蛋白質(zhì)的表達(dá)純化PPT課件

1、1實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定 (1)了解重組蛋白表達(dá)的方法和意義。 (2)了解親和層析分離純化的方法。 2 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有重要的意義。通過(guò)表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的80%。3 本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌bl21中，在37，iptg誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重

2、組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過(guò)共價(jià)偶連的次氨基三乙酸（nta）使鎳離子（ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實(shí)為金屬熬合親和層析（mcac）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。4 材料與試劑材料與試劑 試劑1 lb液體培養(yǎng)基：trytone 10g, yeast extract 5g, nacl 10g, 用蒸餾水配至1000ml.2 氨芐青霉素：100mg/ml3 上樣緩沖液(glb)：100 mm nah2po4, 10 mm tris, 8m urea, 10 mm 2-me, ph8.04 washing buffer（uwb）： 100 mm nah2po

3、4, 10 mm tris, 8 m urea, ph6.35 elution buffer(洗脫): 100 mm nah2po4, 10 mmtris, 8m urea, 500 mm imidazole, ph8.06 iptg5實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 一、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)一、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo) 1. 接種含有重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌bl21菌株于5ml lb液體培養(yǎng)基中 （含100ug/ml 氨芐青霉素），37震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 2. 轉(zhuǎn)接1ml過(guò)夜培養(yǎng)物于100ml（含100ug/ml 氨芐青霉素）lb液體培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)至od600 = 0.6 -

4、0.8。取10ul 樣品用于sds-page 分析。 3. 加入iptg至終濃度0.5 mmol/l, 37繼續(xù)培養(yǎng)1-3h. 4. 12，000rpm 離心10 min, 棄上清，菌體沉淀保存于-20或-70冰箱中。6 二、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化二、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化 1.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融50ml菌體沉淀，加入5ml上樣緩沖液glb, 用吸管抽吸重懸, 4 12000rpm 離心 30 min, 將上清（總蛋白細(xì)胞裂解液）吸至一個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。 2. nta層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入1ml nta介質(zhì)，并分別用8ml 去離子水，8m

5、l上樣緩沖液glb洗滌。(調(diào)速0.5ml/3分鐘 ) 。 3. 細(xì)胞裂解液3ml以10-15ml/h 流速上ni2+-nta柱，收集流出液。 4.洗脫雜蛋白：用50ml洗滌緩沖液uwb以10-15ml/h流速洗柱，分別取10ul洗滌開(kāi)始與結(jié)束時(shí)的樣品用于sds-page 分析。 5.洗脫目標(biāo)蛋白：用10ml洗脫緩沖液洗柱，每管0.51 ml，共收集610管，分別取10ul樣品用于sds-page 分析。7 1裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。 2制分離膠：按所需的濃度配制12.5分離膠分離膠。30%acr-bis tris-hcl ph 8.8 h2o10%aptemed5ml3ml4ml12

6、0ul20ul 灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面），等膠自然凝聚后（這時(shí)候在膠面與水封之間可以看見(jiàn)清晰的界限）8 3制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠濃縮膠，配方如下：30%arc-bis tris-hcl ph 6.7 h2o10%aptemed400ul750ul1800ul50ul10ul910 5加樣：取大腸桿菌和bsa蛋白樣品加樣，每個(gè)加樣孔加樣不宜過(guò)多，一般每孔加樣10l。 6電泳：先恒壓80v，待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓為120v（恒壓）。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到離底部約0.5cm時(shí)，停止電泳。117翹開(kāi)玻璃板，將濃縮膠切掉, 剝下凝膠，準(zhǔn)備染色。8 凝膠染色：使用考馬

7、斯亮藍(lán)r250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液回收染液至指定容器至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，75%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。12注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) (1) acr和bis均為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用，操作時(shí)應(yīng)戴手套和口罩。 (2) 玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。 (3) 樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。 (4) 灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過(guò)。 (5) 切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū)帶扭曲。（6）電泳時(shí)應(yīng)選

8、用合適的電流、電壓，過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響電泳效果。 (7) 稀釋5sds/電泳緩沖液至1濃度灌入電泳槽，需800毫升。131.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開(kāi)呈直角狀，放入厚薄兩片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭頭向上，旁邊兩條小玻璃條與薄玻璃接觸，使之形成一個(gè)間隙。2.在平整的桌面上放下玻璃與夾子，使玻璃和夾子的底面完全對(duì)齊，向外扳動(dòng)塑料卡口，關(guān)緊夾子。 143.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭頭向上。按彈簧夾，將玻璃夾卡入制膠架。在玻璃的間隙內(nèi)灌膠，放上梳子，待膠凝固。 4.取出制好的玻璃（連帶膠），將玻璃放入電極架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向電極架，厚玻璃的箭頭朝上，玻璃與紅色橡膠條必須完全緊貼。（需同時(shí)放置兩塊制好的膠，如只使用一塊則另一面須用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條完全緊貼。）正常安裝則會(huì)