病毒與細(xì)胞間的相互作用

1、第四章第四章 病毒與細(xì)胞間的相互作用病毒與細(xì)胞間的相互作用第一節(jié)第一節(jié) 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)第二節(jié)第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用病毒與細(xì)胞的相互作用第一節(jié)第一節(jié) 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)病毒的細(xì)胞培養(yǎng) 病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏感動(dòng)物（感動(dòng)物（動(dòng)物接種動(dòng)物接種）、雞胚（）、雞胚（雞胚接種雞胚接種）或）或離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)）。）。一、動(dòng)物接種一、動(dòng)物接種接種后通常以動(dòng)物發(fā)病、死亡作為感染的指標(biāo)。接種后通常以動(dòng)物發(fā)病、死亡作為感染的指標(biāo)。按病毒

2、侵襲部位不同選擇適當(dāng)按病毒侵襲部位不同選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑。嗜神經(jīng)病毒接種的接種途徑。嗜神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜。純皰疹病毒接種于家兔角膜。動(dòng)物接種的優(yōu)缺點(diǎn)：動(dòng)物接種的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備；不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備； （2）技術(shù)簡(jiǎn)單；）技術(shù)簡(jiǎn)單； （3）易成功）易成功缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：（1）個(gè)體差異大）個(gè)體差異大 （2）價(jià)格昂貴）價(jià)格昂貴 （3）數(shù)量有限）數(shù)量有限 （4）需要隔離畜舍）需要隔離畜舍二、雞胚接種二、雞胚接種一種比較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法。一種比較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法。卵殼卵殼殼膜殼膜雞胚接種的優(yōu)缺點(diǎn)：雞胚接種的優(yōu)缺點(diǎn)

3、：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡(jiǎn)單、來(lái)源充沛、價(jià)格低廉、數(shù)量可大，技術(shù)簡(jiǎn)單、來(lái)源充沛、價(jià)格低廉、數(shù)量可大， 不需特殊設(shè)備不需特殊設(shè)備 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動(dòng)物的病毒。很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動(dòng)物的病毒。 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至24個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。液進(jìn)行培養(yǎng)。 三、細(xì)胞培養(yǎng)三、細(xì)胞培養(yǎng)n每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對(duì)病毒易感性相每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對(duì)病毒易感性相等等n無(wú)個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好無(wú)個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好n

4、可嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作可嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作n細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長(zhǎng)特征細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長(zhǎng)特征n應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、染色體特征及傳代次數(shù)，可分為三種類(lèi)型：根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、染色體特征及傳代次數(shù)，可分為三種類(lèi)型：n原代細(xì)胞：原代細(xì)胞：動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理，使細(xì)胞分散動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理，使細(xì)胞分散而得到的細(xì)胞。而得到的細(xì)胞。n二倍體細(xì)胞：二倍體細(xì)胞：將長(zhǎng)成單層的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)將長(zhǎng)成單層的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，保持其胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣

5、，保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱(chēng)為二倍體細(xì)胞。二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱(chēng)為二倍體細(xì)胞。n傳代細(xì)胞：傳代細(xì)胞：能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞，大多數(shù)由癌能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成。細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成。（一）細(xì)胞的類(lèi)型（一）細(xì)胞的類(lèi)型（二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法（二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法靜置培養(yǎng)：靜置培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)室常用。細(xì)胞懸液裝瓶，實(shí)驗(yàn)室常用。細(xì)胞懸液裝瓶，5%co2溫箱靜置培養(yǎng)，細(xì)胞沉降并貼附在玻面溫箱靜置培養(yǎng)，細(xì)胞沉降并貼附在玻面上生長(zhǎng)分裂，最后長(zhǎng)成單層。上生長(zhǎng)分裂，最后長(zhǎng)成單層。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。細(xì)胞在玻瓶?jī)?nèi)生大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。細(xì)胞在玻瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)時(shí)，玻瓶不

6、斷緩慢旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞貼附于玻瓶四周，長(zhǎng)時(shí)，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞貼附于玻瓶四周，長(zhǎng)成單層。長(zhǎng)成單層。第二節(jié)第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用病毒與細(xì)胞的相互作用n殺細(xì)胞感染殺細(xì)胞感染n非殺細(xì)胞感染非殺細(xì)胞感染 引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞代謝無(wú)影響。引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞代謝無(wú)影響。n產(chǎn)生干擾素產(chǎn)生干擾素 由病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。由病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。cpecpe能在光學(xué)顯微鏡下觀察。能在光學(xué)顯微鏡下觀察。細(xì)胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；細(xì)胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；細(xì)胞聚合，如腺病毒；細(xì)胞聚合，如腺病毒；細(xì)胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；細(xì)胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；有些病毒能形

7、成包涵體有些病毒能形成包涵體。 一、病毒引致的殺細(xì)胞變化一、病毒引致的殺細(xì)胞變化（一）細(xì)胞病變效應(yīng)（一）細(xì)胞病變效應(yīng)( (cytopathic effect,cytopathic effect,cpecpe) )正常細(xì)胞正常細(xì)胞cpecpe觀察觀察正常單層正常單層a72a72細(xì)胞細(xì)胞接種接種ccvccv后出現(xiàn)細(xì)胞拉網(wǎng)后出現(xiàn)細(xì)胞拉網(wǎng)的的單層的的單層a72a72細(xì)胞細(xì)胞cpe觀察觀察cpe觀察正常單層正常單層a72a72細(xì)胞細(xì)胞接種犬冠狀病毒（接種犬冠狀病毒（ccvccv）后形后形成合胞體的的單層成合胞體的的單層a72a72細(xì)胞細(xì)胞合胞體（合胞體（syncytia）是病毒感染后導(dǎo)致感染細(xì)胞及相鄰細(xì)

8、胞細(xì)胞膜是病毒感染后導(dǎo)致感染細(xì)胞及相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜融合的產(chǎn)物，表現(xiàn)為若干細(xì)胞的相鄰細(xì)胞膜消失，成為多核巨細(xì)胞。融合的產(chǎn)物，表現(xiàn)為若干細(xì)胞的相鄰細(xì)胞膜消失，成為多核巨細(xì)胞。 能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條件下發(fā)生細(xì)能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條件下發(fā)生細(xì)胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力。50%50%組織細(xì)胞感染量（組織細(xì)胞感染量（tcidtcid5050）（二）空斑試驗(yàn)（二）空斑試驗(yàn)將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化的瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性的瓊脂。病

9、毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見(jiàn)，此病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見(jiàn)，此即即空斑試驗(yàn)空斑試驗(yàn)?？瞻呤怯梢粋€(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類(lèi)似于細(xì)菌的菌落，空斑是由一個(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類(lèi)似于細(xì)菌的菌落，稱(chēng)為稱(chēng)為空斑形成單位（空斑形成單位（pfu）。病毒懸液中的感染性病毒量以每病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升含有的毫升含有的pfu來(lái)表示。來(lái)表示。 cells空斑試驗(yàn)的用途：空斑試驗(yàn)的用途：1. 測(cè)定病毒數(shù)量測(cè)定病毒數(shù)量2. 純化病毒純化病毒 單個(gè)空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，單個(gè)空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，可獲得病毒克隆。可獲得病毒克隆。3. 鑒定病毒鑒定病毒

10、 不同病毒的空斑具有不同的特征。不同病毒的空斑具有不同的特征。（三）包涵體（三）包涵體（inclusion body)定義：定義：是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)胞漿或形態(tài)變化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為包涵體。稱(chēng)為包涵體。包涵體的性質(zhì)包涵體的性質(zhì)n病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的negri氏體氏體n大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒大量晶格樣排列

11、的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體的包涵體n細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體包涵體狂犬病毒包涵體（狂犬病毒包涵體（negri body）定義：定義：由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。 種類(lèi)：種類(lèi)：、干擾素。干擾素。抗病毒作用：抗病毒作用：干擾素不直接作用于病毒，而是作用于干擾素不直接作用于病毒，而是作用于鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降解病毒解病毒mrna、抑制蛋白合成。、抑制蛋白合成。干擾素作用具有宿主特異性，而無(wú)病毒特異性。干擾素作用具有宿主特異性，而無(wú)病毒特