常用核酸提取技術(shù)介紹

1、常用核酸提取技術(shù)介紹 核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。前前 言言核酸的存在形式u核酸包括dna、rna兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在；u真核生物的染色體dna為雙鏈線性分子；u原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器dna為雙鏈環(huán)狀分子；u有些噬菌體dna有時(shí)為單鏈環(huán)狀分子；u病毒的dna、rna分子，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。 利用dna、rna、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異提取dna、

2、rna，去除其他成分。核酸提取的基本思路 提取純化核酸總的原則： 應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染。核酸提取的原則核酸提取應(yīng)達(dá)到的要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。核酸提取應(yīng)注意的問題： 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。 減少化學(xué)因素對核酸的降解。 減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解。i. i.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備ii.ii.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放iii.iii.核酸分離、純化核酸分離、純化iv.iv.沉淀或吸附核酸，并去除雜

3、質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) v.v.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中細(xì)胞裂解方式分類：濃鹽法：有機(jī)溶劑抽提法：密度梯度離心法：利用rna和dna在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物常見樣本提取方法總結(jié)：吸附材料結(jié)合法：硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠高鹽低ph值結(jié)合核酸，低鹽高ph值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高ph值結(jié)合核酸，高鹽低ph值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。1、濃縮煮沸裂解法：（以hbv為例）50ul濃縮液+50ul血清12000r

4、pm 10min 棄上清加入20-50uldna裂解液吹打混勻 100 10min 12000rpm 5min 取上清加樣濃縮液主要成分：聚乙二醇（ peg） 、nacl裂解液主要成分：tris-hcl、edta 、 nacl、sds聚乙二醇（ peg） hoch2(ch2och2)nch2oh,n4 peg為有機(jī)聚合物，無毒，親水性強(qiáng)，相對分子量為6k-20k；peg的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān)，同時(shí)還受離子強(qiáng)度、溶液ph值和溫度等因素的影響，采用該方法可將病毒量濃縮10倍以上。裂解液裂解原理：tris-hcl （ph8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；edta螯合mg2+

5、或mn2+離子，抑制dnase活性；nacl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使dna充分溶解，存在于液相中；sds是一種陰離子去垢劑，在高溫（55100）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 特點(diǎn)：操作相對簡單，成本低，但抗干擾能力差，不利于自動化操作。 原理：標(biāo)本經(jīng)裂解消化后，釋放出核酸，核酸與磁珠結(jié)合(特異性的和非特異性的)利用磁珠分離儀器將核酸提取純化，作為pcr反應(yīng)的模板。 磁珠其內(nèi)核為氧化鐵，直徑0.5-50um不等，一般廣泛應(yīng)用于dna、rna純化的磁珠為硅質(zhì)膜磁珠。磁珠在高鹽條件下與核酸結(jié)合，而在低鹽環(huán)境下被洗脫，可用于全血、組織、細(xì)菌、病毒、植物的核酸純化。2、磁珠吸附法

6、：（以hbv為例）第一步：細(xì)胞的裂解：破碎細(xì)胞，并向溶液中加入磁珠。第二步：結(jié)合核酸：ph較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合。主要步驟：第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復(fù)多次）。第四步：核酸的洗脫：ph升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來。特點(diǎn)：特異性好，抗干擾能力強(qiáng)，易于實(shí)現(xiàn)半自動和全自動操作。 原理：采用硅膠膜吸附核酸，而對其他生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類既不相親也不吸附，因而可得到純化的核酸。3、硅膠柱吸附法：（以腫瘤標(biāo)本為例）樣品樣品化學(xué)裂解化學(xué)裂解洗脫洗脫洗滌洗滌主要步驟：注意事項(xiàng)： 二甲苯有毒且對后續(xù)試驗(yàn)有影響，一定

7、要用乙醇洗干凈。 乙醇揮發(fā)時(shí)間一定不要打折扣。 加熱時(shí)要將樣品封好口，以免過熱時(shí)管子蓋崩開進(jìn)水。核酸提取的質(zhì)量控制 dna或rna鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時(shí)，dna或rna的光密度od260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。當(dāng)dna樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會影響dna吸光度的準(zhǔn)確測定。一般情況下同時(shí)檢測同一樣品的od260、od280和od230，計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。純雙鏈純雙鏈dna：od260/od2801.8(1.9,表明有表明有rna污染；污染；1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染），表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）純純r(jià)na：1.7 od260/od2802.0（1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0時(shí)表明可能有異硫時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）氰酸殘存）核酸樣品的保存： 核酸保存的主要