氨基酸分析-4-29

1、1第二章第二章 氨基酸分析氨基酸分析2 苯丙酮尿癥苯丙酮尿癥（PKU）是一種常見的氨基酸代謝病，）是一種常見的氨基酸代謝病，是由于是由于苯丙氨酸苯丙氨酸（Phe）代謝途徑中的酶缺陷，使得）代謝途徑中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)變成為酪氨酸，導(dǎo)致苯丙氨酸及其苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)變成為酪氨酸，導(dǎo)致苯丙氨酸及其酮酸蓄積，并從尿中大量排出。酮酸蓄積，并從尿中大量排出。 本病在遺傳性氨基酸代謝缺陷疾病中比較常見，其遺本病在遺傳性氨基酸代謝缺陷疾病中比較常見，其遺傳方式為常染色體隱性遺傳。臨床表現(xiàn)不均一，主傳方式為常染色體隱性遺傳。臨床表現(xiàn)不均一，主要臨床特征為智力低下、精神神經(jīng)癥狀、濕疹、皮要臨床特征為智力低

2、下、精神神經(jīng)癥狀、濕疹、皮膚抓痕征及色素脫失和鼠氣味等、腦電圖異常。如膚抓痕征及色素脫失和鼠氣味等、腦電圖異常。如果能得到早期診斷和早期治療，則前述臨床表現(xiàn)可果能得到早期診斷和早期治療，則前述臨床表現(xiàn)可不發(fā)生，智力正常，腦電圖異常也可得到恢復(fù)。不發(fā)生，智力正常，腦電圖異常也可得到恢復(fù)。苯丙酮尿癥（PKU）3病因病因: 苯丙氨酸是人體必需的氨基酸之一。正常人每日需要苯丙氨酸是人體必需的氨基酸之一。正常人每日需要的攝入量約為的攝入量約為200500毫克，其中毫克，其中1/3供合成蛋白，供合成蛋白，2/3則則通過肝細胞中苯丙氨酸羥化酶（通過肝細胞中苯丙氨酸羥化酶（PAH）的轉(zhuǎn)化為酪氨酸，）的轉(zhuǎn)化為酪

3、氨酸，以合成甲狀腺素、腎上腺素和黑色素等。苯丙氨酸轉(zhuǎn)化以合成甲狀腺素、腎上腺素和黑色素等。苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸的過程中，除需為酪氨酸的過程中，除需PAH外，還必須有四氫生物蝶外，還必須有四氫生物蝶呤（呤（BH4）作為輔酶參與。基因突變有可能造成相關(guān)酶）作為輔酶參與。基因突變有可能造成相關(guān)酶的活性缺陷，致使苯氨酸發(fā)生異常累積。的活性缺陷，致使苯氨酸發(fā)生異常累積。治療治療: :主要是飲食療法。開始治療的年齡愈小，效果愈好。主要是飲食療法。開始治療的年齡愈小，效果愈好。苯丙酮尿癥（PKU）1. 氨基酸是一種小分子的兩性化合物，分子質(zhì)量在氨基酸是一種小分子的兩性化合物，分子質(zhì)量在75200Da之間，其

4、化學(xué)通式為之間，其化學(xué)通式為R-CH(NH2)-COOH，在生物體，在生物體內(nèi)出現(xiàn)的氨基酸都是內(nèi)出現(xiàn)的氨基酸都是L型，僅在少數(shù)微生物來源的多肽中出型，僅在少數(shù)微生物來源的多肽中出現(xiàn)現(xiàn)D型氨基酸。型氨基酸。2. 氨基酸分析技術(shù)的發(fā)展始于氨基酸分析技術(shù)的發(fā)展始于1820年，由年，由Braconnot最早最早將甘氨酸從白明膠水解物中分離出來。將甘氨酸從白明膠水解物中分離出來。3. 色譜技術(shù)的引入為氨基酸分析打開了一扇新的大門。色譜技術(shù)的引入為氨基酸分析打開了一扇新的大門。1941年，年，Martin等運用色層法分析氨基酸，主要采用乙酰等運用色層法分析氨基酸，主要采用乙?；被嵩诠枘z柱上或濾紙上半定

5、量；隨后，化氨基酸在硅膠柱上或濾紙上半定量；隨后，Moore、Stein應(yīng)用離子交換柱直接分離游離的氨基酸，在應(yīng)用離子交換柱直接分離游離的氨基酸，在1958年，年，Spackman、Stein、Moore制造了自動化的氨基酸分析制造了自動化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進入了一個嶄新的階段，至今仍是儀，使氨基酸定量分析進入了一個嶄新的階段，至今仍是經(jīng)典的方法。經(jīng)典的方法。氨基酸分析氨基酸分析組成蛋白質(zhì)的組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸除甘氨酸外、都種氨基酸除甘氨酸外、都有一個不對稱碳原子，即有一個不對稱碳原子，即-碳碳原子原子。 - -碳原子有四個不同取代基：羧基、氨基、碳原子有四個不同取代基：羧基

6、、氨基、氫原子和氫原子和R R基團，不同氨基酸的基團，不同氨基酸的R R基團不同?；鶊F不同。每種氨基酸有每種氨基酸有D-構(gòu)型和構(gòu)型和L-構(gòu)型，蛋白質(zhì)中構(gòu)型，蛋白質(zhì)中的氨基酸都是的氨基酸都是L-構(gòu)型。構(gòu)型。RHCCOOH_NH2_氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì)氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì)6 氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì)氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì)n氨基酸是分子中氨基酸是分子中含有含有氨基和羧基氨基和羧基的一類化合物。的一類化合物。n組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有二十種。其中有組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有二十種。其中有八種八種為為人人體必需體必需氨基酸。氨基酸。n人體必需的氨基酸：人體內(nèi)不能合成，只有靠食物人體必需的氨基酸：人體內(nèi)不能合

7、成，只有靠食物供給的氨基酸供給的氨基酸。n各種蛋白質(zhì)含氨基酸的種類和數(shù)量都各不相同。各種蛋白質(zhì)含氨基酸的種類和數(shù)量都各不相同。7中文名稱英文名稱三字母縮寫單字母縮寫分子量等電點甘氨酸GlycineGlyG75.076.06丙氨酸AlanineAlaA89.096.11纈氨酸ValineValV117.156.00亮氨酸LeucineLeuL131.176.01異亮氨酸IsoleucineIleI131.176.05苯丙氨酸PhenylalaninePheF165.195.49色氨酸TryptophanTrpW204.235.89酪氨酸TyrosineTyrY181.195.64天冬氨酸Aspa

8、rtic acidAspD133.102.85組氨酸HistidineHisH155.167.60天冬酰胺AsparagineAsnN132.125.41谷氨酸Glutamic acidGluE147.133.15賴氨酸LysineLysK146.199.60谷氨酰胺GlutamineGlnQ146.155.65甲硫氨酸MethionineMetM149.215.74精氨酸ArginineArgR174.2010.76絲氨酸SerineSerS105.095.68蘇氨酸ThreonineThrT119.125.60半胱氨酸CysteineCysC121.165.05脯氨酸ProlineProP

9、115.136.302020種氨基酸的中英文名稱及縮寫種氨基酸的中英文名稱及縮寫 人體必需氨基酸人體必需氨基酸賴氨酸賴氨酸 H2N(CH2)4CHCOOH纈氨酸纈氨酸 CH3CHCHCOOH蛋氨酸蛋氨酸CH3SCH2CHCOOH蘇氨酸蘇氨酸 CH3CHCHCOOH亮氨酸亮氨酸CH3CHCH2CHCOOH苯丙氨酸苯丙氨酸 CH2CHCOOH異亮氨酸異亮氨酸CH3CH2CHCHCOOH色氨酸色氨酸 CH2CHCOOH2、幾種常見的氨基酸、幾種常見的氨基酸 名稱名稱俗稱俗稱結(jié)構(gòu)簡式結(jié)構(gòu)簡式氨基乙酸氨基乙酸-氨基丙酸氨基丙酸 -氨基氨基-苯基丙酸苯基丙酸 -氨基戊二酸氨基戊二酸 甘氨酸甘氨酸 丙氨酸丙

10、氨酸 谷氨酸谷氨酸 苯丙氨酸苯丙氨酸 CHNH2COOHCH3CH2CHNH2COOHCH2HOOCCHNH2COOHCH2COOHNH2CHH10氨基酸的分類氨基酸的分類1 1、根據(jù)氨基酸的酸堿性、根據(jù)氨基酸的酸堿性酸酸性性氨氨基基酸酸堿堿性性氨氨基基酸酸中中性性氨氨基基酸酸氨基酸氨基酸11酸性氨基酸酸性氨基酸二個羧基二個羧基一個氨基一個氨基天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸堿性氨基酸堿性氨基酸一個羧基一個羧基二個或二個以上氨基二個或二個以上氨基賴氨酸賴氨酸精氨酸精氨酸組氨酸組氨酸中性氨基酸中性氨基酸一個羧基一個羧基一個氨基一個氨基實際水溶液呈弱酸性實際水溶液呈弱酸性： 電離能力電離能力 COOH

11、 NH2122 2、根據(jù)氨基酸的化學(xué)特性、根據(jù)氨基酸的化學(xué)特性疏水性：疏水性：Ala Val Leu Ile Phe Pro Met帶電：帶電：Arg Lys Asp Glu (His)極性：極性：Ser Thr Cys Asn Gln His Tyr Trp特殊：特殊：Gly (Pro)氨基酸的分類氨基酸的分類13帶電氨基酸帶電氨基酸14極性氨基酸極性氨基酸15氨基酸的立體化學(xué)氨基酸的立體化學(xué) 由蛋白質(zhì)水解的氨基酸都為由蛋白質(zhì)水解的氨基酸都為-氨基酸，除甘氨氨基酸，除甘氨酸外，所有酸外，所有- C- C都為手性碳原子。都為手性碳原子。 天然的氨基酸均為天然的氨基酸均為L-L-氨基酸氨基酸CH

12、NH2COOHR16-CDEP修飾的修飾的Fe3O4磁微球用于手性化合拆分磁微球用于手性化合拆分圖圖3.9 不同功能化磁微球作用不同功能化磁微球作用DL-色氨酸后毛細管電泳分離圖色氨酸后毛細管電泳分離圖 (A) 以及相對應(yīng)的峰面積圖以及相對應(yīng)的峰面積圖(B)，(a) 0 , (b) 100, (c) 200, (d) 300 mg17氨基酸的理化性質(zhì)氨基酸的理化性質(zhì)v1. 溶解度溶解度v2. 熔點熔點:高高v3. 旋光性有旋光性旋光性有旋光性v4. 味感：味感：D-氨基酸大氨基酸大多帶甜味，多帶甜味，L-氨基酸有氨基酸有苦、甜、鮮、酸等四種苦、甜、鮮、酸等四種不同味感。不同味感。v 1. 兩性

13、性質(zhì)：氨基酸分子兩性性質(zhì)：氨基酸分子中含有氨基及羧基，使其中含有氨基及羧基，使其既能象酸又能象堿一樣解既能象酸又能象堿一樣解離；離；v 2. 與甲醛作用：與甲醛作用：v 3. 與與2,4-二硝基氟苯作用：二硝基氟苯作用：v 4. 與茚三酮的作用：與茚三酮的作用：v 5. 與異硫酸苯酯的作用：與異硫酸苯酯的作用：v 6. 與熒光胺的作用：與熒光胺的作用：v 7. 與與5,5-雙硫基雙硫基-雙雙(硝基硝基苯甲酸苯甲酸)反應(yīng)反應(yīng)18等電點等電點概念：概念：將氨基酸水溶液的酸堿度加以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，使氨基將氨基酸水溶液的酸堿度加以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，使氨基酸的酸性電離程度與堿性電離程度相等。此時，氨基酸帶酸的酸性

14、電離程度與堿性電離程度相等。此時，氨基酸帶有的正電荷數(shù)目和負電荷數(shù)目相等，此溶液的有的正電荷數(shù)目和負電荷數(shù)目相等，此溶液的pH值稱為值稱為氨基酸的等電點，用氨基酸的等電點，用 pI 表示。表示。在等電點時，氨基酸的溶解度最小，易沉淀在等電點時，氨基酸的溶解度最小，易沉淀等電點可用酸堿滴定方法測定，也可通過等電點可用酸堿滴定方法測定，也可通過pK值計算值計算側(cè)鏈無解離基團時：側(cè)鏈無解離基團時：pI=(pK1+pK2)/2側(cè)鏈有解離基團時側(cè)鏈有解離基團時, pI相當(dāng)于氨基酸的兩性離子狀態(tài)相當(dāng)于氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團兩側(cè)的基團pK值和的一半值和的一半19pH = pI凈電荷為零凈電荷為零在電

15、場中不移動在電場中不移動pH pI帶負電荷帶負電荷等電點等電點要使氨基酸達到等電狀態(tài)：要使氨基酸達到等電狀態(tài)：中性氨基酸：中性氨基酸： pI pH 7 pI pH 7 加少量酸加少量酸酸性氨基酸：酸性氨基酸： pI pH 7 pI pH 7 pI pH 7 加堿加堿20與茚三酮的顯色反應(yīng)與茚三酮的顯色反應(yīng)OOOOH2OOOHOHCHNH2COOHROOOHOHOOOHHRCHONH3水合茚三酮水合茚三酮CO221OOOHHOOOHHNH3OONOO藍紫色化合物藍紫色化合物 根據(jù)根據(jù)COCO2 2的量或藍紫色的深淺程度的量或藍紫色的深淺程度 作為作為-氨基酸定量分析的依據(jù)。氨基酸定量分析的依據(jù)。

16、與茚三酮的顯色反應(yīng)與茚三酮的顯色反應(yīng)22氨基酸的斑點分析氨基酸的斑點分析nn 大多數(shù)氨基酸不含有特征發(fā)色基團。因此，氨基酸的分大多數(shù)氨基酸不含有特征發(fā)色基團。因此，氨基酸的分析依賴于析依賴于衍生化反應(yīng)衍生化反應(yīng)。n對衍生化試劑的要求是對衍生化試劑的要求是反應(yīng)快反應(yīng)快，并且，并且 產(chǎn)物與試劑本身產(chǎn)物與試劑本身的的光譜性質(zhì)有明顯的差異光譜性質(zhì)有明顯的差異。n常用的衍生化試劑常用的衍生化試劑有有2 2，4-4-二硝基氟二硝基氟 苯、熒光胺苯、熒光胺及鄰苯二甲醛等。及鄰苯二甲醛等。n根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì)的不同，衍生化試劑可分為根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì)的不同，衍生化試劑可分為顯色顯色劑劑及及熒光衍生化試劑熒光衍生化試劑兩大

17、類。兩大類。23斑點顯色分析法斑點顯色分析法nn 茚三酮茚三酮是氨基酸的斑點顯色分析中非常簡單的是氨基酸的斑點顯色分析中非常簡單的衍生化試劑。衍生化試劑。nn 它可以與它可以與一級和二級胺一級和二級胺在酸性介質(zhì)中在酸性介質(zhì)中pHpH（3 34 4）加熱反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生氨、二氧化碳和加熱反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生氨、二氧化碳和藍藍- -紫色的紫色的絡(luò)合物絡(luò)合物。一級和二級胺的檢測波長分別為。一級和二級胺的檢測波長分別為570570和和440nm440nm。若二者同時存在，一般在。若二者同時存在，一般在500 nm500 nm處測定，處測定，靈敏度有所降低。靈敏度有所降低。24nn另一種常用的顯色反應(yīng)試劑是另一

18、種常用的顯色反應(yīng)試劑是2 2，4-4-二硝基氟苯二硝基氟苯，它可以與樣品中氨基酸及一級和二級胺反應(yīng)，生它可以與樣品中氨基酸及一級和二級胺反應(yīng)，生成成黃色絡(luò)合物黃色絡(luò)合物，檢測波長在，檢測波長在420nm420nm。該法測定的。該法測定的是是氨基酸的總量氨基酸的總量。斑點顯色分析法斑點顯色分析法25斑點熒光分析法斑點熒光分析法nn熒光胺熒光胺是用于氨基酸分析的高靈敏熒光衍是用于氨基酸分析的高靈敏熒光衍 生化試劑，可用于氨基酸的表面分析，如生化試劑，可用于氨基酸的表面分析，如 薄層色譜。薄層色譜。nn鄰苯二甲醛（鄰苯二甲醛（OPAOPA）是用于氨基酸熒光分是用于氨基酸熒光分 析的另一種常見的衍生化

19、試劑。析的另一種常見的衍生化試劑。26色譜方法測定氨基酸色譜方法測定氨基酸離子交換色譜法離子交換色譜法反相色譜分析法反相色譜分析法液相色譜液相色譜-質(zhì)譜法質(zhì)譜法毛細管電泳法毛細管電泳法氣相色譜法氣相色譜法27離子交換色譜法離子交換色譜法nn離子交換色譜的離子交換色譜的基本原理基本原理是基于帶電荷的陰陽離是基于帶電荷的陰陽離 子與帶相反電荷的離子交換基團的相互作用。子與帶相反電荷的離子交換基團的相互作用。nn氨基酸、肽和蛋白質(zhì)在溶液中帶電荷，可與離子氨基酸、肽和蛋白質(zhì)在溶液中帶電荷，可與離子 交換基團產(chǎn)生靜電作用而保留。交換基團產(chǎn)生靜電作用而保留。nn其其固定相固定相應(yīng)具有分離效能高、物化性質(zhì)穩(wěn)

20、定、柱應(yīng)具有分離效能高、物化性質(zhì)穩(wěn)定、柱 容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和 構(gòu)象完好。構(gòu)象完好。28nn陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂：強酸型磺酸化的：強酸型磺酸化的 聚苯乙烯聚苯乙烯- -二乙烯基苯共聚物。二乙烯基苯共聚物。nn陰離子交換樹脂：陰離子交換樹脂：只有在特殊情況下只有在特殊情況下 用于強酸性氨基酸的分析。用于強酸性氨基酸的分析。離子交換色譜法離子交換色譜法291 1、直接檢測法、直接檢測法 離子交換色譜法用于氨基酸分析時，可在離子交換色譜法用于氨基酸分析時，可在200nm200nm處對各種氨基酸進行直接檢測，檢出限處對各種氨基酸進

21、行直接檢測，檢出限在在1 110 pmol10 pmol之間。之間。30（1 1）選擇性差選擇性差：生物樣品中多種內(nèi)源：生物樣品中多種內(nèi)源 性成分在性成分在200 nm200 nm處均有吸收；處均有吸收；（2 2）背景高背景高：HPICHPIC常用的各種溶劑在常用的各種溶劑在 200 nm 200 nm處也有吸收。處也有吸收。直接檢測的缺點直接檢測的缺點312 2、柱后衍生化法、柱后衍生化法nn衍生化是將氨基酸衍生為有利于測定或分離的化合物。衍生化是將氨基酸衍生為有利于測定或分離的化合物。nn大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團，無法直接用紫外大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團，無法直接用紫外法檢測

22、，需要先將氨基酸衍生為具有法檢測，需要先將氨基酸衍生為具有較強紫外較強紫外或或熒光吸熒光吸收收的衍生物。的衍生物。nn為了提高靈敏度及選擇性，一般采用柱后衍生化，再用為了提高靈敏度及選擇性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或熒光法對產(chǎn)物進行檢測。紫外或熒光法對產(chǎn)物進行檢測。nn常用衍生化試劑：茚三酮、鄰苯二甲醛、熒光胺。常用衍生化試劑：茚三酮、鄰苯二甲醛、熒光胺。32柱后衍生化法的優(yōu)點柱后衍生化法的優(yōu)點1 1、幾乎不需要樣品處理步驟，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以、幾乎不需要樣品處理步驟，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以直接進樣分析直接進樣分析；2 2、反應(yīng)產(chǎn)物與副產(chǎn)物的混合物、反應(yīng)產(chǎn)物與副產(chǎn)物的混合物無需分離無需分離；3

23、 3、離子色譜柱的穩(wěn)定性高，因而樣品間的、離子色譜柱的穩(wěn)定性高，因而樣品間的重現(xiàn)性好重現(xiàn)性好；4 4、反應(yīng)無需完成，產(chǎn)物也可以是多種。只要混合時、反應(yīng)無需完成，產(chǎn)物也可以是多種。只要混合時間及反應(yīng)產(chǎn)物的比例是一定的，則分析的重現(xiàn)性間及反應(yīng)產(chǎn)物的比例是一定的，則分析的重現(xiàn)性就不會受到影響。就不會受到影響。5 5、對反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性要求低，因為反應(yīng)及檢測幾、對反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性要求低，因為反應(yīng)及檢測幾乎是同時進行的。乎是同時進行的。33氨基酸分析儀氨基酸分析儀 原理：原理：采用經(jīng)典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生采用經(jīng)典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生法，對蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分

24、含量進行法，對蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分含量進行分析。分析。 兩種系統(tǒng)：兩種系統(tǒng)：蛋白水解分析系統(tǒng)（鈉鹽系統(tǒng)）和游離氨基酸蛋白水解分析系統(tǒng)（鈉鹽系統(tǒng)）和游離氨基酸分析系統(tǒng)（鋰鹽系統(tǒng)），利用不同濃度和分析系統(tǒng)（鋰鹽系統(tǒng)），利用不同濃度和pH值的檸檬酸值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進行梯度洗脫。鈉鹽系統(tǒng)一次最多分析約鈉或檸檬酸鋰進行梯度洗脫。鈉鹽系統(tǒng)一次最多分析約25種氨基酸；鋰鹽系統(tǒng)一次最多分析約種氨基酸；鋰鹽系統(tǒng)一次最多分析約50種氨基酸。種氨基酸。 分析效果：分析效果：靈敏度（最低檢測限）比靈敏度（最低檢測限）比HPLC柱前衍生方法柱前衍生方法稍低以外（稍低以外（HPLC：0.5pmol；氨

25、基酸分析儀：；氨基酸分析儀：10pmol)，其他如分離度、重現(xiàn)性、操作簡便性、運行成本等方面，其他如分離度、重現(xiàn)性、操作簡便性、運行成本等方面，都優(yōu)于其他分析方法。都優(yōu)于其他分析方法。35氨基酸分析儀氨基酸分析儀日立日立71807180全自動生化儀全自動生化儀樣品的制備樣品的制備（一）蛋白質(zhì)的水解（二）游離氨基酸樣品的制備（三）生理體液樣品的前處理（一）蛋白質(zhì)的水解（一）蛋白質(zhì)的水解 用于全氨基酸測定的樣品，凡是以蛋白質(zhì)形式存在的都要進行水解處理，水解方法有三種：1、酸水解法：標(biāo)準(zhǔn)水解法，水解徹底，但色氨酸被破壞。2、堿水解法：用NaOH作為水解劑，色氨酸不被破壞，但有消旋作用，絲氨酸、蘇氨酸

26、等被破壞。3、酶水解法：水解條件溫和，無需特殊設(shè)備，氨基酸不受破環(huán)，但水解時間長，而且不易水解完全。（二）游離氨基酸樣品的制備（二）游離氨基酸樣品的制備 游離氨基酸的樣品在分析前必需進行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白、脫色等處理。在進行分析前建議使用C18小柱處理一下。（三）生理體液樣品的處理（三）生理體液樣品的處理 生理體液的樣品首先要除去樣品中的蛋白質(zhì)，獲得游離氨基酸。除去蛋白質(zhì)化學(xué)方法為： 1、苦味酸法 2、三氯乙酸法 3、乙醇沉淀法 4、磺基水楊酸法（常用的方法）41反相色譜分析法反相色譜分析法nn反相色譜法是以反相色譜法是以表面非極性載體為固定表面非極性載體為固定 相相，以極性，以極

27、性溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式。溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式。nn反相色譜分析法的反相色譜分析法的效率效率比離子色譜法比離子色譜法高高；nn用于氨基酸分析一般采用用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化柱前衍生化。衍生化不僅可。衍生化不僅可以提高氨基酸被檢測的信號強度，而且可以提高氨基以提高氨基酸被檢測的信號強度，而且可以提高氨基酸的疏水性，從而可以用反相色譜法進行分離。酸的疏水性，從而可以用反相色譜法進行分離。42HPLCHPLC法測定復(fù)合氨基酸膠囊中氨基酸的含量法測定復(fù)合氨基酸膠囊中氨基酸的含量43HPLCHPLC法測定復(fù)合氨基酸膠囊中氨基酸的含量法測定復(fù)合氨基酸膠囊中氨基酸的含量44

28、45HPLC-蒸發(fā)光散射法蒸發(fā)光散射法46反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測定氨基酸對比反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測定氨基酸對比47反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測定氨基酸對比反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測定氨基酸對比48反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測定氨基酸對比反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測定氨基酸對比49液質(zhì)聯(lián)用法液質(zhì)聯(lián)用法大多數(shù)氨基酸本身不具有紫外吸收大多數(shù)氨基酸本身不具有紫外吸收, 也不發(fā)射熒光也不發(fā)射熒光, 不能直不能直接檢測；接檢測； 傳統(tǒng)的氨基酸分析方法為離子交換色譜法傳統(tǒng)的氨基酸分析方法為離子交換色譜法, 該方法操作繁瑣該方法操作繁瑣, 成本高成

29、本高;目前多用反相高效液相色譜法目前多用反相高效液相色譜法, 分析周期至少需要分析周期至少需要半小時以上半小時以上, 后來發(fā)展起來高效毛細管電泳法。后來發(fā)展起來高效毛細管電泳法。 雖然有較雖然有較大改進大改進, 但仍需要采用化學(xué)衍生技術(shù)及梯度洗脫以提高其分但仍需要采用化學(xué)衍生技術(shù)及梯度洗脫以提高其分離、檢測性能離、檢測性能, 衍生化的缺點是費時費力而且損害準(zhǔn)確性衍生化的缺點是費時費力而且損害準(zhǔn)確性, 而且而且 完全依靠保留時間來定性完全依靠保留時間來定性, 準(zhǔn)確度不高；準(zhǔn)確度不高；LC -MS聯(lián)用技術(shù)利用三級四極質(zhì)譜儀的分離和定性能力聯(lián)用技術(shù)利用三級四極質(zhì)譜儀的分離和定性能力, 提供了可靠的、

30、精確的相對分子量和結(jié)構(gòu)信息提供了可靠的、精確的相對分子量和結(jié)構(gòu)信息, 顯著提高了顯著提高了準(zhǔn)確度、靈敏度準(zhǔn)確度、靈敏度, 操作非常簡單操作非常簡單 , 節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時間和分節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時間和分析時間析時間。50液質(zhì)聯(lián)用法液質(zhì)聯(lián)用法51液相色譜液相色譜 - -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析1818種游離氨基酸種游離氨基酸5253nn毛細管電泳具有毛細管電泳具有微量微量、靈敏靈敏和和柱效高柱效高的的 特點，特點，適合于氨基酸適合于氨基酸手性分離手性分離和復(fù)雜樣和復(fù)雜樣 品中的氨基酸品中的氨基酸分析。分析。nn用于氨基酸分析的毛細管電泳主要采用用于氨基酸分析的毛細管電泳主要采用 兩種分兩種分離

31、模式：離模式：毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳和和膠束電動毛細管電膠束電動毛細管電泳泳。nn檢測方式主要有檢測方式主要有紫外法紫外法和和熒光法熒光法。毛細管電泳法毛細管電泳法54nn毛細管電泳法可以進行毛細管電泳法可以進行柱前、柱內(nèi)和柱后衍生化柱前、柱內(nèi)和柱后衍生化。nn柱內(nèi)衍生化柱內(nèi)衍生化要求反應(yīng)速度快，一般采用串聯(lián)或要求反應(yīng)速度快，一般采用串聯(lián)或 “夾心餅夾心餅”兩種形式，具有兩種形式，具有試劑和樣品用量少試劑和樣品用量少的的 優(yōu)點。優(yōu)點。nn柱后衍生化柱后衍生化可以避免柱前或柱內(nèi)衍生化時其他可以避免柱前或柱內(nèi)衍生化時其他 化合物對衍生反應(yīng)的干擾，缺點是柱后反應(yīng)裝化合物對衍生反應(yīng)的干擾，缺點是

32、柱后反應(yīng)裝 置體積大，會引起色譜峰變寬而降低分離效果。置體積大，會引起色譜峰變寬而降低分離效果。毛細管電泳法毛細管電泳法55毛細管電泳法快速測定血清中游離氨基酸毛細管電泳法快速測定血清中游離氨基酸56毛細管電泳法快速測定血清中游離氨基酸毛細管電泳法快速測定血清中游離氨基酸57毛細管電泳法快速測定血清中游離氨基酸毛細管電泳法快速測定血清中游離氨基酸58氣相色譜法氣相色譜法nn氣相色譜法分析氨基酸具有分離時間短、氣相色譜法分析氨基酸具有分離時間短、 柱效高、容易和質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點。柱效高、容易和質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點。nn氨基酸含有羧基、羥基、氨基和硫基等極氨基酸含有羧基、羥基、氨基和硫基等極 性基團，需要

33、先對其性基團，需要先對其衍生化衍生化。59nn兩步法兩步法是先將羧基用短碳鏈脂肪醇酯化，是先將羧基用短碳鏈脂肪醇酯化， 然后再用各種酸酐將然后再用各種酸酐將N-N-（OO、S S）基團乙酰）基團乙酰 化?；n一步法一步法是用烴基氯甲酰酯在水、醇類和吡是用烴基氯甲酰酯在水、醇類和吡 啶介質(zhì)中將氨基酸一步衍生化生成啶介質(zhì)中將氨基酸一步衍生化生成烴基碳烴基碳 氧酰烴基酯氧酰烴基酯。衍生化方法衍生化方法60氨基酸選擇性反應(yīng)的分析方法氨基酸選擇性反應(yīng)的分析方法1 1、顯色分析法、顯色分析法2 2、熒光法、熒光法3 3、微生物方法、微生物方法4 4、酶分析法、酶分析法61顯色分析法顯色分析法nn有幾種顯色試劑只有當(dāng)干擾物預(yù)先除去后有幾種顯色試劑只有當(dāng)干擾物預(yù)先除去后才有定量分析的價值。才有定量分析的價值。 nn在有些情況下可以通過改變試劑的組成或在有些情況下可以通過改變試劑的組成或反應(yīng)條件以便進行某一種氨基酸的選擇性反應(yīng)條件以便進行某一種氨基酸的選擇性測定。測定。62熒光法熒光法nn色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在