PCR實驗室設(shè)計說明分析

1、PCR 實驗室設(shè)計說明PCR 實驗室分為四個區(qū)域，進入各匸作區(qū)域必須嚴格按照單方向進行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各匸作區(qū)域時，不得將匸作服帶出，四區(qū)域分 別為：1.試劑配制區(qū) n2. 樣品處理區(qū) n3. 核酸擴增區(qū) n4.產(chǎn)物分析區(qū) n如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并，三四區(qū)可合并為擴增產(chǎn)物分析。各區(qū)的功能是：1.1.1 試劑準備區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存。1. 1.2 樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝：核酸提取、保存和加樣。1.1.3 擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增產(chǎn)物的測定、結(jié)果分析、登記及報告。1.2 擴緡前區(qū)與擴增后區(qū)應(yīng)嚴格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最

2、好有定的間隔。1. 3 使用商品化試劑盒可在樣品處埋區(qū)進行少量試劑配制。1.4 在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑準備區(qū)可設(shè)在同房間內(nèi):1.4. 1 在生物安全柜內(nèi)操作。1.4.2 每個實驗人員、實驗組分別使用各自的試劑及耗材。1.4.3 盛放污染材料的器 IIIL 密封并次性使用。1. 4. 4 用有效的方法對操作區(qū)域和共享器具在實驗前后進行清潔及消毒。設(shè)計要求:PCR 實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式，現(xiàn)要主要是以組合形式為主流。完成組 PCR 實驗，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處埋、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要， 還應(yīng)增加樣品粉碎過程。一、 分散形式

3、 PCR 實驗室所謂分散形式 PCR 實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此和距較遠，呈分散布置形式。 對于這種布置形式的 PCR 實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。二、 組合形式 PCR 實驗室所謂組合形式 PCR 實驗室，是指完成 PCR 四個實驗過程的實驗用房和鄰布置，組成獨立實驗區(qū) 域的形式。對于組合形式 PCR 實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此， 對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染，可以通過 控制效果。雖人于排風風

4、量達到正壓進風風核酸擴增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過 控制排風風量大于進風風量達到負壓效果。在理想情況下，PCR 實驗室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室 內(nèi)。PCR 實驗室進風由原有中央空調(diào)控制，要求將中央空調(diào)風口安裝到指定定點，且高度為地而鋪裝 好后 2600mm 處。如果使用熒光 PCR 儀，擴增室和產(chǎn)物分析室可以合并。若房間進深允許，可設(shè) PCR 內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換力面，緩沖間 比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免 實驗

5、之間的相互干擾，防 II：核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。實驗室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內(nèi)壁 光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒：地而材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。如果使用熒光 PCR 儀，擴增室和產(chǎn)物分析室可以合并。若房間進深允許，可設(shè) PCR 內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換力面，緩沖間 比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免 實驗之間的和互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。實驗室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所

6、有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內(nèi)壁 光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒：地而材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。主要設(shè)備試劑準備區(qū)儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機等，加樣器、天平 除了要專用外，還應(yīng)有定期校準。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進行擴增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分/生物學(xué) 級的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。標本制備區(qū)儀器設(shè)備主要有生物安全柜、加樣器、離心機、溫育儀、混勻器等擴增區(qū)擴增區(qū)的主要儀器是核酸擴增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機、可移動紫外燈。擴增 儀需進行校準。并配備 UPS 電源，以防止由于電壓的波動，停電對擴增效果的影響。分

7、析區(qū)本區(qū)所使用的儀器設(shè)備有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等.定的規(guī)這是有，分之-室的八驗?zāi)艹^主實驗區(qū)的緩沖間部分面積不潔凈實1、 主體結(jié)構(gòu)：主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均釆用鋁合金 50 內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污 染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。2、 標準的四區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：將 PCR 過程分成試劑準備、標本制備和 PCR 擴增，產(chǎn)物分析四個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有 個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個 PCR 實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_緩沖區(qū) I ,緩沖

8、區(qū) II 和 PCR 擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都 安裝有風量可調(diào)的回風口，空氣通過回風口向室內(nèi)換氣。3、 消毒：在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū)還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。4、 不銹鋼傳遞窗：試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電了連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳 遞過程中不受污染（人物分流）。5、 地面地而建議使用 PVC 卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行淸掃，耐腐蝕。6、 照明燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。在建設(shè)的過程中應(yīng)注意：規(guī)范的安裝流程和全而的服務(wù)

9、流程。嚴格按照規(guī)范科學(xué)設(shè)計的安裝流程。安裝前需要確定以下安裝條件，女 I：電源電壓，電源進線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進線位置，進水水 壓，等，理想狀態(tài)的空間尺寸平整度，通風孔、進水管和下水管的位置最小安裝空間，地面.樣本處理區(qū)三、工作區(qū)域及設(shè)備要求區(qū)備 試劑儲存和準 -）冰箱 和-I5C1、2-8C、混勻器 2 ） 1-lOOOuL 微址加樣器（覆蓋 3 ）面、移動紫外燈（近匸作臺 4 頭（帶濾心）吸理的離心 管和加樣辭一次性吸水紙、耐島壓處 5、消耗品：一次性于套、專用工作服和匸作鞋 6、專用辦公用品 7 標木制備區(qū)（二冰箱 80C -20C 或-K2-8C 冰箱、高速臺式冷凍離心機 2、混允器 3

10、、水浴箱或加熱模塊 4 ） 1-1000U15、 微址加樣器（覆蓋 Iftl）作臺 6、可移動紫外燈（近工、生物安全柜 7 頭（帶濾心）器吸壓處理的離心管 和加樣 8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高、專用工作服和工作鞋 9、專用辦公用品 10。具 有超聲波水浴儀DNA,應(yīng)如需處埋大分子制和擴增區(qū)配擴増反應(yīng)混合物（三核酸擴增儀 1、）l-1000ul 微址加樣器（覆蓋 2、Ifti）臺可移動紫外燈（近丄作 3、頭（帶濾心）吸理的離心管和加樣器、一次性 吸水紙、耐高壓處 4、消耗品：一次性手套專用工作服和工作鞋 5、專用辦公用品 6、擴增產(chǎn)物分析 區(qū)）（四木儀器設(shè)備如下:?；暀z驗方法不同

11、而定1-lOOOull、微雖加樣器（覆蓋 Ifti）作臺 2、可移 動紫外燈（近匸頭（帶濾心）器吸、一次性吸水紙、加樣 3、消耗品：一次性手套專用工作服和工作鞋4、專用辦公用品 5、人員和樣品必須定室設(shè)汁規(guī)程中規(guī)共流同來保證。PCR 實驗 5人員和樣品的安全 是由生物安全柜和定向氣取向流動。即從，絕對不能反向流區(qū)”，再從樣品制備區(qū)走向擴增區(qū)和產(chǎn)物分析“試劑準備區(qū)到樣品制備動，以辟免交叉污染。氣流方向只規(guī)定試劑準備區(qū)為微正壓或常樂，樣品制備區(qū) 為常壓或負壓，擴増區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)為負壓，壓力梯度是從試劑準備到產(chǎn)物分析區(qū)，是商到低的。規(guī)程并沒有規(guī)定要做成全新全新風系統(tǒng)。成做交叉污染的風險，建議風系統(tǒng)，

12、但是為降低 1 概述臨床基因擴增實驗又稱 PCR 實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾 病的種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所倉的基因進行擴增的方法，測出些病毒含量不高的 感檢驗難以檢測出的病證并具有靈敬度定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通染者體內(nèi)是否含 有特.高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點，因此被臨床醫(yī)生廣為認可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨 床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實驗 室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設(shè)越來越得到重視，因為它對 檢測結(jié)果的可靠性、準確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。

13、本文主要從臨床基因擴增檢驗實驗室的 平面布局，空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制和污染的防制幾個方而對實驗室設(shè)計中的主要特點進行了閘述。臨床基因擴增檢驗實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。因此，實驗室的平面布局、空調(diào)通風 系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進行的。下而就對這幾個方而分別進說明。2PCR 實驗室平面布局臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴 增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵 循單方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)一標本制備區(qū)一擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)一擴增 產(chǎn)物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的

14、試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。PCR 實驗室平而布置示盤圖如圖 1 所示。實驗室平面布置示意圖圖 1 PCR3 實驗室空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制交叉污染的可能性，宜采用全送 PCR 實驗室并沒有嚴 格的凈化耍求，但是為避免各個實驗區(qū)域間。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保全排的氣 流組織形式證各實驗區(qū)的壓力要求。試劑貯存和準備區(qū) 3.1操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標該實驗區(qū)主要進行 的材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原本制作的材料 應(yīng)直接.制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。3.2 標本制備區(qū)該

15、區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸（RNA、DNA）捉取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管 和測定 RNA時 cDNA 的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。3.3 擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)該區(qū)域主要進行的操作為 DNA 或 cDNA 擴增。此外，已制備的 DNA 模板和合成的 cDNA（來 自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進 行。在巢式 PCR 測定中，通常在第輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污

16、染危險性, 第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏岀。為避免氣溶膠所致 的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。3.4 擴增產(chǎn)物分析區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓, 以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。4 污染的預(yù)防與控制PCR 實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴 增產(chǎn)物的污染；天然基因組 DNA 的污染；試劑的污染以及標本間

17、的污染。由于旦發(fā)生污染， 實驗就必須停止，宜到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再 圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而 不是排除。4.1 工作區(qū)域的嚴格劃分（1）各個實驗區(qū)域設(shè)置合理：（2）各個實驗區(qū)域妥有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗 區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。合理的系統(tǒng)設(shè)置 4.2（1）合理的空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力妥求。4.3 規(guī)范的操作（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術(shù)人員必須進行上崗培訓(xùn)

18、，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因 擴增檢驗的工作；（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用次性帽 C 也是個有效地防止污染的措施；（3）淸潔工作及時、正確。實驗工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進行淸潔。除常規(guī)的消毒液體對 農(nóng)面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對些實驗設(shè)備還應(yīng)進行高壓消毒處理。4.4 嚴格的管理（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關(guān)的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下妥 設(shè)置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門：（2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的匸作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將 本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；（3）盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必

19、要的走動以減少交叉污染的可能性。（4）擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液 浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)處理, 如焚燒等：（5）擴增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基 I 対突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實驗人員的安全防 護。4.5 完備的實驗室配套設(shè)施完備的實驗室配套設(shè)施是保證實驗匸作的必要條件， 應(yīng)根據(jù)各個實驗室實驗內(nèi)容的不同配備相應(yīng) 的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。PCR 實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全 送全押:的氣流組織形式。同時，要嚴搭控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。3.1 試劑貯存和準備區(qū)該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標 材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原本制作的材料應(yīng) 宜接.制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。3.2 標