藥物質(zhì)量控制中現(xiàn)代分析方法的進(jìn)展

1、第二十一章第二十一章 藥物質(zhì)量控制中現(xiàn)代分析方法的進(jìn)展藥物質(zhì)量控制中現(xiàn)代分析方法的進(jìn)展第一節(jié) 毛細(xì)管電泳分析法一、簡(jiǎn)介1、定義： 在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱(chēng)之為電泳電泳。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳。 2、 HPCE的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)： (1) 毛細(xì)管中心與外界的距離很短，電泳產(chǎn)生的焦耳熱很快被散去，有效防止電泳條帶的擴(kuò)散。 (2)

2、分析速度快、分離效率高 (3) 電極液用量少，不破壞生物樣品，檢測(cè)靈敏度高，用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-19g (4) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，自動(dòng)化程度高。二、毛細(xì)管電泳儀三、主要分離模式1、毛細(xì)管區(qū)帶電泳 主要用于離子狀態(tài)存在的樣品（1）分離原理 幾個(gè)基本概念：n偶電層 (Electric Double Layer，簡(jiǎn)稱(chēng)EDL)n電滲流：在高電壓下，由于液固界面的雙電層的存在，組成擴(kuò)散層的陽(yáng)離子向負(fù)極移動(dòng)，導(dǎo)致毛細(xì)管中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱(chēng)為電滲流，用EOF表示,其速度表示為 eo表示。n電泳淌度：溶質(zhì)在給定緩沖溶液中，單位時(shí)間在單位電場(chǎng)下移動(dòng)的距離。用ep表示，其速度用ep

3、表示。 n表觀淌度 ap：實(shí)際測(cè)得的電泳有效淌度和電滲流淌度的矢量和 apap= = efef+ + EOFEOFn表觀遷移速度：離子在實(shí)際分離過(guò)程中的遷移速度 ap=ap E（2）各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： + =電滲流 + +ef 陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致； - =電滲流 - -ef 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反； 0 =電滲流 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；2、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC） 主要用于電中性物質(zhì)的分離n分離原理：在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成膠束，被分離的物質(zhì)的水和膠束兩相分配，各溶質(zhì)因分配系數(shù)差異而被分離n3、毛細(xì)管凝膠電泳（CGE） 是毛細(xì)管自由溶

4、液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式 ，用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子的大小分離。主要用于分析蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子。4、毛細(xì)管等速電泳5、毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦電泳6、毛細(xì)管電色譜（CEC) CE與HPLC的有機(jī)結(jié)合。CEC可看成是CZE的空毛細(xì)管被色譜固定相填充、涂布或鍵和的結(jié)果，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電壓，以電滲流代替高壓泵推動(dòng)流動(dòng)相。第二節(jié) 質(zhì)譜（Mass Spectrum, MS） 定義：質(zhì)譜法是通過(guò)將樣品轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)的氣態(tài)離子并按質(zhì)荷比(MZ)大小進(jìn)行分離并記錄其信息的分析方法。第二節(jié) 超高效液相色譜及其應(yīng)用一、超高效液相色譜（ ultra performance liqu

5、id chromatography, UPLC) 一種基于小顆粒填料的液相色譜技術(shù)。 n 要求：高效快速的分析n 對(duì)液相色譜技術(shù)的要求也不斷提高，單從技術(shù)角度的改進(jìn)已經(jīng)不行，或者說(shuō)必須從理論高度對(duì)液相色譜重新認(rèn)識(shí)。由此，UPLC（超高效液相色譜）概念得以提出，將HPLC的極限作為自己的起點(diǎn)。 二、理論基礎(chǔ)n在高效液相色譜速率理論中， Van Deemter方程式的簡(jiǎn)化表達(dá)式：n如果僅考慮固定相的粒度 對(duì) 的影響，其簡(jiǎn)化方程式可表達(dá)為：首先顆粒度越小柱效越高；其次每個(gè)顆粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最后，首先顆粒度越小柱效越高；其次每個(gè)顆粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最后，更小的顆粒度使最高

6、柱效點(diǎn)向更高流速（線(xiàn)速度）方向移動(dòng)，而且有更寬的線(xiàn)速度更小的顆粒度使最高柱效點(diǎn)向更高流速（線(xiàn)速度）方向移動(dòng)，而且有更寬的線(xiàn)速度范圍。所以范圍。所以降低顆粒度不但提高柱效，同時(shí)也提高速度降低顆粒度不但提高柱效，同時(shí)也提高速度。使用更高的流速會(huì)受到色。使用更高的流速會(huì)受到色譜柱填料耐壓及儀器耐壓的限制。反之，如果不用到最佳流速，小顆粒度填料的高譜柱填料耐壓及儀器耐壓的限制。反之，如果不用到最佳流速，小顆粒度填料的高柱效就無(wú)法體現(xiàn)。另外，更高的柱效需要更小的系統(tǒng)體積（死體積）、更快的檢測(cè)柱效就無(wú)法體現(xiàn)。另外，更高的柱效需要更小的系統(tǒng)體積（死體積）、更快的檢測(cè)速度等一系列條件的支持，否則小顆粒度填料的

7、高柱效同樣無(wú)法充分體現(xiàn)。速度等一系列條件的支持，否則小顆粒度填料的高柱效同樣無(wú)法充分體現(xiàn)。 要真正創(chuàng)建一個(gè)全新的分離科學(xué)領(lǐng)域 UPLC，必須解決以下問(wèn)題： 1）要解決小顆粒填料的耐壓?jiǎn)栴}，第二要解決小顆粒填料的裝填問(wèn)題，包括顆粒度的分布以及色譜柱的結(jié)構(gòu)。 2）高壓溶劑輸送單元（超過(guò)15000psi）。 3）完善的系統(tǒng)整體性設(shè)計(jì)，降低整個(gè)系統(tǒng)的體積，特別是死體積。并解決超高壓下的耐壓及滲漏問(wèn)題。 4） 快速自動(dòng)進(jìn)樣器，降低進(jìn)樣的交叉污染。 5）高速檢測(cè)器；優(yōu)化流動(dòng)池以解決高速檢測(cè)及擴(kuò)散問(wèn)題。 6）系統(tǒng)控制及數(shù)據(jù)管理，解決高速數(shù)據(jù)的采集、儀器的控制問(wèn)題。 三、UPLC技術(shù)與特點(diǎn)（1）新型色譜填料及

8、裝填技術(shù)雜化顆粒技術(shù)（雜化顆粒技術(shù)（Hybrid Particle Technology HPT）Waters公司的公司的ACQUITY UPLCTM使用了更嚴(yán)格的篩使用了更嚴(yán)格的篩分技術(shù)使分技術(shù)使1.7祄填料的分布很祄填料的分布很窄，并且使用了全新篩板（專(zhuān)窄，并且使用了全新篩板（專(zhuān)利申請(qǐng)中）及其他色譜柱硬件利申請(qǐng)中）及其他色譜柱硬件（柱管及其連接件），在超過(guò)（柱管及其連接件），在超過(guò)20000psi的壓力下裝填。的壓力下裝填。（2）超高壓液相色譜泵（3）自動(dòng)進(jìn)樣器為了降低死體積、減少交叉污染，自動(dòng)進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)使用了許多新技術(shù)，例如針內(nèi)針樣品探頭、壓力輔助進(jìn)樣等等。n減少死體積，降低譜減少死體

9、積，降低譜帶擴(kuò)展帶擴(kuò)展n快速自動(dòng)取樣快速自動(dòng)取樣n低擴(kuò)散、低交叉污染低擴(kuò)散、低交叉污染外針刺破密封，內(nèi)針插入樣品容器底部吸取樣品可達(dá)到外針刺破密封，內(nèi)針插入樣品容器底部吸取樣品可達(dá)到微量取樣（微量取樣（L取樣）取樣）（4）高速檢測(cè)器UPLC光導(dǎo)檢測(cè)器流通池示意圖光導(dǎo)檢測(cè)器流通池示意圖四、UPLC的特點(diǎn)分析速度快分析速度快靈敏度高靈敏度高分離度好分離度好超高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)0.000.040.080.120.160.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.001. Thiourea - 0.4302. toluene - 1.0343. p

10、ropylbenzene - 1.7424. butylbenzene - 2.4135. hexylbenzene - 5.058 樣品的組份數(shù)：樣品的組份數(shù)：55m顆粒度顆粒度完全分離時(shí)間：完全分離時(shí)間：6.00分鐘分鐘0.200.241. Thiourea - 0.0462. toluene - 0.0883. propylbenzene - 0.1374. butylbenzene - 0.1825. hexylbenzene - 0.360UPLCAU0.000.100.20Minutes0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60

11、UPLCHPLC樣品的組份數(shù)：樣品的組份數(shù)：51.7m顆粒度顆粒度完全分離的時(shí)間：完全分離的時(shí)間：0.60分鐘分鐘UPLC的速度提高了！增加了樣品的通量0.00AU使用使用1.7m1.7m顆粒度的填顆粒度的填料增加靈敏度料增加靈敏度可看到更多可看到更多的樣品信息的樣品信息AU0.0000.0040.0080.0120.0160.020Minutes1.701.801.902.002.102.202.302.402.502.601.7 mAU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00AU0.0

12、000.0100.0200.0300.0400.0505.0 m0.024恒定柱長(zhǎng)時(shí)；恒定柱長(zhǎng)時(shí)；UPLCUPLC的靈敏度提高的靈敏度提高1.71.7倍（倍（170%170%）?。示例：第三節(jié) 手性HPLC技術(shù)與應(yīng)用一、手性藥物拆分的高效液相色譜法分類(lèi) 1. 間接法拆分對(duì)映異構(gòu)體即衍生化試劑法間接法拆分對(duì)映異構(gòu)體即衍生化試劑法（CDR） 2. 直接法拆分對(duì)映異構(gòu)體直接法拆分對(duì)映異構(gòu)體 手性固定相法（手性固定相法（CSP） 手性流動(dòng)相添加劑法（手性流動(dòng)相添加劑法（CMP） 采用非手性固定相采用非手性固定相二、拆分原理及特點(diǎn)1. CDR(R) SE +(R) SA (R) SE (R) SA

13、(S) SA (R) SE (S) SA n手性衍生化特點(diǎn)：需要高光學(xué)純度的手性衍生化試劑；反應(yīng)繁瑣費(fèi)時(shí)；衍生化反應(yīng)速率重現(xiàn)性較差只需使用價(jià)格便宜、柱效較高的非手性柱衍生化過(guò)程可同時(shí)純化樣品2. 手性流動(dòng)相拆分法（CMP） 又稱(chēng)手性添加劑法，這種拆分法是在流動(dòng)相中加入手性試劑，利用手性試劑與各對(duì)映體結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)不同，以及藥物與結(jié)合物在固定相上分配系數(shù)的不同來(lái)進(jìn)行分離。此法不需昂貴的手性柱，亦無(wú)須進(jìn)行柱前衍生，手性添加劑可視要求而更換，使用比較方便。 其中主要應(yīng)用的有：配體交換型手性添加劑、環(huán)糊精添加劑、手性離子對(duì)添加劑。 3. 手性固定相拆分法（CSP） 利用手性固定相與對(duì)映體消旋物相互作用

14、，其中一個(gè)與手性固定相生成不穩(wěn)定的短暫的對(duì)映體復(fù)合物，使兩種異構(gòu)體在色譜柱上的保留時(shí)間不同，從而得到分離。 用于色譜分離的手性固定相已經(jīng)被大量研究，已有100多種液相色譜固定相被商業(yè)化。目前所研究的高效液相色譜手性固定相有 7大類(lèi)。 其中主要應(yīng)用的有：Pirkle型CSP、環(huán)糊精CSP、手性聚合物CSP、蛋白質(zhì)CSP 。 CSPCSP種類(lèi)種類(lèi)作用機(jī)理作用機(jī)理應(yīng)用應(yīng)用Pirkle型型CSP 主要有主要有 -堿型（帶推電子取代基）堿型（帶推電子取代基）手性固定相、手性固定相、-酸型（帶吸電子取代酸型（帶吸電子取代基）手性固定相，以及氨基酸類(lèi)手性基）手性固定相，以及氨基酸類(lèi)手性固定相固定相氨基酸、氨

15、基酸、 乙內(nèi)酰脲、乙內(nèi)酰脲、 內(nèi)酰脲、內(nèi)酰脲、 胺類(lèi)、胺類(lèi)、 醇類(lèi)及硫醇類(lèi)藥物對(duì)映醇類(lèi)及硫醇類(lèi)藥物對(duì)映體體拆分拆分環(huán)糊精環(huán)糊精CSP 環(huán)糊精的手性識(shí)別主要來(lái)自環(huán)內(nèi)腔環(huán)糊精的手性識(shí)別主要來(lái)自環(huán)內(nèi)腔對(duì)芳烴或脂對(duì)芳烴或脂 肪烴類(lèi)側(cè)鏈的包容作肪烴類(lèi)側(cè)鏈的包容作用，用， 以及環(huán)外殼上的羥基與藥物對(duì)以及環(huán)外殼上的羥基與藥物對(duì)映體分子發(fā)生氫鍵作用映體分子發(fā)生氫鍵作用一環(huán)糊精：適用于大多數(shù)藥物一環(huán)糊精：適用于大多數(shù)藥物一環(huán)糊精：適用于相對(duì)分子質(zhì)一環(huán)糊精：適用于相對(duì)分子質(zhì) 量小于量小于200的藥物的藥物一環(huán)糊精：適用于較大相對(duì)分一環(huán)糊精：適用于較大相對(duì)分 子質(zhì)量藥物子質(zhì)量藥物手性聚合物手性聚合物CSP一類(lèi)：天然

16、的多糖衍生物一類(lèi)：天然的多糖衍生物纖維素和纖維素和直鏈淀粉直鏈淀粉另一類(lèi)：高分子化合物另一類(lèi)：高分子化合物 對(duì)醇、酸、酮、酯、含對(duì)醇、酸、酮、酯、含P或或S的的藥物有良好的手性識(shí)別能力。藥物有良好的手性識(shí)別能力。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)CSP 可識(shí)別藥物對(duì)映體在蛋白質(zhì)的結(jié)合可識(shí)別藥物對(duì)映體在蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)而達(dá)到手性分離位點(diǎn)而達(dá)到手性分離 可直接分離許多藥物，如硫噴可直接分離許多藥物，如硫噴妥因、妥因、 心得怡及阻滯劑等心得怡及阻滯劑等CSP的特點(diǎn) 適用范圍廣 制備分離方便 定量分析的可靠性高 價(jià)格昂貴第四節(jié) 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要問(wèn)題有兩大方面：1、如何實(shí)現(xiàn)接口，降低壓力使色譜柱的出口與質(zhì)譜的進(jìn)樣系統(tǒng)連

17、接，達(dá)到兩部分速度的匹配；2、除去色譜中大量的流動(dòng)相分子。n分子分離器連接 （主要用于填充柱）從氣相色譜來(lái)的載氣和樣品離子經(jīng)一小孔加速?lài)娚淙雵娚淝恢?，小分子的載氣由于擴(kuò)散速度較快，被真空泵抽除，而被測(cè)物分子量大將在慣性作用下繼續(xù)直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)而進(jìn)入捕捉器。n直接連接法（主要用于毛細(xì)管柱）在色譜柱和離子源之間用長(zhǎng)約50cm，內(nèi)徑0.5mm的不銹鋼毛細(xì)管連接，色譜流出物經(jīng)過(guò)毛細(xì)管全部進(jìn)入離子源，這種接口技術(shù)樣品利用率高。n開(kāi)口分流連接該接口是放空一部分色譜流出物，讓另一部分進(jìn)入質(zhì)譜儀，通過(guò)不斷流入清洗氦氣，將多余流出物帶走。此法樣品利用率低。一、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）二、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-

18、MS)n關(guān)鍵是LC 和MS 之間的接口裝置。n目前廣泛使用的是大氣壓電離(Atmosphere pressure Ionization，API)源包括: A. 電噴霧電離(Electrospray Ionization，ESI)源 B.大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI)電噴霧電離源（ESI)電噴霧離子化分為三個(gè)過(guò)程:形成帶電液滴溶劑蒸發(fā)和液滴碎裂形成氣相離子毛細(xì)管2-4kV離子從液滴表面蒸發(fā)出來(lái)-+-+-含各種離子的液滴-+-+-+-+-隨著液滴的揮發(fā),電荷密度增大, 離子集中到液滴表面+-+-+-+-+-+-大氣壓化學(xué)電離源(APCI)APCI和ESI的不同點(diǎn)n離子產(chǎn)生的方式離子產(chǎn)生的方式nAPCI利用電暈放電離子化，氣相離子化。nESI利用離子蒸發(fā)，液相離子化。n能被分析的化合物類(lèi)型不同能被分析的化合物類(lèi)型不同nAPCI弱極性，小分子化合物，且具有一定的揮發(fā)性nESI極性化合物和生物大分子。n流速流速nESI0.001到0.25 ml/min。nAPCI0.2到2 ml/min。n多電荷nAPCI不能生成一系列多電荷離子，所以不適合分析大分子。nESI 能生成一系列多電荷離子，特別適用于蛋白，多肽類(lèi)等生物分子。三、定性與定量的方法 1、總離子流色譜圖（TIC)： tota