生物轉(zhuǎn)化小組技術(shù)報(bào)告課件

1、sdauPage 1sdau由NordriDesign提供 匯報(bào)人：張妍妍匯報(bào)人：張妍妍指導(dǎo)老師：張松指導(dǎo)老師：張松 劉新利劉新利匯報(bào)日期：匯報(bào)日期：2011-10-222011-10-22生物轉(zhuǎn)化小組技術(shù)報(bào)告生物轉(zhuǎn)化小組技術(shù)報(bào)告主要內(nèi)容主要內(nèi)容 一、薄層層析法（一、薄層層析法（TLC）二、硅膠柱層析分離二、硅膠柱層析分離sdauPage 3一、薄層層析法（一、薄層層析法（TLC）固固-液吸附色譜液吸附色譜優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，分析速度快，分析速度快； 高分辨能力，結(jié)果直觀高分辨能力，結(jié)果直觀。根據(jù)薄層層析硅膠型號(hào)分為：根據(jù)薄層層析硅膠型號(hào)分為： 硅膠硅膠 H、硅膠、硅膠 G、硅膠、硅

2、膠 HF254和和硅膠硅膠 GF254， 要求粒徑為要求粒徑為 540m。（氧化鋁）。（氧化鋁）用于小量樣品用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至幾到幾十微克，甚至0.01g）的分離的分離。 sdauPage 4TLC正相，極性大的物質(zhì)先分離出來，極性小的后分離出來。正相，極性大的物質(zhì)先分離出來，極性小的后分離出來。d1d2d12薄層色譜示意圖1： 比移值比移值Rf 小，極性強(qiáng)小，極性強(qiáng)2：比移值：比移值Rf 大，極性弱或非極性大，極性弱或非極性sdauPage 5（1）薄層板的制備薄層板的制備n 玻璃板：平整、光滑、洗凈后不附水珠。玻璃板：平整、光滑、洗凈后不附水珠。n 調(diào)漿：一般調(diào)漿：一般30g

3、硅膠加入硅膠加入100gCMC-Na水溶液（水溶液（0.3%0.5）順時(shí)針研磨，至無氣泡。順時(shí)針研磨，至無氣泡。 硅膠比例大，硅膠比例大，CMC-Na水溶液有沉淀，板易裂。水溶液有沉淀，板易裂。n 涂布：薄層要盡可能均勻光滑，厚度固定（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來確涂布：薄層要盡可能均勻光滑，厚度固定（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來確定）定）, 0.25 1mmn 存放：存放： 室溫晾干！硅膠板室溫晾干！硅膠板110活化活化30min，氧化鋁板在氧化鋁板在200 220烘烘4h ，放于干燥器中。，放于干燥器中。sdauPage 6（2）點(diǎn)樣）點(diǎn)樣n 樣品樣品的溶劑的溶劑：甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯。甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙

4、酯。含水量越小越含水量越小越好。好。n 點(diǎn)樣：點(diǎn)樣斑點(diǎn)越小越好，點(diǎn)樣：點(diǎn)樣斑點(diǎn)越小越好，直徑一般以直徑一般以2 4mm為宜為宜，可重復(fù)，可重復(fù)點(diǎn)樣。點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層。點(diǎn)樣。點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層。n 點(diǎn)樣量：點(diǎn)樣量：樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察；樣品量太多，樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察；樣品量太多，往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象，以至不易分開往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象，以至不易分開。n 電吹風(fēng)吹干或干燥器內(nèi)晾干。電吹風(fēng)吹干或干燥器內(nèi)晾干。sdauPage 7（3）展開劑的選擇及配制）展開劑的選擇及配制n 展開劑的選擇：展開劑的選擇：Rf值在值在0.150.85之間。之間。n 常用溶劑及相

5、對(duì)極性：常用溶劑及相對(duì)極性：甲醇乙醇異丙醇乙氰氯仿乙酸乙酯二氯甲烷乙醚正己烷、石油醚甲醇乙醇異丙醇乙氰氯仿乙酸乙酯二氯甲烷乙醚正己烷、石油醚 強(qiáng)極性溶劑強(qiáng)極性溶劑 中等極性溶劑中等極性溶劑 非極性溶劑非極性溶劑 強(qiáng)極性：三氯甲烷強(qiáng)極性：三氯甲烷/甲醇甲醇 弱極性：丙酮弱極性：丙酮/石油醚石油醚n 混合溶劑極性高混合溶劑極性高/ /低低=1/3=1/3（V/VV/V）n Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, MeOH/ethyl a

6、cetate, CHCl3/ethyl acetatesdauPage 8n 展開劑的配制：展開劑的配制： 新鮮配制，新鮮配制，把各組成溶劑移入分液漏斗把各組成溶劑移入分液漏斗，使，使混合液充分混勻混合液充分混勻。n 展開劑的飽和：展開劑的飽和： 雙槽的展開缸雙槽的展開缸 缸內(nèi)蒸氣飽和時(shí)間在缸內(nèi)蒸氣飽和時(shí)間在30min左右，防止邊緣效應(yīng)。左右，防止邊緣效應(yīng)。 切勿使樣點(diǎn)侵入展開劑中。放板時(shí)動(dòng)作要快。切勿使樣點(diǎn)侵入展開劑中。放板時(shí)動(dòng)作要快。 展開劑前沿上升到樣點(diǎn)上方展開劑前沿上升到樣點(diǎn)上方8 10cm時(shí)取出薄層板時(shí)取出薄層板。sdauPage 9（4）溫濕度的控制）溫濕度的控制通常溫度越低分離越

7、好通常溫度越低分離越好，用空調(diào)或冰柜控制；，用空調(diào)或冰柜控制；濕度影響板的吸附能力，在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。濕度影響板的吸附能力，在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。（5）顯色（顯色劑：）顯色（顯色劑：通用、專屬通用、專屬）n 噴霧顯色：噴霧顯色：霧化器霧化器，均勻細(xì)霧狀，均勻細(xì)霧狀n 浸漬顯色：專用玻璃器皿或玻璃缸浸漬顯色：專用玻璃器皿或玻璃缸n 蒸氣熏蒸顯色：雙槽玻璃缸（碘蒸氣顯色）蒸氣熏蒸顯色：雙槽玻璃缸（碘蒸氣顯色）（6）檢視裝置）檢視裝置 三用紫外儀三用紫外儀253.7nm下觀察下觀察sdauPage 10薄層色譜定性定量方法薄層色譜定性定量方法n 定性方法定性方法1.利用利用R

8、f定性定性：用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照：用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照2.板上化學(xué)反應(yīng)定性板上化學(xué)反應(yīng)定性：根據(jù)所用的顯色劑及顏色：根據(jù)所用的顯色劑及顏色n 定量方法定量方法1.直接定量法直接定量法：比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)的面積大小顏色及顏：比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)的面積大小顏色及顏色深淺。目視或用薄層掃描儀。色深淺。目視或用薄層掃描儀。2.間接定量法間接定量法：摳下斑點(diǎn)，洗脫，用分光光度計(jì)比色洗脫液：摳下斑點(diǎn)，洗脫，用分光光度計(jì)比色洗脫液sdauPage 11二、硅膠柱層析分離二、硅膠柱層析分離n 原理：物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同，原理：物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同， 極性大的易被吸附，吸附解吸附。極性大的易被吸附，吸附解吸附。n 硅

9、膠硅膠H的處理：的處理： 活化：活化：110 烘箱干燥烘箱干燥 l h 脫氣：加入干硅膠體積一倍的脫氣：加入干硅膠體積一倍的溶劑溶劑 注：硅膠柱不能遇水，吸引水分子形成水膜，注：硅膠柱不能遇水，吸引水分子形成水膜， 影響分離效能。影響分離效能。sdauPage 12硅膠柱分離時(shí)洗脫劑選擇：硅膠柱分離時(shí)洗脫劑選擇：n 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，嘗試比例調(diào)整。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，嘗試比例調(diào)整。n 據(jù)據(jù)TLC展開劑比例再稀釋一倍！展開劑比例再稀釋一倍！氯仿：甲醇氯仿：甲醇=9:1（18:1）n 被分離物質(zhì)為被分離物質(zhì)為弱弱極性物質(zhì)，一般選用極性物質(zhì)，一般選用弱弱極性溶劑為洗脫劑極性溶劑為洗脫劑， 被分離物質(zhì)為被分離物

10、質(zhì)為強(qiáng)強(qiáng)極性成分，則須選用極性成分，則須選用強(qiáng)強(qiáng)極性溶劑為洗脫劑。極性溶劑為洗脫劑。n 極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；n 加一點(diǎn)點(diǎn)三乙胺，氨水等堿性物質(zhì)來中和硅膠的酸性加一點(diǎn)點(diǎn)三乙胺，氨水等堿性物質(zhì)來中和硅膠的酸性n 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。 sdauPage 13裝柱（最大影響因素?。┭b柱（最大影響因素?。﹏ 濕法裝柱濕法裝柱和干法裝柱和干法裝柱，上表面一定要平整，上表面一定要平整，n 一次性傾

11、入。一次性傾入。要求填充均勻，無斷層、無縫隙、無氣泡要求填充均勻，無斷層、無縫隙、無氣泡n 硅膠的高度一般為硅膠的高度一般為15cm左右左右（長(zhǎng)、粗）（長(zhǎng)、粗）,據(jù)情況而定據(jù)情況而定 柱子徑高比一般在柱子徑高比一般在 1：510n 平衡柱子（平衡柱子（3-4個(gè)柱體積的洗脫劑）個(gè)柱體積的洗脫劑）sdauPage 14上樣上樣n 柱內(nèi)的溶劑液面降至吸附劑表層柱內(nèi)的溶劑液面降至吸附劑表層時(shí)開始上樣時(shí)開始上樣n 干法上樣：樣品溶解性差干法上樣：樣品溶解性差 樣品樣品+ +少量洗脫劑少量洗脫劑+ +少量硅膠少量硅膠 拌勻后烘干拌勻后烘干 優(yōu)點(diǎn)：樣品層較平整。優(yōu)點(diǎn)：樣品層較平整。n 濕法上樣：用濕法上樣：

12、用少量少量展開劑將樣品溶解，沿柱內(nèi)壁均勻加入。展開劑將樣品溶解，沿柱內(nèi)壁均勻加入。n 加完樣后在樣品層上再加入一層硅膠，防止沖散樣品層。加完樣后在樣品層上再加入一層硅膠，防止沖散樣品層。sdauPage 15洗脫并收集（洗脫并收集（TLC跟蹤）跟蹤）n 梯度洗脫：極性緩慢增大梯度洗脫：極性緩慢增大n 樣品收集：樣品收集： 如果如果被分離各組分有顏色，根據(jù)色層收集洗脫液。被分離各組分有顏色，根據(jù)色層收集洗脫液。 如果各組分無色，先等分收集如果各組分無色，先等分收集(自動(dòng)收集器自動(dòng)收集器)，然后用，然后用TLC逐一鑒定，再將相同組分的收集液合并在一起逐一鑒定，再將相同組分的收集液合并在一起，濃度。，濃度。 收集的例子：收集的例子：10mg上樣量，上樣量，1g硅膠硅膠H，0.5ml收一餾分；收一餾分；1-2g上樣量，上樣量，50g硅膠（硅膠（200-300目），目），20-50ml收一餾分。收一餾分。 sdauPage 16硅膠柱層析分離過程中，對(duì)洗脫液進(jìn)行硅膠柱層析分離過程中，對(duì)洗脫液進(jìn)行TLC檢測(cè)，如下：檢測(cè)，如下：sdauPage 17最后的處理：最后的處理： n 送譜分析前，用少量的