第四章誘變劑

1、 凡能誘發(fā)生物基因發(fā)生突變且突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)凡能誘發(fā)生物基因發(fā)生突變且突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)自發(fā)突變率的物理因子和生物化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為誘自發(fā)突變率的物理因子和生物化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為誘變劑。變劑。包括：包括：物理誘變劑；化學(xué)誘變劑；生物誘變劑物理誘變劑；化學(xué)誘變劑；生物誘變劑誘變劑誘變劑第一節(jié)第一節(jié) 物理誘變劑物理誘變劑第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑第三節(jié)第三節(jié) 生物誘變劑生物誘變劑主要內(nèi)容主要內(nèi)容 第一節(jié)第一節(jié) 物理誘變劑物理誘變劑指物理輻射中的各種射線，包括紫外線、物理誘變劑指物理輻射中的各種射線，包括紫外線、x x射線、射線、射線、快中子、射線、快中子、射線、射線、射線、微波、射線、微波、超聲波、電磁

2、波、激光等。超聲波、電磁波、激光等。誘變中常用的是紫外線（誘變中常用的是紫外線（uvuv）、）、x x射線、射線、 射線、射線、快中子?？熘凶?。 物理輻射可分為物理輻射可分為電離輻射電離輻射（ionizing radiationionizing radiation）、）、非電離輻射非電離輻射（nonionizingnonionizing radiation radiation）。）。 單位：量子。單位：量子。一、物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)一、物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)物理誘變劑對(duì)微生物的誘變作用主要是由物理誘變劑對(duì)微生物的誘變作用主要是由高能輻射高能輻射引起引起生生物系統(tǒng)損傷物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生，繼而

3、發(fā)生遺傳變異遺傳變異的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過(guò)程。過(guò)程。作用過(guò)程可分為物理、物理作用過(guò)程可分為物理、物理- -化學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等幾個(gè)階化學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等幾個(gè)階段。段。輻射引起生物學(xué)效應(yīng)的影響因素輻射引起生物學(xué)效應(yīng)的影響因素 微生物的遺傳背景微生物的遺傳背景 微生物的生理狀態(tài)微生物的生理狀態(tài) 可見光可見光 水分水分 溫度溫度 空氣或氧氣空氣或氧氣二、非電離輻射二、非電離輻射紫外線紫外線1.1.紫外線的誘變機(jī)制紫外線的誘變機(jī)制形成嘧啶二聚體形成嘧啶二聚體2.dna2.dna損傷修復(fù)損傷修復(fù)光修復(fù)光修復(fù)切補(bǔ)修復(fù)切補(bǔ)修復(fù)（一）紫外線的誘變機(jī)制和（一）紫外線的誘變機(jī)制和dnadn

4、a損傷修復(fù)損傷修復(fù)（二）紫外線誘變（二）紫外線誘變1 1、紫外線的有效光譜、紫外線的有效光譜 能誘發(fā)微生物突變的紫外線的有效波長(zhǎng)范圍是能誘發(fā)微生物突變的紫外線的有效波長(zhǎng)范圍是2002003 300nm00nm，最有效的波長(zhǎng)為最有效的波長(zhǎng)為253.7253.7nmnm。2 2、紫外線的輻射劑量、紫外線的輻射劑量有絕對(duì)劑量和相對(duì)劑量之分。有絕對(duì)劑量和相對(duì)劑量之分。絕對(duì)劑量：?jiǎn)挝唤^對(duì)劑量：?jiǎn)挝籩rg/mmerg/mm2 2（1erg=101erg=10-7-7j j）用用劑量?jī)x劑量?jī)x測(cè)定測(cè)定相對(duì)劑量：?jiǎn)挝挥孟鄬?duì)劑量：?jiǎn)挝挥谜丈鋾r(shí)間照射時(shí)間或或殺菌率殺菌率表示。表示。劑量決定于紫外燈功率、燈管與照射物

5、的距離及照射劑量決定于紫外燈功率、燈管與照射物的距離及照射時(shí)間。時(shí)間。1515w w紫外燈、紫外燈、3030cmcm燈距、殺菌率燈距、殺菌率909099.999.9時(shí)不同微生時(shí)不同微生物的照射時(shí)間：物的照射時(shí)間：一般芽孢：一般芽孢：1010minmin一般微生物營(yíng)養(yǎng)體：一般微生物營(yíng)養(yǎng)體：3 35 5minmin無(wú)芽孢菌和革蘭氏陰性菌：無(wú)芽孢菌和革蘭氏陰性菌：0.50.52 2minmin因此，某種微生物的最適劑量并不一定適合另一種。因此，某種微生物的最適劑量并不一定適合另一種。3 3、紫外線誘變的步驟與方法、紫外線誘變的步驟與方法 出發(fā)菌株出發(fā)菌株 細(xì)菌：培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期；霉菌、放線菌：孢子剛成熟

6、。細(xì)菌：培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期；霉菌、放線菌：孢子剛成熟。 前培養(yǎng)前培養(yǎng)制備營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基制備營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基將菌體培養(yǎng)到最佳生理狀態(tài)將菌體培養(yǎng)到最佳生理狀態(tài) 制備菌懸液制備菌懸液離心離心生理鹽水懸浮，玻璃珠分散生理鹽水懸浮，玻璃珠分散過(guò)濾過(guò)濾要求：分散度：要求：分散度：9090- -9595 菌體濃度：細(xì)菌：菌體濃度：細(xì)菌：1 110108 8mlml-1-1; ;放線菌放線菌10107 710108 8mlml-1-1 霉菌：霉菌： 10 106 610107 7mlml-1-1 方法：方法： 紫外線照射紫外線照射紫外燈預(yù)熱紫外燈預(yù)熱將菌懸液放入平皿將菌懸液放入平皿照射照射 后培養(yǎng)后培養(yǎng) 稀釋涂布稀釋

7、涂布三、三、 電離輻射電離輻射1、電離輻射的種類、特征與來(lái)源、電離輻射的種類、特征與來(lái)源2、電離輻射劑量、電離輻射劑量radrad（拉德）：快中子的劑量單位。（拉德）：快中子的劑量單位。1 1g g被照射物質(zhì)被照射物質(zhì)吸收吸收100 100 ergerg輻射能量的射線劑量為輻射能量的射線劑量為1 1radrad。r r（倫琴）：倫琴）：x /x /射線的劑量單位。射線的劑量單位。1 1cmcm3 3干燥空干燥空氣在氣在00,1.01x10,1.01x105 5帕下產(chǎn)生帕下產(chǎn)生2.082.0810109 9離子對(duì)時(shí)所離子對(duì)時(shí)所需能量。需能量。吸收劑量（符號(hào)為吸收劑量（符號(hào)為d d）和吸收劑量率）

8、和吸收劑量率適合于適合于射線、射線、射線、中子等任何電離輻射。射線、中子等任何電離輻射。吸收劑量：指被照射物某一點(diǎn)上單位質(zhì)量中所吸收的能吸收劑量：指被照射物某一點(diǎn)上單位質(zhì)量中所吸收的能量值。量值。國(guó)際單位：戈國(guó)際單位：戈瑞（瑞（gygy）1kg1kg被照射物吸收電離輻射的能量為被照射物吸收電離輻射的能量為1j1j（焦耳）時(shí)稱為（焦耳）時(shí)稱為1gy1gy。即：。即：1gy=1j/kg1gy=1j/kg。原專用單位：原專用單位：radrad（拉德）（拉德） 1rad=101rad=10-2-2j/kg=10j/kg=10-2-2gygy 即：即： 1gy=100rad1gy=100rad吸收劑量率

9、：是指單位時(shí)間內(nèi)的吸收劑量。吸收劑量率：是指單位時(shí)間內(nèi)的吸收劑量。單位：?jiǎn)挝唬篻y/hgy/h gygy/min /min gy/sgy/srad/hrad/h radrad/min /min rad/srad/s 3 3、電離輻射的照射方法、電離輻射的照射方法 直接對(duì)平皿上生長(zhǎng)的菌直接對(duì)平皿上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行照射。落進(jìn)行照射。 用打孔器（用打孔器（6-106-10mmmm）將菌將菌落連同基質(zhì)一同取出放于無(wú)菌落連同基質(zhì)一同取出放于無(wú)菌平皿內(nèi)照射。平皿內(nèi)照射。 制成菌懸液，取制成菌懸液，取1-21-2mlml置于試管內(nèi)并浸入冰水中置于試管內(nèi)并浸入冰水中進(jìn)行短時(shí)間照射。進(jìn)行短時(shí)間照射?？熘凶樱褐滤缆?/p>

10、為快中子：致死率為5085比較合適，采用劑比較合適，采用劑量約為量約為1530k rad。有利于正突變的產(chǎn)生。有利于正突變的產(chǎn)生。x射線、射線、射線：殺菌率射線：殺菌率9099.9為宜。照為宜。照射劑量為射劑量為1萬(wàn)萬(wàn)20萬(wàn)萬(wàn)r。四、近年來(lái)發(fā)展的新型誘變劑四、近年來(lái)發(fā)展的新型誘變劑1.1.微波：電磁波，分熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。輻射中采用分散微波：電磁波，分熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。輻射中采用分散低溫干燥法消除微波熱效應(yīng)的影響。低溫干燥法消除微波熱效應(yīng)的影響。2.2.紅外射線：紅外射線：光譜的波長(zhǎng)范圍大于可見光小于無(wú)線電波的電光譜的波長(zhǎng)范圍大于可見光小于無(wú)線電波的電磁輻射區(qū)域的光波。磁輻射區(qū)域的光波。3.3

11、.激光：是二十世紀(jì)六十年代發(fā)展起來(lái)的一種新光源。激光：是二十世紀(jì)六十年代發(fā)展起來(lái)的一種新光源。可通過(guò)產(chǎn)生閃、熱、壓力和電磁場(chǎng)效應(yīng)的綜合作用，直可通過(guò)產(chǎn)生閃、熱、壓力和電磁場(chǎng)效應(yīng)的綜合作用，直接或間接地影響生物活性。常見的是接或間接地影響生物活性。常見的是he-he-nene激光。激光。4.4.高能電子流：是較強(qiáng)的電離輻射。高能電子流：是較強(qiáng)的電離輻射。5.5.離子注入：是二十世紀(jì)八十年代興起的一種新技術(shù)。利離子注入：是二十世紀(jì)八十年代興起的一種新技術(shù)。利用離子注入生物體引起遺傳物質(zhì)的改變，導(dǎo)致性狀的變異，用離子注入生物體引起遺傳物質(zhì)的改變，導(dǎo)致性狀的變異，從而達(dá)到育種的目的。突變率高。從而達(dá)到

12、育種的目的。突變率高。6. 6. 航天育種：航天育種： 利用太空微重力、高能粒子、高真空、利用太空微重力、高能粒子、高真空、缺氧和交變磁場(chǎng)等缺氧和交變磁場(chǎng)等綜合物理誘變因子綜合物理誘變因子進(jìn)進(jìn)行誘變和選擇育種研究。行誘變和選擇育種研究。第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑：化學(xué)誘變劑：凡是能改變凡是能改變dnadna結(jié)構(gòu)，并引起生物遺傳變異的結(jié)構(gòu)，并引起生物遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)?；瘜W(xué)物質(zhì)。種類：種類：很多，在育種中常用的誘變劑包括四大類：堿基類很多，在育種中常用的誘變劑包括四大類：堿基類似物、烷化劑、移碼誘變劑、其它。似物、烷化劑、移碼誘變劑、其它。特點(diǎn)：特點(diǎn)：1.1.作用機(jī)制：都是與作用機(jī)制：都

13、是與dnadna起化學(xué)反應(yīng)，誘變效應(yīng)與其理化性起化學(xué)反應(yīng)，誘變效應(yīng)與其理化性質(zhì)有關(guān)。質(zhì)有關(guān)。2.2.作用具專一性。作用具專一性。3.3.誘變劑量取決于濃度和處理時(shí)間。誘變劑量取決于濃度和處理時(shí)間。4.4.絕大多數(shù)化學(xué)誘變劑都具有毒性，其中絕大多數(shù)化學(xué)誘變劑都具有毒性，其中9090以上是致癌物以上是致癌物質(zhì)或極毒物質(zhì)。質(zhì)或極毒物質(zhì)。一、堿基類似物一、堿基類似物定義：指一類和天然堿基分子結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，既能誘定義：指一類和天然堿基分子結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，既能誘發(fā)正向突變，也能誘發(fā)回復(fù)突變的誘變劑。發(fā)正向突變，也能誘發(fā)回復(fù)突變的誘變劑。摻入誘變劑摻入誘變劑類別：類別：胸腺嘧啶類似物：胸腺嘧啶類似物： 5

14、-fu; 5-iu 5-fu; 5-iu腺嘌呤類似物：腺嘌呤類似物：2-2-ap; 6-mp ap; 6-mp 1.誘變機(jī)制：誘變機(jī)制：2.堿基類似物的誘變處理方法堿基類似物的誘變處理方法2.1單獨(dú)處理單獨(dú)處理2.2 與輻射線復(fù)合處理與輻射線復(fù)合處理接種接種培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期離心離心饑餓培養(yǎng)饑餓培養(yǎng)8-10h 加入加入5-bru，混勻混勻(終濃度：終濃度：25-40ug/ml)平板涂布培養(yǎng)平板涂布培養(yǎng)使之誘變使之誘變挑單菌落挑單菌落篩選篩選二、烷化劑二、烷化劑1.定義：定義：生物學(xué)上的烷化劑是指在正常的生理?xiàng)l件下，生物學(xué)上的烷化劑是指在正常的生理?xiàng)l件下，能將其烷基轉(zhuǎn)移給重要的生物大分子的

15、一類化合物。能將其烷基轉(zhuǎn)移給重要的生物大分子的一類化合物。最早發(fā)現(xiàn)的烷化劑是最早發(fā)現(xiàn)的烷化劑是氮芥子氣氮芥子氣。2.烷化劑的種類：烷化劑的種類：根據(jù)分子中烷基的數(shù)目多寡，可將烷根據(jù)分子中烷基的數(shù)目多寡，可將烷化劑分為化劑分為單功能和雙功能單功能和雙功能的烷化劑兩大類。的烷化劑兩大類。已知廣泛應(yīng)用的有乙基璜酸乙脂已知廣泛應(yīng)用的有乙基璜酸乙脂(ees)、甲基璜酸乙脂甲基璜酸乙脂(ems)、硫酸二乙脂硫酸二乙脂(des)、亞硝基胍亞硝基胍(ntg)，等。它們等。它們有著良好的誘變效應(yīng)。有著良好的誘變效應(yīng)。3. 烷化劑的作用機(jī)制烷化劑的作用機(jī)制烷化劑主要是通過(guò)烷化基烷化劑主要是通過(guò)烷化基團(tuán)團(tuán)使使dna

16、分子上的堿基分子上的堿基及磷酸部分被烷化及磷酸部分被烷化，dna復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變。對(duì)錯(cuò)誤而引起突變。堿基中容易發(fā)生烷化的位堿基中容易發(fā)生烷化的位點(diǎn)。點(diǎn)。g-n7、g-o6、t-o4。3.1作用位點(diǎn)作用位點(diǎn)（1）對(duì)堿基的烷化作用）對(duì)堿基的烷化作用3.2 作用方式作用方式（2）引起）引起dna雙鏈間的交聯(lián)雙鏈間的交聯(lián)4. 烷化劑的性質(zhì)烷化劑的性質(zhì)烷化劑的性質(zhì)比較活潑，在水溶液中容易發(fā)生水解。它們烷化劑的性質(zhì)比較活潑，在水溶液中容易發(fā)生水解。它們大部分半衰期很短（與溫度、溶液大部分半衰期很短（與溫度、溶液ph關(guān)系很大）。關(guān)系很大）。烷化劑殺菌率低而誘變效應(yīng)高；烷化劑殺

17、菌率低而誘變效應(yīng)高；極毒！極毒！能致癌。能致癌。操作中應(yīng)有防護(hù)措施，且操作中應(yīng)有防護(hù)措施，且小心謹(jǐn)慎！避免接觸身體及小心謹(jǐn)慎！避免接觸身體及污染環(huán)境。污染環(huán)境。5.幾種常用烷化劑幾種常用烷化劑5.1 亞硝基胍（全稱：亞硝基胍（全稱：1-甲基甲基-3硝基硝基-1-亞硝基胍亞硝基胍 ntg）性質(zhì)：性質(zhì)： 黃色結(jié)晶，不溶于水，見光易分解。黃色結(jié)晶，不溶于水，見光易分解。有有超誘變劑超誘變劑之稱。能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突之稱。能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變。還能使多基因并發(fā)突變。變。還能使多基因并發(fā)突變。誘變適合誘變適合ph值為值為6.0。誘變處理方法：誘變處理方法：菌體用緩沖液洗下制成菌體用緩沖液洗下制

18、成菌懸液菌懸液，離心，洗滌（濃度，離心，洗滌（濃度106107ml-1）配制配制ntg母液母液：配成：配成1mg/ml（比例：比例：ntg丙酮溶液丙酮溶液1ml: 緩沖液緩沖液9ml）。使用時(shí)取母液。使用時(shí)取母液0.2ml，加菌懸液加菌懸液1.8ml。誘變處理：參考菌種和終濃度要求，將誘變處理：參考菌種和終濃度要求，將ntg加入菌懸液，加入菌懸液，保溫保溫一定時(shí)間（細(xì)菌一定時(shí)間（細(xì)菌2060min）。終止反應(yīng)：用冷生理鹽水終止反應(yīng)：用冷生理鹽水稀釋稀釋50倍倍以上。以上。后處理：低溫后處理：低溫離心洗滌離心洗滌除去藥液，加無(wú)菌水懸浮并做成除去藥液，加無(wú)菌水懸浮并做成一定稀釋度一定稀釋度分離于平

19、皿分離于平皿?；?。或按一定濃度加后培養(yǎng)基于菌體按一定濃度加后培養(yǎng)基于菌體沉淀物中，振蕩培養(yǎng)沉淀物中，振蕩培養(yǎng)1.52h再稀釋分離。再稀釋分離。凡接觸凡接觸ntg的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處理。的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處理。5.2 甲基璜酸乙脂（又稱乙基硫酸甲烷甲基璜酸乙脂（又稱乙基硫酸甲烷 ems）性質(zhì)：無(wú)色液體難溶于水，不穩(wěn)定，易水解揮發(fā)。性質(zhì)：無(wú)色液體難溶于水，不穩(wěn)定，易水解揮發(fā)。 最佳誘變最佳誘變ph:7.07.4誘變處理方法誘變處理方法: 配制配制 0.5mol/l ems母液：預(yù)冷所需器皿，取母液：預(yù)冷所需器皿，取10mol/l ems原液原液0.5ml 加入加入9.5ml ph 7.2 的磷

20、酸緩沖液中，加蓋封口。的磷酸緩沖液中，加蓋封口。 制備菌懸液：培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)期，離心洗滌，用緩沖液制制備菌懸液：培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)期，離心洗滌，用緩沖液制成成 8ml 菌懸液（菌懸液（107108ml-1；孢子為；孢子為106107ml-1）。）。 誘變：取誘變：取ems母液母液 2ml 加入以上加入以上 8ml 菌懸液中（終濃度菌懸液中（終濃度為為 0.1 mol/l ；孢子為；孢子為 0.20.5 mol/l），），處理一定時(shí)間（根處理一定時(shí)間（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定）。據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定）。終止反應(yīng)：終止反應(yīng)：用用 50 倍生理鹽水稀釋或加入倍生理鹽水稀釋或加入2na2s2o3 ，多次，多次離心洗

21、滌。離心洗滌。5.3 硫酸二乙脂硫酸二乙脂 （des）性質(zhì)：無(wú)色液體，不溶于水，很不穩(wěn)定。最佳誘變性質(zhì)：無(wú)色液體，不溶于水，很不穩(wěn)定。最佳誘變 ph 7.2誘變處理方法：誘變處理方法： 2母液配制：取母液配制：取des原液原液 0.4ml 于滅菌試管中，加入少于滅菌試管中，加入少許乙醇使溶解，再加入許乙醇使溶解，再加入 ph 7.2磷酸緩沖液磷酸緩沖液 19.6 ml 。 菌懸液制備：用同一緩沖液將菌體洗下。菌懸液制備：用同一緩沖液將菌體洗下。 誘變處理：取以上誘變處理：取以上des溶液和菌懸液等量混合一定溫度溶液和菌懸液等量混合一定溫度下，振蕩培養(yǎng)下，振蕩培養(yǎng)2060min。 終止反應(yīng)：終止

22、反應(yīng)：加入生理鹽水稀釋，或加入加入生理鹽水稀釋，或加入2 na2s2o3 0.5ml終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。 后處理：將后處理：將 20ml 肉湯培養(yǎng)基加入菌體沉淀物中，培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基加入菌體沉淀物中，培養(yǎng)1.52h，然后稀釋分離。然后稀釋分離。 三、脫氨劑（亞硝酸）三、脫氨劑（亞硝酸）1.誘變機(jī)制：誘變機(jī)制：亞硝酸可直接作用于正在復(fù)制或未復(fù)制的亞硝酸可直接作用于正在復(fù)制或未復(fù)制的 dna 分子，分子，氧化堿基中的氨基成酮基氧化堿基中的氨基成酮基，引起轉(zhuǎn)換。還可引起，引起轉(zhuǎn)換。還可引起 dna 雙鏈間的交聯(lián)。雙鏈間的交聯(lián)。2.誘變處理方法：誘變處理方法： 試劑配制：試劑配制： 處理過(guò)程：處理過(guò)程： 終止反應(yīng)：終止反應(yīng)： 后處理：后處理：四、移碼誘變劑四、移碼誘變劑1. 誘變機(jī)制：誘變機(jī)制：與與dna結(jié)合引起堿基增加或缺失而造成突結(jié)合引起堿基增加或缺失而造成突變。變。主要包括吖啶黃、吖啶橙、原黃素（主要包括吖啶黃、吖啶橙、原黃素（2 , 8 二氨基二氨基吖