蛋白質(zhì)的鹽析與電泳

1、生物技術(shù)綜合大實驗報告姓 名： 曾奇 學(xué) 號： 20112113310056 學(xué) 院： 海洋學(xué)院 專 業(yè)： 11級海洋科學(xué) 指導(dǎo)老師： 方再光 日 期： 2014年6月18日 蛋白質(zhì)的純化與電泳1.實驗?zāi)康牟捎昧蛩徜@鹽析法將瓊膠降解酶從瓊膠降解菌FG1的產(chǎn)物中分離出來，并學(xué)習(xí)使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDSPAGE) 測定蛋白質(zhì)的分子量，使學(xué)生學(xué)習(xí)掌握離心技術(shù)和采用鹽析法分離目的蛋白技術(shù)以及電泳法的基本原理和操作技術(shù)。2.實驗原理2.1鹽析法沉淀蛋白質(zhì)技術(shù)2.1.1鹽析法的概念用鹽析法從成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)溶液（如細(xì)胞裂解液）中提取目的蛋白質(zhì)是一種傳統(tǒng)的目前仍被廣泛使用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)

2、。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。2.1.2鹽析法的基本原理蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，其溶解度會隨鹽濃度的升高而增加，此種現(xiàn)象被稱作鹽溶。但是當(dāng)鹽的濃度繼續(xù)增高時，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度地下降并先后從溶液中析出，此種現(xiàn)象被稱為鹽析。上述現(xiàn)象 是由于蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間存在靜電力。在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間的靜電力受鹽離子的影響而被消除，蛋白質(zhì)在水中的極性基團(tuán)的電荷被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。2.1.3影響蛋白質(zhì)鹽析的因素（1）蛋白質(zhì)溶液中鹽的濃度。不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。從成分復(fù)

3、雜的蛋白質(zhì)溶液中分離蛋白質(zhì)時，鹽的飽和度應(yīng)由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀就應(yīng)將其分離除去后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀出來；（2）蛋白質(zhì)溶液的PH值。在蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小而容易沉淀出來，因此鹽析時應(yīng)將PH值調(diào)節(jié)在目的蛋白質(zhì)的等電點附近；（3）蛋白質(zhì)濃度。在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易被鹽析沉淀。但是濃度太高時，易使雜蛋白共沉淀；（4）溫度。濃鹽溶液對蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，因此一般的鹽析操作可以在室溫下進(jìn)行。2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDSPAGE)技術(shù)2.2.1聚丙烯酰胺凝膠電泳的概念和分類聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱PAGE）用于分離蛋

4、白質(zhì)和寡糖核苷酸，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域重要的分析技術(shù)，是蛋白質(zhì)純度和濃度分析等實驗的常用技術(shù)之一。聚丙烯酰胺凝膠電泳有非變性聚丙烯酰胺凝膠和SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)兩種形式。非變性聚丙烯酰胺凝膠在電泳時，蛋白質(zhì)是完整的，并且根據(jù)蛋白質(zhì)的形狀、分子量大小以及其所帶電荷量而逐漸呈梯度分開。本次實驗所用技術(shù)為SDSPAGE，此技術(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同而將蛋白質(zhì)分開。該技術(shù)最初是Shapiro等于1967年發(fā)明的，他們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)還原劑和離子去污劑在加入到樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠后，亞基分子量的大小是蛋白質(zhì)亞基電泳遷移率的主要影響因子（可以忽略電荷因素）。2.2.2 SDSPAGE的基

5、本原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當(dāng)溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(pI)時，蛋白質(zhì)本身帶負(fù)電，在電場中將向正極移動；當(dāng)溶液的pH小于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)帶正電，在電場中將向負(fù)極移動；蛋白質(zhì)在特定電場中移動的速度取決于其本身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分子形狀、電場強(qiáng)度等。 聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)。本實驗采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔徑的兩層凝膠；這樣，當(dāng)含有不同分子量的蛋白質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較大，不同大小的蛋白質(zhì)分子在通過

6、大孔膠時，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時，分子量大的蛋白質(zhì)移動速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的區(qū)帶。這就是常說的濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。同時，在制備上層膠(濃縮膠)和下層膠(分離膠)時，采用兩種緩沖體系；上層膠pH=6.76.8，下層膠pH8.9；TrisHCI緩沖液中的Tris用于維持溶液的電中性及pH，是緩沖配對離子；CI-是前導(dǎo)離子。在pH6.8時，緩沖液中的Gly-為尾隨離子，而在pH8.9時，Gly的解離度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進(jìn)而達(dá)到控制其有效遷移率之目的。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在進(jìn)入分離

7、膠后，各種蛋白質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場中達(dá)到有效的分離。 如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合，形成帶負(fù)電性的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物；此時，蛋白質(zhì)分子上所帶的負(fù)電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場中移動得愈快；反之，愈慢。SDS-聚丙烯酰胺

8、凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定蛋白質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點，是目前一般實驗室常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。3.實驗材料及器材3.1實驗材料（1）瓊膠降解菌FG1，由本實驗室提供（2）分析純硫酸銨：用干凈的磁研缽研成細(xì)粉末（3）30%三氯乙酸（4）SDS-PAGE所需試劑3.2實驗儀器（1） DYCZ-24D垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠)（2） 電泳儀DYY-4（北京六一儀廠）（3） 長滴管及微量加樣器（4）燒杯(100mL、250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培養(yǎng)皿(15cml5cm)、離心管（50mL）、微量離心管（1.5mL）10支（5）注射器

9、、微量離心管支架（6）高速冷凍離心機(jī)（7）移液器（1ml、200L、20L）、移液槍（1ml、200L、20L）（8）磁力攪拌器、攪拌磁棒3.3實驗試劑試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)單位SDSPAGE所用試劑丙烯酰胺100gBBI甲叉雙丙烯酰胺100gBBI過硫氨酸100gBBI尿素500g廣州化學(xué)試劑有限公司TEMED100mlSigmaSDS500gBIO BASIC INCDTT1g中科瑞泰生物科技公司甘氨酸100g中科瑞泰生物科技公司冰醋酸500ml廣州化學(xué)試劑有限公司甲醇500ml廣州化學(xué)試劑有限公司考馬斯亮藍(lán)R-2505g中科瑞泰生物科技公司低分子量蛋白質(zhì)Marker14.4-116KDa中科瑞

10、泰生物科技公司硫酸銨鹽析所用試劑硫酸銨500g廣州化學(xué)試劑廠4.實驗內(nèi)容4.1硫酸銨鹽析法分離目的蛋白4.1.1材料預(yù)處理（1）菌體和產(chǎn)物的分離：取6個50ml離心管分別裝入瓊膠降解菌FG1、FG2、FG3、FG4、FG5、FG6的發(fā)酵液，用分析天平平衡離心管，10000r/min，離心10min，取上清液。（2）粗提物的獲?。涸冢?）中所獲取的上清液中加入20%(NH4)2SO4，放入裝有碎冰的泡沫箱，靜止2h，獲得瓊膠降解物的粗提物。4.1.2預(yù)實驗：硫酸銨鹽析最佳飽和度的確定（1）取7支微量離心管，用記號筆在管帽上標(biāo)記20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述離

11、心管作容器分別稱取磨細(xì)的硫酸銨晶體末0.171克、0.246克、0.366克、0.468克、0.477克、0.705克和0.843克；（3）分別向上述裝有（NH4）2SO4粉末的離心管中添加1.5ml的粗提物（瓊膠降解菌FG），充分振蕩使（NH4）2SO4溶解后，在4度下靜置12h；（4）將離心管放置于離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，傾去上清，倒立離心管，以便盡可能多地去除上清；（5）添加0.5ml蒸餾水及8l30%三氯乙酸混勻,靜置10分鐘后,離心,盡量去除上清；(因此步會造成蛋白質(zhì)不溶影響后續(xù)工作，所以省略)（6）將離心管置于快速干燥器中干燥30分鐘；（7）向離心管中添加100

12、ISDS-PAGE上樣緩沖液懸浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分鐘，取出置-20冰箱中備用；4.2 SDSPAGE電泳確定目的蛋白最佳飽和度4.2.1主要試劑（1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合液（2)30凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr） 29.2g，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis） 0.8g,加雙蒸水至100mL。外包錫紙，4冰箱保存，30天內(nèi)使用。（3)分離膠緩沖液(1.5molL): Tris 18.17g,加雙蒸水溶解,6mol/L HCl調(diào)pH8.8,定容100mL。4冰箱保存（4)濃縮膠緩沖液(0.5molL): Tris 6.06g,加水溶解，6mol/L HCl調(diào)pH6.8，并定容到100mL。4冰箱保存（5

13、)電極緩沖液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加雙蒸水溶解并定容到1000mL。4冰箱保存。（6)10SDS，室溫保存（7)質(zhì)量濃度10過硫酸銨(新鮮配制)（8)上樣緩沖液：0.5molL Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10SDS 2mL，-巰基乙醇1mL，0.1溴酚藍(lán)0.5mL，加蒸餾水定溶至10mL。（9)0.25考馬斯亮藍(lán)R-250染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸（10)脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875ml雙蒸水混合（11)未知分子量的蛋白質(zhì)樣品(1mgmL )4.2.2實驗操

14、作（1）裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適中程度, 即可灌膠。（2）凝膠的聚合 分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10的分離膠和4.8的濃縮膠。試劑名稱10%的分離膠5%的濃縮膠Acr/Bis 30%/ml分離膠緩沖液（pH8.9）/ml濃縮膠緩沖液（pH6.8）10%SDS/ml10%過硫酸銨/ul雙蒸水/mlTEMED/ul3.33.7500.1504.0550.801.250.1252.925按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩

15、用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止,約5mL。然后用細(xì)滴管或注射器仔細(xì)注入少量水,約0.5-1mL。室溫放置聚合30-40min。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，按上表制備濃縮膠。用長滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子(梳子)；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子。（3）蛋白質(zhì)樣品的處理 若標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或欲分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lmL 0.5molL pH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸餾水中；若樣品是液體，要測定蛋白質(zhì)濃度，按1.01.5mgmL溶液比例，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實驗所用樣品為1520mg的標(biāo)

16、準(zhǔn)蛋白樣品溶液，放置在0.5mL的離心管中，加入1520ml的樣品處理液。在100水浴中處理2min，冷卻至室溫后備用。 吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品20ml，按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的處理方法進(jìn)行處理。（4）加樣SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板,上提斜插板使其松開,然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠框,注意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個夾緊力,再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽,插入斜板,將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上,外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可,注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。 加樣時可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準(zhǔn)確定位加樣位置，或用微量注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣

17、，各加1015ml(含蛋白質(zhì)1015mg)，稀溶液可加2030ml (還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握)。 （5）電泳 加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，樣品進(jìn)膠前電流控制在1520mA，大約1520min；樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后，電流升到3045mA，電泳過程保持電流穩(wěn)定。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿12cm處即停止電泳，約6小時。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。（6）染色、脫色 電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標(biāo)志，放入大培養(yǎng)皿中染色，使用0.25

18、的考馬斯亮藍(lán)染液，染色24h，必要時可過夜。 棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進(jìn)行擴(kuò)散脫色，經(jīng)常換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止。5.數(shù)據(jù)處理和現(xiàn)象記錄5.1鹽析現(xiàn)象和數(shù)據(jù)記錄5.1.1鹽析現(xiàn)象蛋白質(zhì)鹽析后，發(fā)現(xiàn)1號離心管基本無絮狀沉淀，2號離心管略有沉淀，3、4、5號離心管均有較多絮狀沉淀，6、7號離心管底部有很多沉淀并硫酸銨鹽過飽和而析出。5.1.2鹽析梯度濃度硫酸銨濃度20%30%40%50%60%70%80%硫酸銨質(zhì)量g0.1710.2640.3660.4680.5870.7050.843溶液體積ml1.55.2 SDSPAGE電泳數(shù)據(jù)記錄和處理5.2.1SDS-PA

19、GE電泳圖譜兩膠分離界面Line6Line8Line7Line5Line4Line3Line2Line17 6 5 4 3 2 1上圖所示區(qū)域為本組點樣區(qū)，從右到左依次標(biāo)記為1到7號。并出現(xiàn)圖示的8個條帶。5.2.2實驗結(jié)果：從上圖的電泳圖譜可以看出來，本次實驗總共分離出8條較為清晰的電泳帶，按照蛋白質(zhì)分子量的大小依次為Line1到Line8，表明瓊膠酶降解菌FG1所分泌的蛋白質(zhì)總共有8種。其中，Line1，Line2，Line3，Line7四條帶清晰程度高，表明其含量高，說明這四種蛋白質(zhì)在FG1降解菌的分泌蛋白質(zhì)占主導(dǎo)地位，而其余4種蛋白質(zhì)條帶模糊不清，表明其含量低，F(xiàn)G1降解菌分泌的少。這

20、說明FG1瓊膠酶降解菌分泌的酶是非常多樣的，存在著復(fù)雜的協(xié)同效應(yīng)，并且主要是大分子量的蛋白質(zhì)。另外縱向來看，3,4，5號點樣孔尤其是4號點樣孔的條帶最為清晰可辨，表明在鹽濃度為40%到60%時，蛋白質(zhì)鹽析結(jié)果較好，其中以4號鹽析濃度下（即50%濃度）的蛋白質(zhì)析出效果最好。5.2.3分析與討論電泳圖譜中顯示有些條帶彌散較為嚴(yán)重，如Line4和Line5最為明顯。分析原因大概有以下幾點：比如實驗操作誤差，冷藏時將蛋白質(zhì)誤存入-20度冰箱保存，電泳時電壓不穩(wěn)定，電泳儀出現(xiàn)一些問題等等 ，這些因素都會最終影響實驗結(jié)果。6.問題與解答6.1為提高蛋白質(zhì)鹽析分離效率，應(yīng)采取哪些措施？由統(tǒng)一單蛋白鹽析公式：

21、lgS=b-KsI可知，要想提高蛋白質(zhì)的鹽析效率，主要從鹽的種類、PH、溫度等方面考慮。其中，對于鹽的選擇來說，可使用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉等，目前前兩者最廣泛使用，前者最受歡迎。PH影響b值，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)溶解度，在蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小而容易沉淀出來，因此鹽析時應(yīng)將PH值調(diào)節(jié)在目的蛋白質(zhì)的等電點附近。在同離子強(qiáng)度溶液中，升高溫度可使b值下降，在保證蛋白質(zhì)不失活的條件下，可加快鹽析過程。此外，蛋白質(zhì)溶度對沉淀具有雙重標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)溶度越高，鹽的飽和度極限越低，但雜蛋白的共沉淀現(xiàn)象也隨之加重，故蛋白質(zhì)濃度一般控制在2.5-3.0%。6.2為測定用硫酸銨鹽析法分離某種蛋白質(zhì)的最佳硫酸銨濃度，除采用本講義設(shè)計的操作程序之外，請你設(shè)計另一種工作程序測定鹽析目的蛋白質(zhì)的硫酸銨最佳濃度，并指出兩種方法的優(yōu)缺點。（1）稱量法：稱取鹽析完畢干燥后的粗蛋白提取物質(zhì)量，建立硫酸銨飽和度蛋白質(zhì)質(zhì)量曲線，得出硫酸銨鹽析最佳飽和度。（2）優(yōu)缺點比較：優(yōu)點缺點稱量法方法簡便，操作簡單誤差大，不能準(zhǔn)確確定目的蛋白的硫酸銨鹽析最佳飽和濃度SDS-PAGE電泳法精確，能準(zhǔn)確測定目的蛋白的硫酸銨鹽析最佳飽和濃度操作繁瑣，試驗時間