分解纖維素的微生物的分離公開課PPT課件

1、一、基礎知識一、基礎知識 第1頁/共31頁第2頁/共31頁 纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質，纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質，植物每年產生的纖維素超過植物每年產生的纖維素超過7070億噸，其中億噸，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能產生纖維素酶的微生物所利用，能被土壤中能產生纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。不會大量積累。 在草食性動物等的消化道內，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。第3頁/共31頁纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素第4頁/共31頁CX酶：內

2、切酶，使纖維素斷裂成片斷。C1酶：外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個葡萄糖 分子，產生纖維二糖葡萄糖苷酶：將纖維二糖分解成葡萄糖。第5頁/共31頁取二支取二支20mL20mL的試管的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗 濾紙崩潰法濾紙崩潰法各加入一張濾紙條各加入一張濾紙條各加入各加入pH4.8pH4.8，物質量為，物質量為0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液的醋酸醋酸鈉緩沖液1111mlml和和1010mlml甲甲 乙乙在乙試管中加入在乙試管中加入1 1mLmL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min140r

3、/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h1h結果：乙試管的濾紙條消失結果：乙試管的濾紙條消失 討論討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？什么？第6頁/共31頁提示：提示： 本實驗的本實驗的自變量是纖維素酶的有無自變量是纖維素酶的有無，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（量（1mL1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的pHpH。實

4、驗分析：實驗分析：P P2727的小實驗是如何構成對照的小實驗是如何構成對照的？的？第7頁/共31頁 剛果紅剛果紅能與能與纖維素形成紅色復合物纖維素形成紅色復合物，而不與，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。 （二）纖維素分解菌的篩選（二）纖維素分解菌的篩選 當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復紅色復合物合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅- -纖纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)維素的復合物

5、就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就，這樣我們就可以通過可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。第8頁/共31頁第9頁/共31頁二、實二、實 驗驗 設設 計計 請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及“操作操作提示提示”，在思考有關問題的基礎上，設計出一個詳細的，在思考有關問題的基礎上，設計出一個詳細的實驗方案。實驗方案。土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋 將樣品涂布在鑒別纖將樣品涂布在鑒別纖 維素分解菌的培養(yǎng)基上維素分解菌的培養(yǎng)基上 篩選產生透篩選產

6、生透 明圈的菌落明圈的菌落第10頁/共31頁 生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。第11頁/共31頁將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是集中，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境適宜環(huán)境。一般應將濾紙埋于深約。一般應將濾紙埋于深約10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。第12頁/共31頁 第13頁/共31頁培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基成分分析第14頁/共31頁提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇提示：自變量為培養(yǎng)基的種

7、類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖或者將纖維素改為葡萄糖。維素改為葡萄糖。有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。分解纖維素的微生物可以大量繁殖。第15頁/共31頁第16頁/共31頁第17頁/共31頁將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有尿素尿素做氮源的選擇做氮源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有纖維素粉纖維素粉做碳源的做碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)第

8、18頁/共31頁思考：本實驗的流程與課題思考：本實驗的流程與課題2 2中的實驗流程有哪些中的實驗流程有哪些異同？異同？ 本實驗流程與課題本實驗流程與課題2 2的流程的區(qū)別如下。課的流程的區(qū)別如下。課題題2 2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌得到菌落。本課題通過落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。他步驟基本一致。 第19頁/共31頁101102103104

9、105106第20頁/共31頁第21頁/共31頁鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)第22頁/共31頁第23頁/共31頁第24頁/共31頁在細菌分解尿素的化學反應在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的脲酶將尿素中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，的堿性增強，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入養(yǎng)基中加入酚紅指示劑酚紅指示劑，如，如果果pHpH升高指示劑會升高指示劑會變紅變紅剛果紅剛果紅可以與纖維素形成可以與纖維素形成紅色復合物紅色復合物，當纖維素被，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶

10、催化分解后紅色復合物無法形成，培養(yǎng)基復合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的菌為中心的透明圈透明圈觀察菌落周圍是否有觀察菌落周圍是否有著色的著色的環(huán)帶環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈透明圈來篩選纖維素分解菌來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法第25頁/共31頁方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可

11、以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結合到培養(yǎng)基的多糖活力的大小，實際上剛果紅是結合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產生纖維素酶，能底物，但分解纖維素的細菌可以產生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結合上去了，氯化鈉溶液就可以使結合不牢的剛果紅合上去了，氯化鈉溶液就可以使結合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖維素的能就強！當然分解纖維素的能就強！ 第26頁/共31頁第27頁/共31頁四、結果分析與評價四、結果分析與評價 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有

12、菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。 由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結果。等不同的分離結果。第28頁/共31頁 為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行_ _實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。纖維素酶測定方法是發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產生的對纖維素酶分解濾紙等纖維