醫(yī)學(xué)碩士畢業(yè)論文答辯幻燈參考

1、genistein后處理介導(dǎo)大鼠海馬后處理介導(dǎo)大鼠海馬ca1區(qū)區(qū)enos/nrf2/ho-1信號通路及其神經(jīng)保護(hù)作用信號通路及其神經(jīng)保護(hù)作用研研 究究 生：生：* * * * *導(dǎo)導(dǎo) 師：師：* * * * *教授教授一、研究的背景及意義一、研究的背景及意義1.1.對缺血性腦中風(fēng)發(fā)病機(jī)制及防治的研究已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)對缺血性腦中風(fēng)發(fā)病機(jī)制及防治的研究已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。注的重點(diǎn)。2.2.缺血大腦迅速獲得血液供應(yīng)是阻止缺血性神經(jīng)元損傷的首缺血大腦迅速獲得血液供應(yīng)是阻止缺血性神經(jīng)元損傷的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又進(jìn)一步加重缺血組要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又進(jìn)一步加重缺血組織的損

2、傷織的損傷-即即缺血再灌注損傷缺血再灌注損傷。3. 3. 氧化應(yīng)激和炎癥氧化應(yīng)激和炎癥是缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制的重要是缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制的重要組成部分。腦缺血再灌注早期即有大量活性氧產(chǎn)生，并迅速組成部分。腦缺血再灌注早期即有大量活性氧產(chǎn)生，并迅速啟動損傷級聯(lián)，加劇了初始損害最終導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的損啟動損傷級聯(lián)，加劇了初始損害最終導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的損傷。因此，再灌注早期阻斷氧化應(yīng)激損傷是有效降低遲發(fā)性傷。因此，再灌注早期阻斷氧化應(yīng)激損傷是有效降低遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵。神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵。4.genistein具有具有酪氨酸激酶抑制劑活性酪氨酸激酶抑制劑活性和和抗氧化作用抗氧化作用。5

3、、genistein作為酪氨酸激酶抑制劑可有效減弱短暫全作為酪氨酸激酶抑制劑可有效減弱短暫全腦缺血造成的神經(jīng)元的延遲性死亡；一個單純的氧誘腦缺血造成的神經(jīng)元的延遲性死亡；一個單純的氧誘導(dǎo)的腦缺血小鼠模型顯示導(dǎo)的腦缺血小鼠模型顯示genistein具有抗氧化活性。具有抗氧化活性。6.enos活性的升高對腦中風(fēng)具有有益作用。另研究發(fā)活性的升高對腦中風(fēng)具有有益作用。另研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)，genistein能夠誘導(dǎo)能夠誘導(dǎo)enos活性并激活核因子活性并激活核因子nf-e2相關(guān)因子相關(guān)因子(nrf2)，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)、減少心血管，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)、減少心血管疾病的發(fā)生。疾病的發(fā)生。 那么，那么，ge

4、nistein postconditioning(gpc，即缺，即缺血后給予血后給予genistein)是否能通過是否能通過enos/nrf2/are信信號通路號通路降低氧化應(yīng)激，從降低氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗缺血性神經(jīng)元損而發(fā)揮抗缺血性神經(jīng)元損傷的作用？目前尚未見報道。傷的作用？目前尚未見報道。 本研究采用四動脈結(jié)扎本研究采用四動脈結(jié)扎(4-vo)全腦缺血模型，全腦缺血模型，觀察觀察gpc對缺血性神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討其可對缺血性神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討其可能的分子機(jī)制，為臨床防治缺血性腦中風(fēng)提供理論能的分子機(jī)制，為臨床防治缺血性腦中風(fēng)提供理論依據(jù)。依據(jù)。二、材料與方法二、材料與方法1.1.主

5、要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 大鼠腦立體定位儀 大鼠腦微量注射泵 冰凍切片機(jī) 激光掃描共聚焦顯微鏡 酶標(biāo)儀 電泳設(shè)備 搖床 morris水迷宮 超低溫冰箱等 組織裂解液 bca蛋白濃度測定試劑盒 enos、p-enos、 nrf2、ho-1一抗及其相應(yīng)的二抗 nbt/bcip顯色液 neun、4-hne、8-ohdg一抗及對應(yīng)的熒光二抗 tunel試劑盒2.2.實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組spf級成年雄性級成年雄性sd大鼠大鼠隨機(jī)分組及隨機(jī)分組及4-vo模型模型shami/rveh1(ir+dmso)gpcveh2(gpc+nacl)l-name30m24hi10mi10mi10mi10mi10m3

6、0m6h1d5d椎動脈電凝并分離頸總動脈椎動脈電凝并分離頸總動脈缺血缺血尾靜脈注射尾靜脈注射genistein1mg/kg側(cè)腦室注射側(cè)腦室注射l-name1mg/5l0.9%nacl0.1%dmso3d7d9d3.3.技術(shù)路線圖技術(shù)路線圖再灌注再灌注5d檢測檢測海馬海馬ca1區(qū)神經(jīng)元區(qū)神經(jīng)元的凋亡及存活的凋亡及存活實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo)實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo)再灌注再灌注30min,6h,1d,3d 觀察觀察p-enos, nrf2,ho-1蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)免疫熒光免疫熒光染色法染色法蛋白免疫蛋白免疫印跡技術(shù)印跡技術(shù)tunel染色染色及及neun染色染色再灌注再灌注3d觀察觀察海馬海馬ca1區(qū)神區(qū)神經(jīng)元

7、經(jīng)元8-ohdg,4-hne, nrf2,ho-1蛋白的蛋白的表達(dá)及定位表達(dá)及定位 morris水迷宮水迷宮再灌注再灌注7-9d，檢測大鼠的空間檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力學(xué)習(xí)和記憶能力4.4.統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)整理后，應(yīng)用數(shù)據(jù)整理后，應(yīng)用sigmastat3.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量資料數(shù)值以均數(shù)計學(xué)分析。所有計量資料數(shù)值以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析采用單因素方差分析(anova)，多個實(shí)驗(yàn)組與一個，多個實(shí)驗(yàn)組與一個對照組比較用最小顯著差法對照組比較用最小顯著差法(lsd)，各實(shí)驗(yàn)組之間比，各實(shí)驗(yàn)組之間比較采用較采用q檢驗(yàn)檢驗(yàn)(newman

8、-keuls test)，p 0.05為差異有為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論genistein后處理是否具有神經(jīng)保后處理是否具有神經(jīng)保護(hù)作用呢？護(hù)作用呢？圖圖1 圖圖a：neun (紅色紅色) 染色染色 ：生存的神經(jīng)元；：生存的神經(jīng)元；tunel (綠色綠色)染色：凋亡樣神經(jīng)元；圖染色：凋亡樣神經(jīng)元；圖b：海馬：海馬ca1區(qū)區(qū)1mm 長度內(nèi)長度內(nèi)neun 陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖；圖陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖；圖c：海馬：海馬ca1區(qū)區(qū)1mm長度內(nèi)長度內(nèi) tunel陽性陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖; *p0.05 vs. i/r 組，組， #p0.05 vs

9、. gpc 組，組，n=5; 40, bar = 50mneun positive cell050100150200250300*#shami/rgpc l-nameabtunel positive cell050100150200250*#shami/rgpc l-namec小結(jié)小結(jié) 1 genistein后處理對缺血性神經(jīng)元損傷具有保后處理對缺血性神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，護(hù)作用，enos激酶抑制劑激酶抑制劑l-name減弱了該減弱了該作用，說明作用，說明enos可能參與了此保護(hù)作用?？赡軈⑴c了此保護(hù)作用。genistein后處理是否誘導(dǎo)后處理是否誘導(dǎo)enos激活（磷酸化）激活（磷酸化）?圖

10、圖2 gpc對對enos、p-enos蛋白表達(dá)的影響蛋白表達(dá)的影響圖圖a：再灌注不同時間點(diǎn)：再灌注不同時間點(diǎn)p-enos、enos蛋白的表達(dá)；蛋白的表達(dá)；sh：sham組；組；r：再灌注；：再灌注；： i/r組；：組；： gpc組；組；gpc: genistein后處理；圖后處理；圖b： p-enos蛋白表達(dá)統(tǒng)計圖：蛋白表達(dá)統(tǒng)計圖： n=4； *p0.05 vs. i/r組組 ab圖圖3 l-name對再灌注對再灌注3denos磷酸化水平的影響磷酸化水平的影響 圖圖a：各實(shí)驗(yàn)組再灌注：各實(shí)驗(yàn)組再灌注3 d p-enos蛋白表達(dá)；圖蛋白表達(dá)；圖b：各實(shí)驗(yàn)組再灌注：各實(shí)驗(yàn)組再灌注3 d p-eno

11、s蛋白表達(dá)統(tǒng)計圖，蛋白表達(dá)統(tǒng)計圖，n=5，*p0.05 vs. i/r 組；組；#p0.05 vs. vehicle2 組組ab小結(jié)小結(jié) 2genistein后處理可誘導(dǎo)全腦缺血大鼠海馬后處理可誘導(dǎo)全腦缺血大鼠海馬ca1區(qū)區(qū)enos磷磷酸化水平升高，酸化水平升高，enos激酶抑制劑激酶抑制劑l-name可有效降低可有效降低gpc誘導(dǎo)的誘導(dǎo)的enos磷酸化水平。磷酸化水平。結(jié)果揭示：結(jié)果揭示：enos磷酸化水平升高參與了磷酸化水平升高參與了genistein的神經(jīng)的神經(jīng)保護(hù)作用。保護(hù)作用。genistein后處理是否能有效降低后處理是否能有效降低缺血再灌注后神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損缺血再灌注后神經(jīng)元的

12、氧化應(yīng)激損傷呢傷呢? 4-hne是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，被公認(rèn)為氧化應(yīng)激最穩(wěn)定的標(biāo)記物是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，被公認(rèn)為氧化應(yīng)激最穩(wěn)定的標(biāo)記物 8-ohdg，是，是dna氧化損傷的特異產(chǎn)物氧化損傷的特異產(chǎn)物 圖圖4 全腦缺血再灌注全腦缺血再灌注3 d，各實(shí)驗(yàn)組大鼠，各實(shí)驗(yàn)組大鼠gpci/rabgpci/r圖圖a：綠色：綠色: neun； 紅色紅色: 4-hne； 圖圖b：紅色：紅色: dapi； 綠色綠色: 8-ohdg；n=4-5；40； bar =50 m小結(jié)小結(jié) 3 gpc能有效降低氧化應(yīng)激損傷；能有效降低氧化應(yīng)激損傷；enos激酶激酶抑制劑抑制劑l-name廢除了此神經(jīng)保護(hù)作用。廢除了此

13、神經(jīng)保護(hù)作用。nrf2/are信號是生物體內(nèi)抗氧化信號是生物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)最重要的內(nèi)源性防御系統(tǒng)。應(yīng)激反應(yīng)最重要的內(nèi)源性防御系統(tǒng)。那么，那么，gpc是否通過是否通過enos誘導(dǎo)了誘導(dǎo)了此信號通路此信號通路? 圖圖5 a-c gpc促進(jìn)促進(jìn)圖圖a：再灌注不同時間點(diǎn)核內(nèi)：再灌注不同時間點(diǎn)核內(nèi)nrf2蛋白表達(dá)；圖蛋白表達(dá)；圖b：再灌注不同時間點(diǎn)核內(nèi)：再灌注不同時間點(diǎn)核內(nèi)nrf2蛋白蛋白表達(dá)統(tǒng)計圖，表達(dá)統(tǒng)計圖，n=4，*p0.05 vs. i/r組；圖組；圖c：再灌注：再灌注3d 各實(shí)驗(yàn)組各實(shí)驗(yàn)組nrf2 蛋白的表達(dá)及蛋白的表達(dá)及統(tǒng)計圖；統(tǒng)計圖；*p0.001 vs. i/r組，組， #p0.00

14、1 vs.vehicle2 組組acshfold changes0.0.2.4.6.81.01.21.41.61.8i/rgpcr30m r6h r1dr3d*b圖圖5 d 綠色：綠色：nrf2 ；紅色；紅色: neun； 黃色：二者的共定位；黃色：二者的共定位；40； bar =30m.l-name圖圖6 shama value(folds vs. sham)0.0.2.4.6.81.01.21.41.6ho-1i/rvehicle2gpcl-name*#b圖圖a-b：ho-1蛋白表達(dá)及其統(tǒng)計圖；圖蛋白表達(dá)及其統(tǒng)計圖；圖c：ho-1與與nrf2蛋白的共定位，蛋白的共定位，*p0.05 vs.

15、 i/r 組；組； #p0.05 vs. vehicle2組；綠色：組；綠色：nrf2； 紅色：紅色：ho-1；藍(lán)色：；藍(lán)色：dapi ；合成；合成圖為三者的共定位；圖為三者的共定位； 40； n=4-5； bar = 50m；cl-namei/r shamgpcvehicle2l-nameho-1neuna小結(jié)小結(jié) 4 gpc可顯著增加海馬可顯著增加海馬ca1區(qū)神經(jīng)元胞核中區(qū)神經(jīng)元胞核中nrf2蛋白的表蛋白的表達(dá)并引起下游靶基因達(dá)并引起下游靶基因ho-1的表達(dá)，而的表達(dá)，而l-name阻斷了此阻斷了此作用。作用。 此結(jié)果進(jìn)一步揭示此結(jié)果進(jìn)一步揭示gpc通過通過enos誘導(dǎo)了誘導(dǎo)了nrf2/h

16、o-1抗氧化信號通路，從而阻斷了缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)抗氧化信號通路，從而阻斷了缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。元損傷。海馬是學(xué)習(xí)和記憶的重要部位，而海馬是學(xué)習(xí)和記憶的重要部位，而海馬海馬ca1區(qū)是缺血最敏感的區(qū)域。區(qū)是缺血最敏感的區(qū)域。那么，那么，gpc是否能改善大鼠缺血是否能改善大鼠缺血后空間學(xué)習(xí)記憶能力后空間學(xué)習(xí)記憶能力? 圖圖7 圖圖a-b：潛伏實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計圖；：潛伏實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計圖；n=5；*p0.05 vs.i/r組；組；#p0.05 vs.gpc 組組. 圖圖c-d：潛伏實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)大鼠游泳路程軌跡圖：潛伏實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)大鼠游泳路程軌跡圖dc7d8d9dlatency

17、time (sec)020406080shami/rgpcl-namedays after ischemia*#aquadrant occupancy(sec)010203040506070shami/rgpcl-name*#probe trial9db小結(jié)小結(jié) 5 gpc能有效的改善大鼠缺血后的空間能有效的改善大鼠缺血后的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。學(xué)習(xí)和記憶能力。四、總四、總 結(jié)結(jié)1.gpc對缺血性神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。對缺血性神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。2.gpc可通過誘導(dǎo)可通過誘導(dǎo)enos磷酸化水平并上調(diào)磷酸化水平并上調(diào)nrf2/ho-1信號通路，從而降低腦缺血誘導(dǎo)信號通路，從而降低腦缺血誘導(dǎo)的

18、氧化應(yīng)激損傷。的氧化應(yīng)激損傷。3.gpc能有效改善大鼠短暫全腦缺血后的認(rèn)能有效改善大鼠短暫全腦缺血后的認(rèn)知功能。知功能。五、不足與展望五、不足與展望1. gpc是否可增加是否可增加nrf2的的dna結(jié)合活性有待結(jié)合活性有待進(jìn)一步研究。進(jìn)一步研究。2. gpc是否也觸發(fā)了其它促生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通是否也觸發(fā)了其它促生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（如雌激素受體信號），從而起到抗缺血路（如雌激素受體信號），從而起到抗缺血性神經(jīng)元損傷的作用。其確切的機(jī)制還有待性神經(jīng)元損傷的作用。其確切的機(jī)制還有待多層面、多角度的進(jìn)一步探究。多層面、多角度的進(jìn)一步探究。六、致六、致 謝謝 實(shí)驗(yàn)和論文的最終完成是我的導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)和論文的最終完成是我的導(dǎo)師*教授精心指導(dǎo)的結(jié)教授精心指導(dǎo)的結(jié)果。謹(jǐn)借此機(jī)會，向我敬愛的恩師表示最衷