精燈、打火機(jī)、編號(hào)筆、75%酒精棉球；拖鞋、無(wú)菌衣、褲、帽、口罩。以上玻璃器皿、鑷子、剪刀等洗凈、晾干，160170干烤2h，備用。所有滅菌物品存放于第一緩沖間，不應(yīng)超過(guò)2周即用畢。否則，應(yīng)重新滅菌。3 培養(yǎng)基、試液配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌用）、孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基，霉菌用）， 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（即BL，用于大腸桿菌增菌培養(yǎng)）、4甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養(yǎng)基（用于大腸桿菌快速檢查）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（即

3、MacC，用于腸道菌分離培養(yǎng)）、蛋白胨水培養(yǎng)基（供靛基質(zhì)試驗(yàn)用）、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（供甲基紅及VP試驗(yàn)用）、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（供枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)用）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB，沙門(mén)菌增菌用）、膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂（SS）培養(yǎng)基（用于沙門(mén)菌分離培養(yǎng)）、麥康凱瓊脂或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（大腸桿菌及沙門(mén)菌分離培養(yǎng)用）、三糖鐵瓊脂（TSI）斜面培養(yǎng)基（腸道菌初步鑒別用）的配制及滅菌方法參見(jiàn)中國(guó)藥典2000年版一部附錄C。 0.1%2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（供制備培養(yǎng)基用）、氫氧化鉀試液（供作VP反應(yīng)試劑）、萘酚乙醇溶液（供作VP試劑）、靛

4、基質(zhì)試液。的配制及滅菌方法參見(jiàn)中國(guó)藥典2000年版一部附錄C。 稀釋劑：0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PH7.2）。4 操作過(guò)程4.1 試驗(yàn)前的準(zhǔn)備4.1.1 將所有已滅菌的培養(yǎng)皿、錐形瓶、研缽、試管、吸管、量筒、稀釋劑及供試品等通過(guò)傳遞窗進(jìn)入無(wú)菌室內(nèi)，每次試驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入。將全部包裝去掉，編號(hào)。4.1.2 開(kāi)啟紫外燈30分鐘（或臭氧發(fā)生器1h）和空氣過(guò)濾裝置30分鐘，進(jìn)行空間滅菌處理。4.1.3 操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外線(xiàn)殺菌燈（或臭氧發(fā)生器），進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.1%苯扎溴銨（新潔爾滅）消毒液洗手或乙醇棉球擦手，穿戴無(wú)菌衣、帽

5、、口罩、手套。4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球（或碘伏棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開(kāi)口處周?chē)珊笥脺缇氖中g(shù)剪刀將供試品瓶、盒、袋啟封。啟封后先檢查包裝內(nèi)側(cè)及周?chē)袩o(wú)生霉、長(zhǎng)螨跡象，若經(jīng)證實(shí)為生霉、長(zhǎng)螨即可判為不合格，無(wú)須繼續(xù)檢驗(yàn)。4.1.5 定期檢查無(wú)菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定。4.2 操作4.2.1 細(xì)菌、霉菌與酵母菌4.2.1.1 以無(wú)菌操作，稱(chēng)取檢樣25g(ml)，加入含225ml滅菌水的具玻塞錐形瓶中，振搖30min,即為1：10稀釋液。 4.2.1.2 用滅菌吸管吸取1：10稀釋液10ml，注入滅菌試管中，另用1ml滅菌吸管反復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子充分散開(kāi)。4

6、.2.1.3 取1支1ml滅菌吸管吸取1：10均勻供試液1ml，沿管壁加入裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中，混勻即1：100供試液。以此類(lèi)推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1：103或1：104，細(xì)菌選擇兩至三個(gè)稀釋度，霉菌選擇三個(gè)稀釋度。4.2.1.4 在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管吸取每級(jí)稀釋液各1ml置每個(gè)滅菌平皿中，每稀釋級(jí)注2個(gè)平皿。另取1支1ml吸管吸取稀釋劑各1ml注入2個(gè)平皿中，作為陰性對(duì)照。4.2.1.5 將融化并冷至約45的培養(yǎng)基注入上述各個(gè)平皿約15 ml，以順時(shí)針或反時(shí)針?lè)较蚩焖俎D(zhuǎn)動(dòng)平皿（勿使培養(yǎng)基溢出）使供試液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。4.2.1.6 將已凝固的

7、平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)。細(xì)菌于36±1培養(yǎng)48±2小時(shí)，霉菌、酵母菌于2528培養(yǎng)，3天后開(kāi)始觀(guān)察，共培養(yǎng)觀(guān)察5天。4.2.1.7 將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼用標(biāo)記筆點(diǎn)計(jì)，以透視光襯以暗色背景，仔細(xì)觀(guān)察，計(jì)數(shù)。4.2.2 大腸桿菌取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌50100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)1824小時(shí)（必要可延至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5ml MUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時(shí)與24小時(shí)時(shí)，取未接種的M

8、UG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光下觀(guān)察。陽(yáng)性對(duì)照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性：無(wú)熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無(wú)菌生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。供試液MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陽(yáng)性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線(xiàn)于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，判未檢

9、出大腸桿菌?；蛴芯渖L(zhǎng)，應(yīng)挑選23可疑菌落作靛基質(zhì)試驗(yàn)（）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）及革蘭染色、鏡檢，按下表判斷結(jié)果。MUGI曙紅亞甲藍(lán)瓊脂IMVic結(jié)果+ +檢出大腸桿菌 未檢出大腸桿菌+ 無(wú)菌生長(zhǎng)未檢出大腸桿菌+ 有菌生長(zhǎng) + 檢出大腸桿菌 +有菌生長(zhǎng)+ + 檢出大腸桿菌注：如出現(xiàn)+或出現(xiàn)+，均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-I 和IMVic試驗(yàn)。 革蘭氏陰性桿菌。4.2.3 沙門(mén)菌：取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)1824小時(shí)，陰性

10、對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取其余2份培養(yǎng)物各1 ml，分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基10 ml中，培養(yǎng)1824小時(shí)。分別劃線(xiàn)接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)或延至4048小時(shí)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈現(xiàn)陽(yáng)性菌落時(shí)，供試品的平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于下表所列特征時(shí)，可判為未檢出沙門(mén)菌。培養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無(wú)色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全黑色或無(wú)色沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂無(wú)色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落麥康凱瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明

11、，菌落中心有時(shí)為暗色如供試品平板生長(zhǎng)的菌落特征有與上表所列形態(tài)特征相符或疑似者，均應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面上，陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)接種該培養(yǎng)基，培養(yǎng)1824小時(shí)后，陽(yáng)性對(duì)照的斜面應(yīng)為紅色，底層為黃色，硫化氫陽(yáng)性，而供試品的疑似菌斜面未見(jiàn)紅色、底層未見(jiàn)黃色，可判為未檢出沙門(mén)菌。否則，應(yīng)繼續(xù)做靛基質(zhì)試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)、動(dòng)力檢查、血清凝集試驗(yàn)。5 注意事項(xiàng)5.1 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死，損傷或繁殖。供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開(kāi)啟。包裝已開(kāi)啟的樣品不得作為供試品。5.2 除另有規(guī)定外，供試品

12、制備成供試液后，應(yīng)在均勻狀態(tài)取樣。制成供試液后，應(yīng)在60分鐘內(nèi)注皿操作完畢。5.3 配制后的培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如發(fā)生沉淀，應(yīng)趁熱過(guò)濾。5.4 制備妥的培養(yǎng)基應(yīng)在冷暗處保存，放置時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，錐形瓶的瓊脂培養(yǎng)基保存時(shí)間最長(zhǎng)不能超過(guò)一個(gè)月，以免水分散失染菌。5.5 勿用電爐直接融化瓊脂培養(yǎng)基，以免營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)度受熱而破壞。5.6 注皿時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)在45±1，高于45時(shí)易造成細(xì)菌受損或致死，低于45時(shí)易凝固，因此使用前應(yīng)水浴保溫。5.7 細(xì)菌、霉菌與酵母菌及控制菌必須做陰性對(duì)照試驗(yàn)（目的：測(cè)試檢驗(yàn)全過(guò)程無(wú)菌技術(shù)的可靠性），控制菌必須做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)（目的：檢查供試

13、品是否對(duì)控制菌生長(zhǎng)產(chǎn)生干擾作用，同時(shí)檢查培養(yǎng)條件是否適宜）。5.8 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)操作必須與供試品檢驗(yàn)操作嚴(yán)格分開(kāi)，避免交叉污染。5.9 做完試驗(yàn)后，用消毒液清潔，開(kāi)紫外燈照射30分鐘（或臭氧發(fā)生器1h）。6 結(jié)果判定菌數(shù)報(bào)告及結(jié)果判定按中國(guó)藥典2005年版二部附錄C。附件1 霉菌與酵母菌檢驗(yàn)程序附件2 細(xì)菌檢驗(yàn)程序附件3 大腸桿菌檢驗(yàn)程序供試品 供試液 膽鹽乳糖培養(yǎng)基 MUG-I MUG-I +MUG-I+ MUG-I+ + 判未檢出大腸桿菌判檢出大腸桿菌 EMB或麥康凱瓊脂報(bào)告報(bào)告 有菌落生長(zhǎng)無(wú)菌落生長(zhǎng) 普通肉湯瓊脂斜面判未檢出大腸桿菌 枸櫞酸鹽VP試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)革蘭氏染色鏡檢報(bào)告 報(bào)告