experiment土壤細(xì)菌的分離及純化PPT課件

1、 一 、目的要求1.通過從土壤中分離純化細(xì)菌，掌握培養(yǎng)基的制備與滅菌技術(shù)、微生物的分離純化方法和無菌操作技術(shù)。2.掌握微生物的鑒定技術(shù)第1頁/共35頁第一部分培養(yǎng)基的配制與滅菌第2頁/共35頁一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)配制培養(yǎng)基的原理，并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。 2.學(xué)習(xí)幾種常用培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌的操作方法. 3.進(jìn)一步熟練掌握高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。第3頁/共35頁二、實(shí)驗(yàn)原理（1） 培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類

2、很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因素等。不同微生物對 pH 要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的 pH 一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基的 pH 一般為中性或微堿性的 ( 嗜堿細(xì)菌和嗜酸細(xì)菌例外 ) 。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)到合適的范圍。 此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如果來不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱內(nèi)，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。 第4頁/共35頁二、實(shí)驗(yàn)原理（2） 根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基的

3、類別如下： 按成分的不同：天然培養(yǎng)基 、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基 。 按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。 按培養(yǎng)基的用途分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 、營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基 。 第5頁/共35頁二、實(shí)驗(yàn)原理（3） 目前已有各種商品化的“干燥培養(yǎng)基”成品出售。這種培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧干燥法、真空干燥法、低溫干燥法或蒸發(fā)干燥法等將培養(yǎng)基內(nèi)所含的水分去掉；或?qū)⑴囵B(yǎng)基內(nèi)的各種固形成分，經(jīng)適當(dāng)處理、充分混勻，便成干燥粉末而成。使用時只要按比例加入一定量的水，經(jīng)溶解、分裝，高壓蒸氣滅菌，即可使用。這種培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是配制省時，攜帶方便，使用簡易，質(zhì)量穩(wěn)

4、定。 第6頁/共35頁 三、實(shí)驗(yàn)器材 1.藥品及試劑：根據(jù)所要制備的培養(yǎng)基準(zhǔn)備所需試劑。 2.儀器及其它：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻棒、天平、藥匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(5.5-9.0) 、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、干燥箱、培養(yǎng)皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、pH試紙等第7頁/共35頁 四、實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)基的制備與分裝1.稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取藥品。2.熔化：在沸水浴鍋中或電爐上加熱熔化。3.調(diào)pH ：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)pH至培養(yǎng)基所需pH。4.過濾：趁熱用多層紗布過濾（根據(jù)實(shí)際情況確定是否過濾）5.分裝：將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上

5、，裝試管時，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。液體分裝裝量不超過試管的1/4，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角瓶的量不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。6.加棉塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層牛皮紙。試管應(yīng)先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。第8頁/共35頁四、實(shí)驗(yàn)步驟無菌水的制備1.用量筒量取90ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。2.用10ml吸管取9ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。第9頁/共35頁四、實(shí)驗(yàn)步驟器

6、皿的準(zhǔn)備1.培養(yǎng)皿的包裝：每10套一包，用舊報紙或牛皮紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴(yán)）。2.吸管的包裝：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打結(jié)。3.玻璃涂布棒的包裝：方法同吸管的包裝。4.槍尖的包裝：放入槍尖盒，牛皮紙包裝。第10頁/共35頁四、實(shí)驗(yàn)步驟高壓滅菌1.將所要滅菌物品放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，根據(jù)需要設(shè)定滅菌溫度和時間（一般121，20min滅菌，若培養(yǎng)基中含有葡萄糖等成分時，113 ，30min滅菌）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。2.滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。培養(yǎng)基冷至50左右，倒平板。3.將滅菌

7、的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448h，以檢查滅菌是否徹底。第11頁/共35頁五、思考題 1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無菌的？ 2.加壓蒸汽滅菌的原理是什么？是否只要壓力表上的指針指到所需的壓力時就能達(dá)到所需滅菌溫度？為什么？第12頁/共35頁第二部分微生物的分離與純化第13頁/共35頁一、目的要求1.通過從土壤中分離純化細(xì)菌，掌握微生物的分離純化方法和無菌操作技術(shù)。2.初步掌握微生物的菌種保藏技術(shù)。第14頁/共35頁 二、實(shí)驗(yàn)原理（1）1.自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有

8、某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。2.土壤是微生物生活的大本營，可以從中分離到很多有價值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用平板劃線分離法。第15頁/共35頁三、實(shí)驗(yàn)器材1.土樣2.培養(yǎng)基3.無菌的培養(yǎng)皿、三角瓶、水、玻璃珠、玻璃刮刀、吸管、槍尖等第16頁/共35頁四、操作步驟（1）1.制備土壤稀釋液2.涂布平板3.培養(yǎng)4.挑菌落5.平板劃線分離6.菌種保藏（留作鑒定）第17頁/共35頁四 操作步驟（2）1制備土壤稀釋液 第18頁/共35頁四、操作步驟（3） 挑菌落接種和分離工具1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 第19頁/共35頁四、操作步驟（4

9、）第20頁/共35頁四、操作步驟（4）第21頁/共35頁劃線接種點(diǎn)接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種四、操作步驟（5）第22頁/共35頁斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞 四、操作步驟（6）第23頁/共35頁四、操作步驟（7）平板劃線法第24頁/共35頁 平板劃線分離的方法1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法四、操作步驟（8）平板劃線法第25頁/共35頁 制備土壤稀釋液時，要注意使土樣均勻分散在稀釋液中。 注意無菌操作。五 注意事項(xiàng)第26頁/共35頁 六 思考題 試擬出從土壤中分離芽孢桿菌的主要

10、實(shí)驗(yàn)步驟。 如何檢驗(yàn)平板上某個單菌落是不是純培養(yǎng)？第27頁/共35頁第三部分 分離菌株的鑒定第28頁/共35頁一、目的要求 掌握常用的微生物鑒定方法。 掌握生理生化試驗(yàn)的原理與方法。 復(fù)習(xí)以前學(xué)過的各種染色方法第29頁/共35頁二、實(shí)驗(yàn)原理1、微生物的分類鑒定是微生物的重要內(nèi)容，一般從菌落特征、細(xì)菌特點(diǎn)及生理生化、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行鑒定。2、各種細(xì)菌在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同的細(xì)菌分解大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的能力不同，所能發(fā)酵的類型和最終產(chǎn)物也不一樣。不同細(xì)菌對營養(yǎng)的要求不同也說明了它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們是有不同的酶系統(tǒng)。細(xì)菌的這種生化反應(yīng)的多樣性在自然界

11、產(chǎn)生了兩種結(jié)果：第一、使自然界所有的有機(jī)分子都有可能得到分解；第二、使不同細(xì)菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎(chǔ)，例如，一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物。另一方面，微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一,細(xì)菌的生化反應(yīng)的多樣性也被人們作為細(xì)菌的鑒定和分類方法來利用，可以鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。 第30頁/共35頁三、實(shí)驗(yàn)器材 1試劑：各種染色液、生理生化用試劑等 2微生物材料：學(xué)生自己分離純化的菌種 3 其他器材：生理生化培養(yǎng)基、接種環(huán)、培養(yǎng)箱等第31頁/共35頁四、操作步驟（1） 記錄菌種的培養(yǎng)特征 革蘭氏染色，記錄菌體特征與染色特性 芽孢染色 鞭毛染色 查伯杰氏手冊，初步對菌種進(jìn)行鑒定。第