雙縮脲法測定蛋白質

1、生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗記錄實驗記錄實驗記錄是在進行科學研究過程中積累資料、經驗的一項重要工作，每一次實驗過程實驗記錄是在進行科學研究過程中積累資料、經驗的一項重要工作，每一次實驗過程中都應當養(yǎng)成良好的習慣，及時做好記錄和總結。中都應當養(yǎng)成良好的習慣，及時做好記錄和總結。要求：要求： 真實性真實性 原始性原始性 完整性完整性 條理性條理性實驗報告的書寫實驗報告的書寫實驗結束后，應及時整理和總結實驗結果，寫出實驗報告。完整的實驗報告應包實驗結束后，應及時整理和總結實驗結果，寫出實驗報告。完整的實驗報告應包括：實驗題目、實驗目的括：實驗題目、實驗目的 、實驗日期、操作步

2、驟與條件、實驗結果、討論和結、實驗日期、操作步驟與條件、實驗結果、討論和結論等項目。論等項目。實驗室規(guī)則實驗室規(guī)則 上實驗課時不遲到，不早退，自覺遵守課堂紀律，上課時應保持實驗室安靜，不得大上實驗課時不遲到，不早退，自覺遵守課堂紀律，上課時應保持實驗室安靜，不得大聲說笑。進入實驗室必須穿實驗工作服。聲說笑。進入實驗室必須穿實驗工作服。 實驗課前認真預習有關課程，明確實驗目的、要求和注意事項，熟悉實驗內容和方法實驗課前認真預習有關課程，明確實驗目的、要求和注意事項，熟悉實驗內容和方法步驟。步驟。 實驗時應遵守實驗操作規(guī)程，按教師要求，認真操作。要細心觀察實驗現(xiàn)象，認真記實驗時應遵守實驗操作規(guī)程，

3、按教師要求，認真操作。要細心觀察實驗現(xiàn)象，認真記錄實驗數(shù)據(jù)，作出結論，最后寫出實驗報告。錄實驗數(shù)據(jù)，作出結論，最后寫出實驗報告。要愛護公物，小心使用儀器和實驗設備，注意節(jié)約用水、電、藥品和器材。要愛護公物，小心使用儀器和實驗設備，注意節(jié)約用水、電、藥品和器材。所有固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。強酸、強堿必所有固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。強酸、強堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。實驗室和實驗臺應保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴并還原。實驗完畢，儀器洗實驗室和實驗臺應保持整潔。公用試劑用畢，立即

4、蓋嚴并還原。實驗完畢，儀器洗凈放好。凈放好。在實驗過程中必須遵守操作規(guī)程，不得隨意亂動亂用。如不會使用，應請教指導教在實驗過程中必須遵守操作規(guī)程，不得隨意亂動亂用。如不會使用，應請教指導教師。凡因亂動亂用違反操作規(guī)程而損壞儀器設備，造成事故者，按有關規(guī)定進行賠師。凡因亂動亂用違反操作規(guī)程而損壞儀器設備，造成事故者，按有關規(guī)定進行賠償和處理。償和處理。 嚴禁在實驗室內吃飯、吸煙、扔廢物和隨地吐痰，實驗室內學生輪流安排值日，實嚴禁在實驗室內吃飯、吸煙、扔廢物和隨地吐痰，實驗室內學生輪流安排值日，實驗結束離開實驗室之前，關好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。驗結束離開實驗室之前，關好窗戶，切斷電源，水

5、源，確保安全。試劑使用規(guī)則試劑使用規(guī)則使用試劑前應該仔細辨認標簽，看清名稱及濃度，是否為本實驗所需。使用試劑前應該仔細辨認標簽，看清名稱及濃度，是否為本實驗所需。取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。取標準溶液時，應該將標準溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標準液，以免取標準溶液時，應該將標準溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標準液，以免污染瓶中的標準液體。污染瓶中的標準液體。使用滴管時，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內。使用滴管時，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內。使用有毒試劑及強酸強堿時，盡可

6、能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿使用有毒試劑及強酸強堿時，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。用嘴吸取，以免造成意外。吸量管的使用吸量管的使用正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端。正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端。取液：用吸耳球吸取液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上取液：用吸耳球吸取液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。端。調刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體調刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至

7、最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應在一水平面上。下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應在一水平面上。放液：吸量管移入準備接受溶液的容器中，使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸放液：吸量管移入準備接受溶液的容器中，使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動流出。吸量管應最后靠壁量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動流出。吸量管應最后靠壁1515秒。秒。吸量管上端標有吸量管上端標有“吹吹”字。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶字。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為液。此類吸量管為“吹出式吹出式”，未標，未標“吹吹”字的吸量管

8、，則不必吹出管尖的殘留字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。液體。(0.5ml(0.5ml以下的都要吹）以下的都要吹）吸量管尖應接觸受器內壁，但不應插入受器內的原有液體之中，以免污染吸量管吸量管尖應接觸受器內壁，但不應插入受器內的原有液體之中，以免污染吸量管及試劑。及試劑。吸取血液、尿、組織樣品、粘稠試劑或有顏色的吸量管，用后應及時用自來水沖吸取血液、尿、組織樣品、粘稠試劑或有顏色的吸量管，用后應及時用自來水沖洗干凈。如果吸取一般試劑的吸量管可不必馬上沖洗，待實驗完畢后，用自來水洗干凈。如果吸取一般試劑的吸量管可不必馬上沖洗，待實驗完畢后，用自來水沖洗干凈，晾干備用。沖洗干凈，晾干備用。 吸量

9、管的使用注意事項吸量管的使用注意事項玻璃器皿的一般清洗方法玻璃器皿的一般清洗方法一般玻璃儀器：如試管、燒杯、錐形瓶等，先用自來水洗刷后，用洗衣粉刷洗，一般玻璃儀器：如試管、燒杯、錐形瓶等，先用自來水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自來水反復沖洗，最后用蒸餾水淋洗再用自來水反復沖洗，最后用蒸餾水淋洗2 23 3次。干燥備用。次。干燥備用。容量分析儀器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自來水沖洗，待晾干后，再用容量分析儀器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自來水沖洗，待晾干后，再用鉻酸洗液浸泡數(shù)小時，然后用自來水充分沖洗，最后用蒸餾水淋洗鉻酸洗液浸泡數(shù)小時，然后用自來水充分沖洗，最后用蒸餾水淋洗2 23 3

10、次，干燥次，干燥備用。備用。比色杯：用畢立即用自來水反復沖洗。洗不凈時，用鹽酸或適當溶劑沖洗，再用比色杯：用畢立即用自來水反復沖洗。洗不凈時，用鹽酸或適當溶劑沖洗，再用自來水沖洗。避免用堿液或強氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙布自來水沖洗。避免用堿液或強氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙布( (紙紙) )擦拭。擦拭。上述所有玻璃器材洗凈上述所有玻璃器材洗凈( (以倒置后器壁不掛水珠為干凈的標準以倒置后器壁不掛水珠為干凈的標準) )后，根據(jù)需要晾干后，根據(jù)需要晾干或烘干?；蚝娓?。 分光光度法分光光度法光是一種電磁波，通常用頻率和波長來描述光。光是一種電磁波，通常用頻率和波長來描述光。人的視覺所能感覺到

11、的光稱為可見光，波長范圍在人的視覺所能感覺到的光稱為可見光，波長范圍在400760nm，人的眼睛感覺不到的，人的眼睛感覺不到的還有紅外光（波長大于還有紅外光（波長大于760-5000000nm）、紫外光（波長）、紫外光（波長200-400nm）、）、x射線等。射線等。在可見光區(qū)，不同波長的光呈不同的顏色，但各種有色光之間并沒有嚴格的界線，而在可見光區(qū)，不同波長的光呈不同的顏色，但各種有色光之間并沒有嚴格的界線，而是由一種顏色逐漸過渡到另一種顏色。是由一種顏色逐漸過渡到另一種顏色。溶液的顏色與吸收光顏色的關系溶液的顏色與吸收光顏色的關系一般性實驗一般性實驗-1-1beer-lambert定律吸收

12、光譜法基本定律定律吸收光譜法基本定律描述物質對單色光吸收強弱與厚度和待測物濃度的關系。描述物質對單色光吸收強弱與厚度和待測物濃度的關系。含義：一束單色光通過溶液時，光能被吸收的程度與溶液的濃度和液層厚度成正比。含義：一束單色光通過溶液時，光能被吸收的程度與溶液的濃度和液層厚度成正比。akcl 或或 lgi0/i =kcla a為溶液對光的吸光度，反映了物質對光的吸收程度；為溶液對光的吸光度，反映了物質對光的吸收程度；c c為溶液濃度；為溶液濃度；l l為溶液厚度；為溶液厚度；i i0 0為照射待測物質的單色光強度，為照射待測物質的單色光強度，i i為透過待測物質光線的光強度，透光度為透過待測物

13、質光線的光強度，透光度t= i/it= i/i0 0即溶液透過光的強度與入射光的強度之比；即溶液透過光的強度與入射光的強度之比；k k為吸光系數(shù)，是物質在單位濃度和單位厚度的條件下對入射光的吸光度。為吸光系數(shù)，是物質在單位濃度和單位厚度的條件下對入射光的吸光度。實驗中溶液厚度不變，則實驗中溶液厚度不變，則a akckc光吸收示意圖光吸收示意圖i i0 0i ibc c吸收光譜和物質的定性分析吸收光譜和物質的定性分析物質的吸收光譜與物質分子結構有關。物質的吸收光譜與物質分子結構有關。吸收光譜曲線是物質的特征曲線。用各種不同波長的光線作為入射光測定物質的吸光度吸收光譜曲線是物質的特征曲線。用各種不

14、同波長的光線作為入射光測定物質的吸光度（absorbance），然后以波長（），然后以波長（）為橫軸，相應的吸光度（）為橫軸，相應的吸光度（a）為縱軸，按結果作圖，）為縱軸，按結果作圖，可得到該物質的吸收光譜曲線，這種曲線體現(xiàn)了物質對不同波長的光的吸收能力?？傻玫皆撐镔|的吸收光譜曲線，這種曲線體現(xiàn)了物質對不同波長的光的吸收能力。在一定的溫度、在一定的溫度、ph值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可找到一個或幾個吸收最大值，該處的波長稱為最大吸收波長（找到一個或幾個吸收最大值，該處的波長稱為最大吸收波長（max）。物質

15、不同，它）。物質不同，它們的最大吸收波長也往往不同。們的最大吸收波長也往往不同。不同濃度不同濃度的的vitb12溶液對相同波長的光的不同吸收溶液對相同波長的光的不同吸收g/mla 550nm原理：根據(jù)物質對于入射光的特征吸收，可應用于物質溶液的定性檢測原理：根據(jù)物質對于入射光的特征吸收，可應用于物質溶液的定性檢測比較吸收光譜曲線：在相同的條件下，吸收光譜曲線不同，表明物質的化學結構不同。比較吸收光譜曲線：在相同的條件下，吸收光譜曲線不同，表明物質的化學結構不同。比較最大吸收波長：不同物質的最大吸收波長不同；化學結構相似的物質最大吸收波長比較最大吸收波長：不同物質的最大吸收波長不同；化學結構相似

16、的物質最大吸收波長相同，吸收系數(shù)不同。相同，吸收系數(shù)不同。比較吸光度的比值：多用于檢測物質的純度（比較吸光度的比值：多用于檢測物質的純度（dna a260/a280=1.8 純度鑒定純度鑒定)物質定性分析常用方法物質定性分析常用方法物質的定量分析物質的定量分析標準曲線法標準曲線法 配制一系列不同濃度的標準溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光。測定配制一系列不同濃度的標準溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光。測定時先以空白溶液調節(jié)透光率時先以空白溶液調節(jié)透光率100%100%，然后分別測定標準系列的吸光度。以吸光度為縱坐，然后分別測定標準系列的吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為

17、橫坐標作圖得到一條通過原點的直線，叫做標準曲線（或稱標，濃度為橫坐標作圖得到一條通過原點的直線，叫做標準曲線（或稱a-ca-c曲線）。曲線）。標準管法標準管法 對個別樣品進行測定，且對個別樣品進行測定，且a-ca-c曲線線性良好直接比較測定結果。曲線線性良好直接比較測定結果。 a標標 =k標標c標標b標標 a測測 =k測測 c測測 b測測 c測測 =a測測 /a標標 c標標分光光度計的基本構造分光光度計的基本構造儀器中光源經過單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單色光（入射光）進入儀器中光源經過單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單色光（入射光）進入樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色

18、）產生光電流，放大后在測量儀上顯樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色）產生光電流，放大后在測量儀上顯示出吸光度（示出吸光度（a）或透光度（）或透光度（t）。）。光光 源源單色器單色器樣品室樣品室受光器受光器測量器測量器722722分光光度計使用方法分光光度計使用方法接通電源，打開儀器電源開關，打開樣品室蓋，預熱接通電源，打開儀器電源開關，打開樣品室蓋，預熱10min;將空白液或對照液及測定液分別裝入比色杯將空白液或對照液及測定液分別裝入比色杯3/4體積并用擦鏡紙擦凈外壁，放入樣體積并用擦鏡紙擦凈外壁，放入樣品室內品室內, 空白液一般放于最外格，樣品比色杯放入位置與試管位置對應空白液一般放于

19、最外格，樣品比色杯放入位置與試管位置對應;調好波長調好波長;調節(jié)按鈕調節(jié)按鈕 開蓋時，調開蓋時，調 t 參數(shù)參數(shù) 調為調為 100 合上蓋，調合上蓋，調 a 參數(shù)參數(shù) 調為調為 0;逐步拉出樣品室拉桿（聽到逐步拉出樣品室拉桿（聽到“咔咔”一聲），讀取吸光度值一聲），讀取吸光度值(a）;讀數(shù)完打開樣品室蓋，再將讀數(shù)寫入記錄本。讀數(shù)完打開樣品室蓋，再將讀數(shù)寫入記錄本。 722722分光光度計使用注意事項分光光度計使用注意事項樣品室蓋應輕開輕放；樣品室蓋應輕開輕放；比色皿拿其磨砂面，液體裝入約比色皿拿其磨砂面，液體裝入約3/43/4高度，并用擦鏡紙擦凈外壁，每次用完后自來水高度，并用擦鏡紙擦凈外壁，

20、每次用完后自來水沖洗干凈，倒置于濾紙上；沖洗干凈，倒置于濾紙上；倒取試劑時不能在儀器表面上方操作，儀器上請勿放任何物品；倒取試劑時不能在儀器表面上方操作，儀器上請勿放任何物品；每調換一次波長，都應將空白溶液的吸光度調至每調換一次波長，都應將空白溶液的吸光度調至“0”0”。雙縮脲法測定蛋白質含量雙縮脲法測定蛋白質含量實驗目的實驗目的了解和掌握雙縮脲測定蛋白質濃度的原理和方法了解和掌握雙縮脲測定蛋白質濃度的原理和方法。蛋白質在強堿性溶液中與稀硫酸銅溶液作用產生顏色反應，生成紫紅色化合物，蛋白質在強堿性溶液中與稀硫酸銅溶液作用產生顏色反應，生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應。稱為雙縮脲反應。 具有兩個

21、或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應，蛋白質在堿性溶液中，能具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應，蛋白質在堿性溶液中，能與與cucu2+2+形成紫紅色絡合物，顏色深淺與蛋白質濃度成正比，故可以用來測定蛋白形成紫紅色絡合物，顏色深淺與蛋白質濃度成正比，故可以用來測定蛋白質的濃度。質的濃度。 在一定的濃度范圍內，顏色的深淺與蛋白質含量呈線性關系。因此可用比色法測在一定的濃度范圍內，顏色的深淺與蛋白質含量呈線性關系。因此可用比色法測定蛋白質濃度。定蛋白質濃度。nhonhnhonhccnhonhonhcc加熱180 co+nh2222223實驗原理實驗原理紫紅色銅雙縮脲復合物分子結構紫紅色銅雙

22、縮脲復合物分子結構在分光光度法中，許多不吸收光的無色物質可以用顯色反應變成有色物質，使之能進行比在分光光度法中，許多不吸收光的無色物質可以用顯色反應變成有色物質，使之能進行比色測定，并能提高測定的靈敏度和選擇性。在比色分析或分光光度分析中，將待測組分轉色測定，并能提高測定的靈敏度和選擇性。在比色分析或分光光度分析中，將待測組分轉變成有色化合物的反應叫做顯色反應，與待測組分反應生成有色化合物的試劑叫顯色劑。變成有色化合物的反應叫做顯色反應，與待測組分反應生成有色化合物的試劑叫顯色劑。在實際分析中，同一待測組分可與多種顯色劑發(fā)生顯色反應，生成不同的有色物質。為了在實際分析中，同一待測組分可與多種顯色劑發(fā)生顯色反應，生成不同的有色物質。為了保證測定的靈敏度和準確度，在分析時常需對顯