酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究

1、1、學習酶的純化方法，酶蛋白分離提純的原理。2、學習掌握細胞破壁、有機溶劑分級和離子交換柱層析技術(shù)。 本實驗可以為大家提供一個較全面的實踐機會，學習如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對這種酶的性質(zhì)，尤其是動力學性質(zhì)作初步的研究。酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究 自1860年bertholet從啤酒酵母（sacchacomyces cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來，它已被廣泛地進行了研究。蔗糖酶（invertase）（-d-呋喃果糖苷果糖水解酶）（ec.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的-呋喃果糖苷鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也

2、能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 實驗原理 本實驗提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細胞膜外細胞壁中的稱之為外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在細胞膜內(nèi)側(cè)細胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶，含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個亞基比內(nèi)酶多兩個氨基酸，ser和met，它們的分子量也不同，外酶約為27萬(或22萬，與酵母的來源有關(guān))，內(nèi)酶約為13.5萬。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動力學性質(zhì)仍十分相似，因此，本實驗未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提

3、取，本實驗提取純化的主要是外酶。名稱 mw 糖含量 亞基 為蔗糖的km 為棉子糖的km pi 最適ph 穩(wěn)定ph 最適溫度外酶 27萬 50% 雙 26mm 150 mm 5.0 4.9 3.0-7.5 60 內(nèi)酶13.5萬 3% 雙 25mm 150 mm 5.0 4.5 6.0-9.0 60實驗中，用測定生成還原糖（葡萄糖和果糖）的量來測定蔗糖水解的速度，在給定的實驗條件下，每分鐘水解底物的量定為蔗糖酶的活力單位。比活力為每毫克蛋白質(zhì)的活力單位數(shù)。兩種酶的性質(zhì)對照表如下：一、蔗糖酶的提取與部分純化一、蔗糖酶的提取與部分純化 二、離子交換柱層析純化蔗糖酶二、離子交換柱層析純化蔗糖酶 三、蔗糖

4、酶各級分活性及蛋白質(zhì)含量的測定三、蔗糖酶各級分活性及蛋白質(zhì)含量的測定 本實驗共有三個分實驗：本實驗共有三個分實驗：細胞破壁的幾種方法細胞破壁的幾種方法1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3、反復(fù)凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理

5、細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（sds）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。6、有機溶劑沉淀法：即向水溶液中加入一定量的親水性的有機溶劑可降低溶質(zhì)的溶解度使其沉淀被析出。（一）蔗糖酶的提取與部分純化（一）蔗糖酶的提取與部分純化 （1）準備一個冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。）準備一個冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。（2）稱?。┓Q取2g干啤酒酵母，稱干啤酒酵母，稱10mg蝸牛酶及適量（約蝸牛酶及適量（約4g）二氧化硅，放入研缽中。二氧化硅要預(yù)先研細。二氧化硅，放入研缽中。二氧化硅要預(yù)先研

6、細。（3）量取預(yù)冷的甲苯）量取預(yù)冷的甲苯12ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊糊狀狀，約需，約需60分鐘。研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細分鐘。研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細胞大部分研碎。胞大部分研碎。（4）緩慢加入預(yù)冷的）緩慢加入預(yù)冷的20ml去離子水，每次加去離子水，每次加2ml左右，邊加左右，邊加邊研磨，至少用邊研磨，至少用30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。 （5）將混合物轉(zhuǎn)入）將混合物轉(zhuǎn)入1個離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機個離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機離心，離心，4，4700rpm，15min。如果中

7、間白色的脂肪層厚，說如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機相。明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機相。 操作步驟操作步驟（6）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個清潔的）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個清潔的離心管中，離心管中，4，4700rpm，離心，離心15min。 （7）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測定酶活力測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。 （8）用廣泛）用廣泛ph試紙檢查清液試紙檢查清液ph，用，用1m乙酸將乙酸將ph調(diào)至調(diào)至5.0，稱為稱為“粗

8、級分粗級分i”。2. 熱處理熱處理 （1）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到50，將盛有粗級分，將盛有粗級分i的離心管穩(wěn)妥的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，地放入水浴中，50下保溫下保溫30分鐘，在保溫過程中不斷輕搖離分鐘，在保溫過程中不斷輕搖離心管。心管。 （2）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，用）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，用4，4700rpm，離心離心15min。 （3）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測定酶活力測定酶活力及蛋白質(zhì)含量（稱為及蛋白質(zhì)含量（稱為“熱級分熱級分ii”）。）。3. 乙醇沉淀乙醇沉淀 將熱級分將熱級分ii轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰

9、?。]有水的碎冰撒入轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰?。]有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入少量食鹽），逐滴加入等體積等體積預(yù)冷至預(yù)冷至-20的的95%乙醇，同時乙醇，同時輕輕攪拌，共需輕輕攪拌，共需30分鐘，再在冰浴中放置分鐘，再在冰浴中放置10分鐘，以沉淀完全。分鐘，以沉淀完全。于于4，4700rpm，離心，離心15min，量出體積，留出，量出體積，留出1.5ml（下次實驗測定酶活力）后傾去上清，沉淀用（下次實驗測定酶活力）后傾去上清，沉淀用2ml 0.02m ph7.3的的tris-hcl緩沖液充分溶解，保存于離心管中，蓋上蓋緩沖液充分溶解，保存于離心管中，蓋上蓋子，然后將其放入冰箱中冷凍保存（稱為

10、子，然后將其放入冰箱中冷凍保存（稱為“醇級分醇級分”）。）。親和層析親和層析利用分子與其配體間特殊的、可逆性的親和結(jié)合作用而進行分離的一種層析技術(shù)。可以選用生物化學、免疫化學或其他結(jié)構(gòu)上吻合等親和作用而設(shè)計的各種層析分離方法。凝膠過濾層析凝膠過濾層析利用一定大小孔隙的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作層析介質(zhì)（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小、形狀不同擴散到凝膠孔隙內(nèi)的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。 離子交換層析n利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶電荷電荷不同，因而與不同，因而與離子離子交換樹脂交換樹脂有不同之吸附力

11、有不同之吸附力而分離之而分離之改變?nèi)芤旱母淖內(nèi)芤旱膒h值值和和鹽離子鹽離子濃度，結(jié)合力最小濃度，結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)先洗脫下來。的蛋白質(zhì)先洗脫下來。離子交換層析離子交換層析(sephorase deae fast flow) 離子交換層析技術(shù)是以離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素離子交換纖維素或以離子交換葡聚或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動相，分離和提純蛋白糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項技術(shù)。質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項技術(shù)。 在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團，當結(jié)合陽在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子

12、基團，當結(jié)合陽離子基團時，可換出陰離子，則稱為離子基團時，可換出陰離子，則稱為陰陰離子交換劑。如二乙氨乙離子交換劑。如二乙氨乙基（基（dicthylaminoethyl，deae）。在纖維素上結(jié)合了）。在纖維素上結(jié)合了deae，含有帶正電荷的陽離子纖維素，含有帶正電荷的陽離子纖維素oc6 h14nh+，它的，它的反離子為陰離子（如反離子為陰離子（如cl-等），可與帶負電荷的蛋白質(zhì)陰離子進行等），可與帶負電荷的蛋白質(zhì)陰離子進行交換。交換。 當結(jié)合陰離子基團時，可置換陽離子，稱為當結(jié)合陰離子基團時，可置換陽離子，稱為陽陽離子交換劑，離子交換劑，如羧甲基（如羧甲基（carboxymethy，cm）纖

13、維素。纖維素分子上帶）纖維素。纖維素分子上帶有負電荷的陰離子（纖維素有負電荷的陰離子（纖維素och2coo-），其反離子為），其反離子為陽離子（如陽離子（如na+等）等）,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽離子進行交換?？膳c帶正電荷蛋白質(zhì)陽離子進行交換。 溶液的溶液的ph值與蛋白質(zhì)等電點相同時，凈電荷為值與蛋白質(zhì)等電點相同時，凈電荷為0，當溶液，當溶液ph值大于蛋白質(zhì)等電點時，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶值大于蛋白質(zhì)等電點時，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負電荷負電荷。反之，溶。反之，溶液的液的ph值小于蛋白質(zhì)等電點時，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶值小于蛋白質(zhì)等電點時，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷正電荷。溶液的溶液的ph值距蛋白質(zhì)等電

14、點越遠，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越值距蛋白質(zhì)等電點越遠，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。少。 在適當?shù)柠}濃度下，溶液的在適當?shù)柠}濃度下，溶液的ph值高于等電點時，蛋白質(zhì)被陰離值高于等電點時，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當溶液的子交換劑所吸附；當溶液的ph值低于等電點時，蛋白質(zhì)被陽離子值低于等電點時，蛋白質(zhì)被陽離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液結(jié)合程度也不同，只要溶液ph值發(fā)生改變，就會直接影響到蛋白值發(fā)生改變，就會直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個分離開來。質(zhì)與交

15、換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個分離開來。 交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機鹽離子（如交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機鹽離子（如nacl）都具有交換吸附的能力，當兩者同時存在于一個層析過程中，都具有交換吸附的能力，當兩者同時存在于一個層析過程中，則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。當則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。當cl-的濃度大時，蛋白質(zhì)不容易被的濃度大時，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當吸附，吸附后也易于被洗脫，當cl-濃度小時，蛋白質(zhì)易被吸附，濃度小時，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達到

16、分離蛋白質(zhì)的目的。兩種方法達到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強一種是增加洗脫液的離子強度，一種是改變洗脫液的度，一種是改變洗脫液的ph值。值。ph值增高時，抑制蛋白質(zhì)陽值增高時，抑制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。ph值降低時，抑值降低時，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對陰離子交換劑的吸附。制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對陰離子交換劑的吸附。當使用陰離子交換劑時，增加鹽離子，則降低當使用陰離子交換劑時，增加鹽離子，則降低ph值。當使用陽值。當使用陽離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則升高溶液離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則

17、升高溶液ph值。值。 離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑首先離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗雜質(zhì)和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進一步去

18、除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為交換劑中通常陽離子交換劑為na型（即平衡離子是型（即平衡離子是na離子），陰離子），陰離子交換劑為離子交換劑為cl型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時一般陽離子交型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是hcl，堿是堿是naoh或再加一定的或再加一定的nacl，這樣處理后陽離子交換劑為，這樣處理后陽離子交換劑為na型，型，陰離子交換劑為陰離子交換劑為cl型

19、。使用的酸堿濃度一般小于型。使用的酸堿濃度一般小于0.5 mol / l，浸，浸泡時間一般泡時間一般30 min。處理時應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時間。處理時應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。柱上操作柱上操作交換劑裝柱最簡單的交換層析柱可用交換劑裝柱最簡單的交換層析柱可用堿式滴定管堿式滴定管代替。處理代替。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管過的樹脂放入燒杯，

20、加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。 上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液 洗脫與收集洗脫與收集 不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著的物質(zhì)往往不是活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質(zhì)。流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質(zhì)

21、。離子交換柱層析純化蔗糖酶離子交換柱層析純化蔗糖酶 操作步驟操作步驟 1.離子交換劑的處理：離子交換劑的處理： 稱取稱取1.5克克deae纖維素（纖維素（de-23）干粉，加入）干粉，加入0.5m naoh溶液（約溶液（約50ml），輕輕攪拌，浸泡至少），輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時（不超小時（不超過過1小時），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽小時），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加干后，放入小燒杯中，加50ml 0.5 m hcl, 攪勻，浸泡攪勻，浸泡0.5小小時，同上，用去離子水洗至近中性，再用時，同上，用去離子水洗至近中性，再用0.5 m

22、naoh重復(fù)處重復(fù)處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。（因理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。（因deae纖維纖維素昂貴，用后務(wù)必回收）。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過素昂貴，用后務(wù)必回收）。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過回收的，按回收的，按“堿堿鹽鹽”的順序洗即可（的順序洗即可（0.5 m naoh,1 m nacl 溶液處理），然后水洗至中性。最后保存在溶液處理），然后水洗至中性。最后保存在20%的酒精的酒精溶液中。溶液中。2.裝柱與平衡：裝柱與平衡： 先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用0.02 mol/l ph 7.3 tris-hcl 緩沖液

23、洗瓊脂糖凝膠幾次，裝柱，然后用緩沖液洗瓊脂糖凝膠幾次，裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導率與緩沖液相同或接近此緩沖液洗柱至流出液的電導率與緩沖液相同或接近時即可上樣。（一般洗時即可上樣。（一般洗2-3個柱體積）個柱體積）3.上樣與洗脫：上樣與洗脫： 上樣前先準備好梯度洗脫液，本實驗采用上樣前先準備好梯度洗脫液，本實驗采用30ml 0.02m ph7.3的的tris-hcl緩沖液和緩沖液和30ml含含1mnacl的的0.02mol/l ph7.3的的tris-hcl緩沖液，進行線性梯度洗脫。取兩個相同直緩沖液，進行線性梯度洗脫。取兩個相同直徑的徑的50ml量杯，一個裝量杯，一個裝30ml含含

24、nacl的高離子強度溶液，另的高離子強度溶液，另一個裝入一個裝入30ml低離子強度溶液，放在磁力攪拌器上，在低離子低離子強度溶液，放在磁力攪拌器上，在低離子強度溶液的量杯內(nèi)放入一個小攪拌子，使兩杯溶液形成連通，強度溶液的量杯內(nèi)放入一個小攪拌子，使兩杯溶液形成連通，注意兩個杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。注意兩個杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用用2ml 0.02m ph7.3的的tris-hcl緩沖液充分溶解醇級緩沖液充分溶解醇級分分，若溶液混濁，則用小試管，若溶液混濁，則用小試管，10000rpm離心離心除去不溶物。除去不溶物。取取1.5ml上清液（即醇級分上清液（即醇級分樣品，留待下

25、一個實驗測酶活力及樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量），將剩余的上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱蛋白含量），將剩余的上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管3.0ml/3min。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約20ml緩緩沖液沖液洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì)洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì)，至，至a280降到降到0.1以下，夾住層以下，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細塑料導管放入不含析柱出口，將恒流泵入口的細塑料導管放入不含nacl的低離子的低離子強度溶液的小燒杯中，接好層析柱，打開磁

26、力攪拌器，放開層析強度溶液的小燒杯中，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個小燒杯中的洗脫柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余30ml高離子強度高離子強度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速3.0ml/3min。 測定每管洗脫液的測定每管洗脫液的a280光吸收值，合并活性最光吸收值，合并活性最高的高的2-3管，量出總體積，此即管，量出總體積，此即“柱級分柱級分iv”。 注意：從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯注意：從上樣開

27、始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始后洗下來的活性峰。度洗脫開始后洗下來的活性峰。各級分蛋白質(zhì)含量的測定各級分蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮蘭染料法（采用考馬斯亮蘭染料法（bradford法）的微量法測定蛋法）的微量法測定蛋白質(zhì)含量，參見白質(zhì)含量，參見 實驗實驗“蛋白質(zhì)含量的測定法蛋白質(zhì)含量的測定法” 。各級分先。各級分先要仔細尋找和試測出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細記錄稀釋倍數(shù)的要仔細尋找和試測出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細記錄稀釋倍數(shù)的計算（使用移液管和量筒稀釋）。下列稀釋倍數(shù)僅供參考：計算（使用移液管和量筒

28、稀釋）。下列稀釋倍數(shù)僅供參考： 粗級分粗級分 i： 100倍倍 熱級分熱級分ii： 100倍倍 醇級分醇級分iii： 100倍倍 柱級分柱級分iv： 不稀釋不稀釋 蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定標準蛋白質(zhì)濃度：1mg/ml蔗糖酶各級分活性的測定蔗糖酶各級分活性的測定 測定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費林試劑法、測定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費林試劑法、nelsons試劑法、水楊酸試劑法等，本實驗先試劑法、水楊酸試劑法等，本實驗先使用費林試劑使用費林試劑法，法，以后測米氏常數(shù)以后測米氏常數(shù)km和最大反應(yīng)速度和最大反應(yīng)速度vmax時再用時再用nelsons試劑試劑法。法。 費林試劑法靈敏度較高

29、，但數(shù)據(jù)波動較大，因為反應(yīng)后溶液費林試劑法靈敏度較高，但數(shù)據(jù)波動較大，因為反應(yīng)后溶液的顏色隨時間會有變化，因此加樣和測定光吸收值時最好能計時。的顏色隨時間會有變化，因此加樣和測定光吸收值時最好能計時。其其原理原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑堿性銅試劑混合加熱后混合加熱后被氧化，二價銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與被氧化，二價銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與磷鉬磷鉬酸酸作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于作用，生

30、成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于650nm測定光吸收值。測定光吸收值。 級分級分i、ii、iii蔗糖酶活性測定蔗糖酶活性測定 用去離子水代替稀釋各級分酶液，試測出測酶活合適的稀釋倍數(shù)：用去離子水代替稀釋各級分酶液，試測出測酶活合適的稀釋倍數(shù)：i ： 10000倍倍 ii ： 10000倍倍 iii ： 100000倍倍 上清不稀釋，平衡峰不稀釋上清不稀釋，平衡峰不稀釋 iv洗脫峰稀釋洗脫峰稀釋100倍倍 以上稀釋倍數(shù)僅供參考。以上稀釋倍數(shù)僅供參考。 表 1 級分、的酶活力測定 各管名稱 對照對照 粗級分 熱級分 上清 醇級分 iv 葡萄糖 管數(shù) 1 2 3 4 5 6 7 8酶液(

31、ml) 0.0 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0 0h2o(ml) 0.6 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 1.0 0.8 乙酸緩沖液 (0.2mol/l ph4.9) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0 0葡萄糖葡萄糖2mmol/l 0 0 0 0 0 0 0 0.2 蔗糖蔗糖0.2mol/l 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0 0 加入蔗糖，立即搖勻開始計時，25度準確反應(yīng)10min后，立即加堿性銅試劑中止反應(yīng)。 堿性銅試劑 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 100水浴加熱8min，立即用自

32、來水冷卻 磷鉬酸試劑 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0h2o 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0a650nm 酶活力單位酶（活力）單位酶（活力）單位：在一定條件下，一定時間內(nèi)將一定量：在一定條件下，一定時間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。（的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。（u/g，u/ml）在最適的反應(yīng)條件（在最適的反應(yīng)條件（25）下，）下，每分鐘每分鐘內(nèi)催化內(nèi)催化一微摩爾一微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定為一個酶活力單位，即底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定為一個酶活力單位，即 1u=1mol/min在最適條件下，在最適條件下，每秒鐘每秒鐘內(nèi)使內(nèi)使

33、一摩爾底物一摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為的酶量定為1kat單位，即單位，即 1kat=1mol/s1kat = 6107 u酶的純度酶的純度： 總活力總活力=活力單位數(shù)活力單位數(shù)/ml酶液酶液總體積（總體積（ml） 比活力比活力 = 活力單位數(shù)活力單位數(shù)/ 毫克蛋白毫克蛋白純化倍數(shù) = 每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力產(chǎn)率%（回收率）= 100每次總活力每次總活力第一次總活力第一次總活力酶的純化鑒定酶的純化鑒定：聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法 稀釋后酶液的活力（按還原糖計算）：稀釋后酶液的活力（按還原糖計算）：e=a650*0.2*2/ a650*10*b式