造血干細(xì)胞表型及分離純化方法

1、造血干細(xì)胞表型及分離純化方法 一個(gè)多世紀(jì)前，由 artur appenheim(18701916)提出。是一類(lèi)同時(shí)具有自我更新和向各系血細(xì)胞分化能力的原始細(xì)胞群。hematopoietic stem cell支持干細(xì)胞存在的初始證支持干細(xì)胞存在的初始證據(jù)據(jù)1.從小鼠獨(dú)特的染色體標(biāo)記中證實(shí)， 存在能同時(shí)產(chǎn)生淋巴和髓系細(xì)胞的 多能干細(xì)胞(pluripotent)。2.慢性髓性白血病同工酶分析可見(jiàn)， b淋巴細(xì)胞和髓樣細(xì)胞都來(lái)自慢性 髓性白血病干細(xì)胞克隆。3.用帶有新霉素抗性基因標(biāo)志的逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體轉(zhuǎn)染鼠骨髓細(xì)胞，分析 病毒特異聚集部位證實(shí)，不同淋巴 和髓系表型的細(xì)胞來(lái)自同一干細(xì) 胞。4.鼠胎肝造血

2、祖細(xì)胞體外單細(xì)胞培養(yǎng) 可生成髓系和粒系細(xì)胞。 缺乏辨認(rèn)、計(jì)數(shù)干細(xì)胞的手段。干細(xì)胞的辨認(rèn)僅靠體外克隆形成分析和估算如：cfu-gm ，cfu- mix。civin等制備出一株鼠抗人髓系白血病細(xì)胞單抗(my-10), 當(dāng)時(shí)稱(chēng)kg-la,該抗體可與所有造血前體細(xì)胞(progenitors)特異結(jié)合。過(guò)去干細(xì)胞研究進(jìn)展緩慢的原因過(guò)去干細(xì)胞研究進(jìn)展緩慢的原因 之后，其他研究小組也相繼研制出12.8; bi-3c5; ich-3等類(lèi)似抗體。1986年，這些抗體被命名為cd34，為目前公認(rèn)的干細(xì)胞的重要標(biāo)志。 cd34抗原的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了造血干細(xì)胞研究的深入和發(fā)展，是一重要的里程碑事件。一.造血細(xì)胞的表型 cd

3、34；sca-1；thy-1；lin-；c-kit 二.造血細(xì)胞分離方法 facs；磁柱分離；親合分離； panning本次課的主要內(nèi)容本次課的主要內(nèi)容一、造血干細(xì)胞表型 免疫技術(shù)、克隆技術(shù)、流式細(xì)胞分類(lèi)術(shù)等的發(fā)展，促進(jìn)了干細(xì)胞的研究，相繼發(fā)現(xiàn)許多干細(xì)胞特有的表型(phenotype)。如 cd34；sca-1；thy-1；lin；c-kit 等。1.1.cd34的生物學(xué)特性的生物學(xué)特性（一）（一）cd34 基因定位基因定位 chromosome 1, (1q32)(human)也有報(bào)道位于1q12 q ter 與cd45及一些其它膜蛋白家族毗鄰。 全長(zhǎng)(spans)2628kb (human

4、), 編碼序列含8個(gè)exons ， 第1和8個(gè)exon 編碼翻譯區(qū)和部分非翻譯區(qū)； 27個(gè)exons僅編碼翻譯區(qū)。也有報(bào)道人cd34基因全長(zhǎng)38kb 。 基因長(zhǎng)度基因長(zhǎng)度 在 cytoplasmic domains,人、鼠cd34基因的同源性達(dá)90%以上。這種同源性在n末端逐漸減少為45%左右。 人、鼠人、鼠cd34基因的同源性基因的同源性 分子量為105-120kd。人cd34 cdna轉(zhuǎn)錄翻譯的多肽鏈長(zhǎng)373個(gè)氨基酸殘基，是一跨膜蛋白。 cd34分子的大小分子的大小 n端為20aa的信號(hào)肽，含有大量的 serine / threonine；胞外區(qū)258aa；跨膜區(qū)22aa；胞內(nèi)區(qū)73aa。

5、不同部位不同部位aaaa的長(zhǎng)度為：的長(zhǎng)度為： 所謂表位是指同一抗原分子上有不同的抗原識(shí)別位點(diǎn)。目前有my-10, bi-3c5, 12.8, ich-3, tuk , 115.2 等單抗識(shí)別的位點(diǎn)。前四株識(shí)別的表位取決于 sialic acid residues, 后二者卻不 一樣。 cd34分子的分子的epitopes （根據(jù)對(duì)neuraminidase和glycopotease 的敏感性不同） 對(duì)gpas敏感，對(duì)naas敏感性不同 (my-10,bi-3c5,12.8,ich-3) 對(duì)gpas，naas都敏感 (tuk3,115.2,8g12) 對(duì)naas不敏感，對(duì)gpas敏感 (qben

6、d-10)cd34表位分表位分三類(lèi)三類(lèi)： 許多cd分子既是細(xì)胞分化的標(biāo)志也是功能的標(biāo)志。cd34分子的確切功能目前尚不完全清楚，但已發(fā)現(xiàn)具有以下功能：2.2.cd34的功能的功能(1)(1)粘附功能粘附功能( (與與stromal cell 粘附粘附) ) 電鏡發(fā)現(xiàn)cd34分子濃集在內(nèi)皮交叉膜(interdigitating membrane)的micro-processes。此部位是白細(xì)胞結(jié)合并遷移到血管外的重要部位。cd34分子的結(jié)構(gòu)可能影響其與細(xì)胞的粘附。 此外，淋巴內(nèi)皮小靜脈粘附實(shí)驗(yàn)表明，由重組l-selectin識(shí)別的一種內(nèi)皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列與cd34一致，因此

7、，cd34分子至少可作為l-selectin的配體，協(xié)助干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞接觸和粘附。 干細(xì)胞越原始，表面cd34分子密度越大，細(xì)胞分化到形態(tài)學(xué)發(fā)生改變時(shí)，表面cd34分子表達(dá)逐漸減少，直至消失。 推測(cè)，在造血早期，cd34分子的作用可能與干細(xì)胞之間或干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的接觸、通信和相互作用有關(guān)。 (2) (2) 細(xì)胞間接觸、通信和相互作用細(xì)胞間接觸、通信和相互作用 civin小組證實(shí)，cd34可由激活的pkc迅速磷酸化，激活的pkc能刺激cd34陽(yáng)性前體細(xì)胞cd34上調(diào)，這種上調(diào)獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)cd34的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)換?？梢?jiàn)，cd34磷酸化是細(xì)胞表面上調(diào)的扳機(jī)，pkc活化是生長(zhǎng)因子配體-受體結(jié)合啟

8、動(dòng)胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的一個(gè)成分。(3)(3)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用 外周血單核細(xì)胞約為0.1% 破骨細(xì)胞(osteoclasts)、骨髓基質(zhì)前體 細(xì)胞、外周神經(jīng)鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞等也發(fā)現(xiàn)有cd34抗原表 達(dá)。 骨髓單核細(xì)胞約為13%。3.3.細(xì)胞細(xì)胞cd34的表達(dá)的表達(dá) 一些惡性疾病，如aml、早前，前和急性t淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞都有cd34抗原的表達(dá)。在成人aml中，外周細(xì)胞cd34的表達(dá)預(yù)示患者對(duì)系統(tǒng)治療反應(yīng)較差，完全緩解率及存活率低，傳統(tǒng)的化療方案治療效果可能不好。 根據(jù)細(xì)胞表面抗原表達(dá)的情況，可將cd34陽(yáng)性細(xì)胞分為許多亞群，這些細(xì)胞多數(shù)已定向到特定細(xì)

9、胞系。 與cd34共表達(dá)，可作為干細(xì)胞進(jìn)一步分型依據(jù)的抗原有：cd38、cd10、cd19、cd5、cd7、cd71、cd45、cd41、cd13、cd33等。4.4.cd34陽(yáng)性細(xì)胞亞群陽(yáng)性細(xì)胞亞群不同不同cd34陽(yáng)性細(xì)胞亞群陽(yáng)性細(xì)胞亞群cd34+cd38-； cd34+cd38+；cd34+cd10+cd19+ (前b)；cd34+cd5+cd7+ (前t)；cd34+cd71+cd45ro+ (紅前)；cd34+cd41+(巨前)；cd34+cd13+cd33+cd45ra+ (髓前)cd34hi lin- hla-drlow thy-1+ cd45ro+ rhodull . 較原始干細(xì)

10、胞亞群的免疫表型一般為：(rhodamine 123 dull) cd34+cd38- hla-dr+ 和cd34+cd38-hla-dr-兩群細(xì)胞，前者克隆率為50%，能向所有造血細(xì)胞系分化；后者除前者功能外，還能形成復(fù)雜的，能支持造血前體細(xì)胞分化的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，這種細(xì)胞 被命名為common (hematopoietic/stromal) stem cell (csc)。三色分析又發(fā)現(xiàn)三色分析又發(fā)現(xiàn) osawa等人首先證明小鼠hscs可以是 cd34陰性的。 人的cd34陰性細(xì)胞也有低水平的造血能 力。 移植研究表明胎綿羊cd34陰性細(xì)胞有重 新繁殖的能力。 人和鼠的cd34陽(yáng)性細(xì)胞可能來(lái)源于

11、 cd34 陰性細(xì)胞。cd34是是hscs標(biāo)志物近年受到的挑戰(zhàn)標(biāo)志物近年受到的挑戰(zhàn) 這些報(bào)告提示，hscs可能是cd34+或cd34-。只選擇表達(dá)cd34的細(xì)胞可能導(dǎo)致將更原始的干細(xì)胞排除在外。然而幾乎所有的臨床和實(shí)驗(yàn)流程包括體外培養(yǎng)、基因療法和hsc抑制，目前都設(shè)計(jì)成收集富含cd34+的細(xì)胞。( (二二) )干細(xì)胞其它免疫表型干細(xì)胞其它免疫表型 從前t細(xì)胞雜交瘤中得到的幾株單抗，由此單抗識(shí)別的抗原被命名為sca-1。是18kda磷脂酰肌醇錨定蛋白，屬ly-6抗原家族成員。43sca-1被廣泛認(rèn)為和ly-6 半抗原一起，是小鼠hsc標(biāo)志分子，在多能hscs上表達(dá)。1. stem cell an

12、tigen-1(sca-1) 根據(jù)sca-1是否陰性可將thy-1lowlin-細(xì)胞進(jìn)一步分為：thy-1lowlin- sca-1+ 和thy-1lowlin- sca-1-兩群，前者含干細(xì)胞和cfu-t，后者不含 cfu-t，兩群細(xì)胞都含cfu-s。 mouse 和 rat 骨髓造血干細(xì)胞中與淋巴系組細(xì)胞定向、分化有關(guān)的抗原。 2. thy-1(cd90) 一種原癌基因。最近證明造血干細(xì)胞與c-kit基因密切相關(guān)。c-kit可編碼一種穿膜酪氨酸激酶受體分子。應(yīng)用單克隆抗體證明此分子可存在于造血干細(xì)胞膜上，其后證明它的配體分子是造血干細(xì)胞因子（stem cell factor, scf），一

13、種信號(hào)傳導(dǎo)分子，對(duì)造血干細(xì)胞的分化具有重要作用。 3. c-kit (cd117) c-kit分子可高頻率表達(dá)于多能干細(xì)胞表面,但骨髓中c-kit+細(xì)胞可分化為各種血細(xì)胞，而胸腺中c-kit細(xì)胞可分化為淋巴細(xì)胞，不能分化為髓系細(xì)胞，所以胸腺內(nèi)c-kit+細(xì)胞，可能是淋巴樣干細(xì)胞。 lineage negative,指指 t-、b-、m-、g- 細(xì)胞。細(xì)胞。4. lin- 97kda的糖蛋白，包括5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域， 糖基化后在蛋白膠上顯示120 kda的蛋白帶。最初是通過(guò)ac133單抗鑒定的，它能識(shí)別人hscs的cd34+亞類(lèi)29,30。一種cd133異構(gòu)體ac133-2, 最近已經(jīng)被克隆并鑒定為

14、可被ac133抗體識(shí)別的原始表面抗原。 5. cd133(ac133) chromosomal location 4p16.2-p12 human the ac133 antigen is likely to contain 5-tm domains in addition to a signal peptide. the 5-tm structure includes an extracellular n-terminus, two short intracellular loops, two large extracellular loops and an intracellular c-

15、terminus. protein sequence hematopoietic stem and progenitor cells. neural and embryonic stem cells. some leukemias and brain tumours that may be derived from stem cells. low level expression could also be detected in the kidney, pancreas, placenta, and fetal liver. expressionfmacs-isolated cd133+ c

16、ells became adherent and cd133- during cultivation, but gave rise to non-adherent cd133+ cells budding from the adherent cell surface by a symmetric cell division. cells were stained with cd133/1 (ac133)-pe. cd133-expressing cells in different hematopoietic tissues normal bone marrowcord blood apher

17、esis( (采血采血) ) cd133+ %0.52 0.110.16 0.031.37 0.27cd34+ %1.47 0.230.37 0.061.75 0.31cd133+ among cd34+ cells % 36.3 2.251.0 1.675.3 0.8tree of differentiation 6. abcg2 (atp-binding cassette, sub-family g, member 2) synonyms:abc15, abcp, bcrp, bcrp1, bmdp, breast cancer resistance protein, est157481,

18、 mrx, mxr, mxr1,placenta-specific atp-binding cassette transporter. 二、造血干細(xì)胞的分離純化二、造血干細(xì)胞的分離純化 1. fluorescence activated cell sorting (facs)(1) (1) 組成組成細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)收集結(jié)果處理光源液流(2) (2) 基本原理基本原理 flow cell液體+cell液鞘單細(xì)胞液柱激光激發(fā)數(shù)據(jù)處理樣本+ +氣壓定量分析定量分析(3)(3)非標(biāo)記分析非標(biāo)記分析 根據(jù)光散射特性，facs利用前向光散射(fls)區(qū)別細(xì)胞大小，利用垂直光散射(perpendicular l

19、ight scatter ) 觀察細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。用上述方法分離細(xì)胞稱(chēng)非標(biāo)記分離。(4)(4)標(biāo)記分離標(biāo)記分離 利用被分離細(xì)胞表面的一些抗原或受體與相應(yīng)配體結(jié)合，用激光激發(fā)結(jié)合配體上的螢光，分析不同標(biāo)記物的光譜，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。2. 2. avidin-biotin 親合分離親合分離 細(xì)胞用biotin化的抗cd34抗體標(biāo)記avidin化的polycrylamide bead 柱cd34陽(yáng)性細(xì)胞掛在柱上機(jī)械振搖，沖洗柱床收獲細(xì)胞 一根商品化的分離柱(cepratm)一次可收 獲50 x109個(gè)cd34細(xì)胞，分離細(xì)胞cd34陽(yáng)性率為67%,占整個(gè)分離細(xì)胞陽(yáng)性率的51%。整個(gè)分離過(guò)程約需二小時(shí)。

20、(94年前的產(chǎn)品)3. megnetic activated cell sorting 上述方法花費(fèi)大。之后發(fā)展了一種iron-dextran系統(tǒng)。細(xì)胞-dextran-iron，磁場(chǎng)吸附，去掉未吸附細(xì)胞，去掉磁場(chǎng)收獲感興趣的細(xì)胞。該法特異性較差，分離率不高。聚苯乙烯包被的微球法：聚苯乙烯包被的微球法： 細(xì)胞與抗cd34抗體孵育與二抗包被的微球孵育啟動(dòng)磁場(chǎng)到掉未結(jié)合細(xì)胞去掉磁場(chǎng)蛋白水解酶消化收獲細(xì)胞magnetic labeling magnetic separation elution of the non-labeled cell fraction elution of thelabele

21、d cell fraction minimacs separatorbasic for the lab: mini macs separator with ms column. automacs separatorautomated bench-top magnetic cell sorter for high cell numbers or multiple samples clinimacsplus instrumentclinimacs allows large cell numbers to be separated in a closed and sterile system. 方法評(píng)價(jià)：方法評(píng)價(jià)： 屬間接法。分離細(xì)胞純度達(dá)90%以上，回收率約為67%。由于去掉磁珠時(shí)使用了蛋白酶，對(duì)細(xì)胞其它表面分子有一定破壞作用，該法分離細(xì)胞表型完整性尚不十分清楚。直接法：直接法： 抗cd34、cd38等抗體吸附在直徑不同的磁珠上，細(xì)胞與之孵育，開(kāi)啟