細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度的調(diào)控(修改版、劉漫)

1、 細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度調(diào)控應(yīng)化應(yīng)化10031003班班劉漫劉漫 莊原李開成莊原李開成 楊杰楊杰 細(xì)胞內(nèi)銅離子作用對(duì)生命而言, 銅是一種必須的微量元素, 它以輔基的形式參與細(xì)胞內(nèi)多種重要的代謝途徑。 1）賴氨酸氧化酶參與結(jié)締組織的形成和膠原交聯(lián) 2）超氧化物歧化酶清除胞內(nèi)自由基 3）細(xì)胞色素氧化酶是呼吸鏈電子傳送蛋白 4）酪氨酸酶參與色素形成途徑 5）多巴胺羥化酶則與神經(jīng)傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度過低會(huì)影響這些酶的活性及相應(yīng)的生理代謝途徑, 影響細(xì)胞的生存。但細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度超過生理需求也會(huì)引起嚴(yán)重的問題。人體銅離子代謝示意圖細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度控制雖然細(xì)胞內(nèi)總的銅離子濃度很高，通常在10-5一10-4mol

2、/L范圍內(nèi)，但是游離銅離子濃度通常小于10-18mol/L，即一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含一個(gè)游離銅離子。生理性銅離子濃度的維持主要在于四個(gè)環(huán)節(jié): 銅離子進(jìn)入胞內(nèi)(uptake) 胞內(nèi)運(yùn)送(translocation) 合成金屬蛋白(synthesis) 清除過多銅離子(elimination)。對(duì)于過高或過低的銅離子濃度, 細(xì)胞主要是通過改變流入量(influx)和流出量(efflux)來應(yīng)答。另外, 金屬硫蛋白可與過多銅離子結(jié)合,避免其破壞作用, 這種保護(hù)方式叫隔離(sequestration)。細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度的傳遞過程銅離子的攝取(uptake) 細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白只對(duì)Cu+具有識(shí)別特異性，所以Cu

3、2+不能被直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，必須在質(zhì)膜上FRE1/2(Fe3+/Cu2+還原酶：Ferric ion Reductase Enzyme)還原成Cu+后進(jìn)入細(xì)胞。CuCu2+2+CuCu+ +FeFe3+3+/Cu/Cu2+2+還原酶還原酶銅離子的攝取(uptake) 1 1）高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體）高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體系系(High(High一一affinity affinity systems)systems) Cu+被跨膜蛋白一一CTR(copper transporter protein)轉(zhuǎn)運(yùn)，該蛋白由ctr基因編碼，具有銅離子高親和性和特異性，轉(zhuǎn)運(yùn)過程消耗能量。Cu+經(jīng)ctr的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴Cu+一2K+對(duì)向

4、運(yùn)輸機(jī)制，即每轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)Cu+，需要運(yùn)出兩個(gè)K+。CTR1/3Cu+2K+Cu+2K+CTR基因1、ctr1(Copper transporter1) ctr1基因首先在酵母轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子體系缺陷型菌株中被發(fā)現(xiàn)。ctr1基因的表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)Cu+有效濃度的影響，高濃度Cu+抑制ctr1基因的表達(dá)，低濃度促進(jìn)ctr1的表達(dá)。ctr1是一個(gè)三次跨膜的蛋白質(zhì)，含有406個(gè)氨基酸，N端的128個(gè)氨基酸富含甲硫氨酸、絲氨酸、組氨酸殘基，可以結(jié)合多個(gè)銅離子，還含有3個(gè)19個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的重復(fù)序列和n個(gè)M一X一X一M(X指任意氨基酸)基序(motif)的重復(fù)序列，但其具體作用不詳，可能與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。N端位于細(xì)胞膜外，可

5、能用于清除未被攝取的Cu+。CTR1以多聚復(fù)合物(multimericcoplexes)的形式發(fā)揮功能。CTR基因ctr1基因高濃度Cu+低濃度Cu+ctr1蛋白質(zhì)ctr1基因ctr1蛋白質(zhì)抑制促進(jìn)表達(dá)表達(dá)結(jié)合多個(gè)銅離子結(jié)合多個(gè)銅離子Cu+濃度Cu+濃度CTR基因2、ctr3(Copper transporter3)ctr3是一個(gè)三次跨膜的蛋白質(zhì)，含有241個(gè)氨基酸，與ctr1的序列有較高的相似性。ctr3分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上，與ctr1是兩個(gè)獨(dú)立的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系，但在某些特殊的情況下如細(xì)胞內(nèi)Cu+濃度極低時(shí)，它們可以協(xié)同作用共同轉(zhuǎn)運(yùn)以提高細(xì)胞內(nèi)可利用的Cu+濃度。3、其他基因ctr1、c

6、tr3都是在酵母菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，后來在植物和動(dòng)物的CDNA文庫內(nèi)也發(fā)現(xiàn)具有類似序列的Cu+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如擬南芥的COPT1（Copper transporte1)和人類Hela細(xì)胞的hctr1(Human conpper transporter1)。其中COPT1與CTR1蛋白的核昔酸序列相似性是49%。COPT1含169個(gè)氨基酸，hctr1含190個(gè)氨基酸，都具有類似ctr1的三個(gè)跨膜區(qū)，N端富含甲硫氨酸和絲氨酸。大鼠和小鼠體內(nèi)也有類似的蛋白質(zhì)序列，它們可能是負(fù)責(zé)Cu+轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)家族。2、低親和力的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系 酵母cDNA文庫中的ctr2(Copper transporter2)蛋白與擬南芥

7、的COPT1具有 相似的序列，可能是低親和力的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系的成員。ctr2含有三個(gè)跨膜區(qū)，與ctr1/ctr3不同的是其N端組氨酸、甲硫氨酸的含量低，因此不能結(jié)合大量的Cu+。在代謝過程中，ctr2對(duì)Cu+轉(zhuǎn)運(yùn)貢獻(xiàn)不大，但它的存在卻有利于Cu在細(xì)胞內(nèi)的積累或區(qū)室化，同時(shí)可以使細(xì)胞對(duì)Cu的超載(overload)和毒性更敏感，ctr2基因突變的菌株對(duì)毒性有高抗性。銅離子的攝取(uptake)胞內(nèi)運(yùn)送(translocation) Cu+進(jìn)入細(xì)胞以后，迅速與細(xì)胞內(nèi)的銅離子結(jié)合蛋白如ATX1(anti-oxidant1)、COX17(Cytochrome oxidase17copper chape

8、rone)等蛋白質(zhì)相結(jié)合，傳遞到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的靶蛋白如SOD、 CCC2(Copper chaperone for ceruloplasmin-like oxidase2)。象ATX1、COX17等細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)叫分子伴侶(Chaperones)，參與細(xì)胞內(nèi)的Cu+轉(zhuǎn)運(yùn)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)由分子伴侶介導(dǎo)的Cu+轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要有三種: 1)ATX1、HAH1與CCC2 2)COX17、hCOX17與SCO1 3)LYS7、CCS與SOD1)ATX1、HAH1與CCC2 ATX1存在于酵母細(xì)胞內(nèi)，含73個(gè)氨基酸，一個(gè)MTCXXC的基序可以結(jié)合Cu+。在結(jié)合Cu+前后，ATX1表面的半膚氨酸含量變化很大

9、，蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化可能更加有利于Cu+的結(jié)合和釋放。ATX1將Cu+傳遞給CCC2，進(jìn)而傳遞給鐵離子攝入系統(tǒng)(Ironuptakesystems)如FET3/FET5(Fe transporter3/5)，參與鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，并影響胚胎神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)銅離子鰲合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的分化和發(fā)育。 CCC2是P型ATPase家族成員(P-type ATPase)，定位于高爾基體上，N端有MTCXXC基序，兩個(gè)半膚氨酸非常保守，可能與Cu+的結(jié)合有關(guān)。人類Menkes(MNK)和Wiison(wD)疾病蛋白與CCC2同源，N端有該基序的六個(gè)拷貝，MNK參與人類肝細(xì)胞中Cu+的傳遞，WD負(fù)責(zé)其它

10、組織如腸粘膜的Cu+輸出。ATX1傳遞Cu+的可能機(jī)理:ATX1的兩個(gè)半膚氨酸疏基結(jié)合細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域化的Cu+，然后與脫輔基的CCC2(apo一CCC2)作用，ATP水解供能，形成一系列含有ATXI一Cu一CCCZ的中間物，最后形成脫輔基的ATX1(apo-ATx1)和攜帶Cu+的CCC2。隨后ATP水解，CCC2一Cu+構(gòu)象改變，Cu+被釋放入囊泡，插入靶蛋白FET3/FET5內(nèi)。ATX1的65位賴氨酸是其活性位點(diǎn)，在Cu+捕獲和釋放中起重要作用。在該反應(yīng)中，ATX1可能作為一種酶，降低Cu+在蛋白質(zhì)之間轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力能障，使反應(yīng)更易進(jìn)行。 FET3/FET5是一次跨細(xì)胞器膜的轉(zhuǎn)鐵蛋白，屬于多銅氧

11、化酶家族(multicopper oxidases)成員，與Cu+具有高親和性，氧化區(qū)位于細(xì)胞器膜外。底物是O2和Fe2+，4個(gè)Fe2+被氧化成4個(gè)Fe3+，4個(gè)電子傳給O2，形成H2O。 人類與ATX1同源的蛋白質(zhì)是HAH1(Human anti一oxidant 1 homologue1)，二者氨基酸序列的相似性為47%。HAH1是穩(wěn)定的單鏈蛋白質(zhì)，含有68個(gè)氨基酸，形成2個(gè)螺旋和2個(gè)折疊，一個(gè)MXCXXC的金屬離子結(jié)合序列。HAH1存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，分布和穩(wěn)定性不受細(xì)胞內(nèi)的Cu+濃度的影響。兩個(gè)HAH1單體與銅離子形成的HAH1同源二聚體發(fā)揮其功能。HAH1利用ATP水解提供的能量，

12、與其它蛋白質(zhì)相互作用將Cu+傳遞給類似CCCZ的P型ATPase家族成員，如位于高爾基體成熟面的WD和MNK蛋白。雖然HAH1與ATX1本身無抗氧化特性，但它們可以將Cu+傳給具有抗氧化作用的蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用。1)ATX1、HAH1與CCC2ATX1Cu-ATX1構(gòu)象變化Cu-CCC2鐵離子攝入系統(tǒng)（FET3/FET5）鐵的運(yùn)輸響胚胎神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)銅離子鰲合蛋白質(zhì) COX17是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)，分子量8KD，含有69個(gè)氨基酸，7個(gè)半胱氨酸，其中6個(gè)在進(jìn)化中十分保守，3個(gè)功能必需殘基包含在CCXC基序中。C端有線粒體的靶序列，使COX17暫時(shí)停泊在線粒體上，便于Cu+進(jìn)入線粒體的膜

13、間隙，進(jìn)而經(jīng)SCO1(synthesis of cytochrome c oxidase1)傳給細(xì)胞色素c氧化酶。另外，細(xì)胞外高濃度的Cu+也可以通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入線粒體，以彌補(bǔ)COX17基因突變?cè)斐傻木€粒體內(nèi)Cu+濃度的降低。COX17不穩(wěn)定，易被降解。2)COX17、hCOX17與SCO1SCO1是線粒體膜上的蛋白質(zhì)，CXXXC序列與Cu+結(jié)合，并將其傳給細(xì)胞色素c氧化酶。細(xì)胞色素c氧化酶是位于呼吸鏈末端的復(fù)合物，由核基因和線粒體基因共同編碼，2個(gè)血紅素A和3個(gè)銅離子可以傳遞電子。scol基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞色素c氧化酶失活，高濃度的Cu+不能使之恢復(fù)活性，這說明細(xì)胞色素c氧化酶不能直接絡(luò)合細(xì)

14、胞內(nèi)游離的Cu+，只能依靠分子伴侶遞呈Cu+。所以SCO1是一個(gè)激活細(xì)胞色素c氧化酶的必需分子。2)COX17、hCOX17與SCO1COX17Cu+Cu-SCO1細(xì)胞色素c氧化酶激活 LYS7(Lysine biosynthesis7)存在于酵母細(xì)胞內(nèi)，含249個(gè)氨基酸，有MTCXXC的Cu+結(jié)合區(qū)，它可將Cu+傳給SOD。Cu，Zn-SOD單體含151個(gè)氨基酸，兩個(gè)單體組成的同源二聚體作為細(xì)胞內(nèi)的功能形式可以絡(luò)合兩個(gè)銅離子，兩個(gè)鋅離子。它能有效地清除活性氧，保護(hù)線粒體DNA免受氧化傷害，是體內(nèi)主要的抗氧化酶類，SOD基因的缺失可以導(dǎo)致成人神經(jīng)退行性疾病一一ALS(Amyotrophic l

15、ateral sclerosis)3)LYS7、CCS與SOD LYS7Cu+ LYS7Cu+2（Cu，Zn-SOD）清除活性氧，保護(hù)線粒體DNA免受氧化 人類與LYS7同源的分子伴侶是CCS(copper chaperone for SOD)，它以同源二聚體形式特異地將Cu+傳遞給SOD。CCS的單體共有三個(gè)結(jié)構(gòu)域(domains):N端結(jié)構(gòu)域(Domain ），含有一個(gè)MTCXXC的金屬結(jié)合基序，與AIX1有較高的同源性;中間結(jié)構(gòu)域(Domain )，與它的目標(biāo)酶SOD的序列相似性為50%，但是CCS缺少催化活性部位;C端結(jié)構(gòu)域(Domainm)，大約30個(gè)氨基酸，是CCS的特異部位和功能

16、必需基團(tuán)，含有一個(gè)高度保守的CXC序列，Domainm在不同物種之間同源性很高。Domainl和Domainlll可以結(jié)合金屬離子，Domalnl負(fù)責(zé)識(shí)別和捕獲Cu+;Domainn與SOD結(jié)合成異源二聚體以固定SOD，利于離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。Domainm負(fù)責(zé)將Cu+插入脫輔基SOD(apo一SOD)的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，并將其激活。CCS與SOD單體形成的異源二聚體(CCS一SOD)較CCS、SOD的同源二聚體(CCS-CCS，SOD-SOD)構(gòu)象發(fā)生了很大變化，可能更便于Cu+的轉(zhuǎn)運(yùn)，但是具體作用機(jī)制仍不清楚。有趣的是，CCS結(jié)合Cu+，而SOD結(jié)合Cu2+了，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，Cu+是如何實(shí)現(xiàn)變價(jià)有待進(jìn)一步研究。3)LYS7、CCS與SOD銅離子濃度的其他調(diào)控方式 細(xì)胞內(nèi)其它蛋白質(zhì)如金屬硫蛋白(Metal