基因芯片技術及其在結核分枝桿菌檢測中的應用

1、基因芯片技術及其在結核分枝桿菌檢測中的應用摘要：基因芯片技術，是指將已知核酸序列的DNA或RNA片段作為探針，在芯 片上做成點陣，再與待測標本中的DNA或RN;片段，按照堿基互補配對原則進行雜 交，經特定軟件的分析處理， 獲取大量相關基因信息的技術。 本文對該技術及其 在結核分枝桿菌檢測中的應用進行綜述。關鍵詞：基因芯片技術；結核分枝桿菌結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病， 主要侵犯肺臟。 在某些經 濟欠發(fā)達地區(qū)，許多結核病患者因為得不到全程，合理的救治而產生結核耐藥， 這使得控制結核病的發(fā)生發(fā)展成為世界性難題。 目前，臨床實驗室采用的檢測結 核分枝桿菌的方法主要有抗酸染色法和細菌培養(yǎng)

2、法等 .2001 年康潤田 1 等應用抗 酸染色、細菌培養(yǎng)、熒光染色、PCRPCR反向探針膜雜交法，檢測59例標本(其 中，結合組 43例，對照組 16例)中的結核分支桿菌，比較分析后，陽性率( %) 結果如下圖：依上圖，可以得出的結論為：抗酸染色法簡便、實用、快捷 , 但非結核性分 枝桿菌亦可出現陽性結果； 細菌培養(yǎng)作為結核病診斷的金標準， 雖優(yōu)于抗酸染色 法，但時間比較長，影響早期用藥；熒光染色和PC是可供選擇的檢測方法，卻可 能出現假陽性和假陰性；而依賴于基因芯片的PC雜交梳法敏感性和特異性均高， 是比較準確的檢測方法 1 。1. 基因芯片基因芯片 (gene chip) 技術是隨著“人

3、類基因組計劃” (human genome project,HGP) 的進展而發(fā)展起來的 , 它是 21 世紀以來影響最深遠的重大科技進 展之一 , 是分子生物學、微電子學及物理學綜合交叉形成的高新技術。1.1 基因芯片的概念基因是指具有遺傳效應的 DNA片段，位于細胞的染色體上。我們將大量的基因片段按一定的順序固定在特定的載體上，即為基因芯片，它是專 門應用于核酸檢測的一種生物芯片。在一塊約1cm2 大小的芯片上，可固定數千甚至上萬的基因片段，由此形成一個密集的基因方陣，方便對多個基 因進行同步檢測 2 。1.2 基因芯片的優(yōu)點基因芯片作為一種先進的、大規(guī)模、高通量的檢測技術 , 正逐步成為

4、疾病診 斷的尖端技術之一 3 ，其優(yōu)點主要表現在 :一，靈敏性和準確性；二，快捷簡便 性；三，同步性。在醫(yī)學領域，醫(yī)生針對多種相似病原菌進行鑒別診斷時 , 若能 應用基因芯片技術 , 則在短時間內就能知道病人是哪種微生物感染，這對指導臨 床合理、及時、準確的用藥提供了很大的方便。1.3 基因芯片的分類： 4基因芯片有多種分類方法：1.3.1 按基因芯片所用載體材料分為： 玻璃芯片，硅芯片，陶瓷芯片；其中， 玻璃芯片因易得，熒光背景低，應用方便等優(yōu)點，被廣泛應用；1.3.2 按芯片點樣方式的分為：原位合成芯片，微距陣芯片，電定位芯片；1.3.3 按基因芯片用途分為：表達譜芯片，診斷芯片，指紋圖譜

5、芯片，測序 芯片和毒理芯片等；134按照載體所點DNA種類分為：寡核苷酸芯片和cDNA芯片，前者主要 用于基因組學及表達譜研究，后者主要用于表達譜研究 5 。1.4 基因芯片的用途基因芯片技術的準確靈敏性，同步性，所需樣本少，污染少的特點 , 使其不 僅在疾病檢測方面有廣泛應用， 在法醫(yī)學鑒定， 藥物篩選方面及環(huán)境科學方面同 樣有重要的使用價值：疾病檢測診斷方面， 基因芯片只需少量標本， 在短時間內， 即可對所需鑒別 的疾病進行同步化檢測，不僅能幫助醫(yī)生盡早做出診斷，還能減輕病人的痛苦， 一舉兩得。法醫(yī)學方面，基因芯片優(yōu)于早先的 DNA旨紋鑒定，將這些具有遺傳效應的 基因片段分析處理后， 可以

6、更準確的推斷生命體的特征， 常被應用于尸體鑒定及 親子鑒定。藥物篩選方面 7，基因芯片通過分析用藥前后機體基因表達譜的改變，來判 斷藥物的療效，省時、省力又準確。環(huán)境科學方面， 目前， 基因芯片已經應用于土壤中微生物的檢測， 水中病原 菌及毒物鑒定 8 ，如果應用恰當的話，可以解決人類日常生活中不少問題，使人 們的生活水平得到提高。1.5 基因芯片的原理基因芯片是將已知核酸序列的 DNA固定在某種載體上，然后與待測樣品中 的DNA或 RNA按照堿基互補配對原則進行雜交，再經過特定計算機軟件的處理， 獲得待測樣品的信息。如果待測樣本為RNA 般先經逆轉錄過程，形成RNA-DNA 雜交體，經RNA

7、酶的水解，變?yōu)閱捂淒NA再與已知的探針進行雜交9。1.6 基因芯片技術的主要技術環(huán)節(jié)基因芯片主要包括 4個基本技術環(huán)節(jié) 10,11 ： 1.芯片制備；2.樣品制備；3.分 子之間雜交反應； 4. 反應結果的檢測及分析。1.6.1 芯片制備： 目前，芯片的制備主要采用的載體有玻璃片或硅膠片 , 再將 DNA RNA片段或蛋白質分子按一定順序排列在載體上，形成芯片；1.6.2 樣品制備：樣品的制備和處理是該技術的第 2 個重要環(huán)節(jié)。我們所接 觸的樣品都是復雜的生物分子混合體 , 一般不能直接與基因芯片進行反應。 因此， 需要將這些混合體進行特定的生物處理,以獲取所需的DNARNA片段或蛋白質分 子

8、等，并加以標記 , 標記的方法有熒光標記法，生物素標記法、核素標記法，其 中，最常用的是熒光標記法，標記后的樣本可以提高檢測的靈敏度；1.6.3 分子之間雜交反應：此反應是芯片檢測的關鍵一步。芯片的雜交原理 與普通的核酸分子之間的雜交相同， 其優(yōu)勢在于基因芯片所需樣本量少， 雜交時 間短。為了使反應更加精確， 通常需要人為地調節(jié)反應所需的最適環(huán)境， 以減少 錯配率 , 從而獲取最能反映生物本質的信號 ；1.6.4 反應結果的檢測及分析： 目前，芯片信號檢測方法是應用芯片掃描儀 , 通過采集各反應點的熒光強弱和熒光位置 , 經過軟件分析 , 即可以獲得相關的基 因信息。1.7 基因芯片的國內外研

9、究現狀 12 鑒于基因芯片的諸多優(yōu)點，世界上的許多國家和地區(qū)都已著手進行基因芯 片的研制和開發(fā) , 美國政府于 1998 年正式啟動基因芯片計劃 , 國立衛(wèi)生研究院 (NIH) 、能源部、中央情報局等均參與了此項目。同時斯坦福大學、麻省理工學 院及部分國立實驗室如 Argonne, Oakridge 也參與了該項目的研究和開發(fā)。 英國 劍橋大學、歐亞公司也正在從事該領域的研究。 世界大型制藥公司對基因芯片技 術用于基因多態(tài)性、 疾病相關性、 基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領域感 興趣 , 也已研制或正在研制自己的芯片設備和技術設備。我國人口眾多，有著豐富的基因資源 , 由于所有疾病和遺傳信

10、息都與基因有 著密切的聯系 , 因此基因研究具有特別重要的價值 , 基因芯片技術的發(fā)展將大大 促進我國的人類基因組計劃的進程。目前國內掀起基因芯片的研究熱潮 , 聯合基 因科技集團有限公司成功地制作了國內第一塊基因表達譜芯片和 HCV診斷芯片， 并通過了由上海市科委組織的專家鑒定 ,標志著我國的芯片研究已跟上國際同行 發(fā)展的步伐 ,走向產業(yè)化進程。2基因芯片在結核分枝桿菌檢測中的應用2.1. .基因芯片對結核分枝桿菌耐藥性的研究 基因芯片對結核分枝桿菌的研究一經報道， 立即引起了國內外學者的高度重 視，成為本世紀分子生物學的研究熱點 13,14 。在結核分枝桿菌耐藥性檢測方面， 芯片技術可將所

11、有突變的探針固定到一張芯片上， 只須一次雜交， 即可獲得某一 菌株對所有藥物的敏感性結果， 因而對指導醫(yī)生合理用藥非常有價值， 并為控制 疾病的傳播提供了可能性，以下是近 12 年來各國科研人員利用結核分枝桿菌檢 測結核分枝桿菌所取得的成果 15 ：2.1.1 1998 年， Gingeras 等13利用結核分枝桿菌 rpoB 基因保守區(qū) 705bp 特異核苷酸序列探針與基因芯片進行雜交，對10 種，121 株分枝桿菌進行基因分型與菌種的鑒定。作者用 rpoB 寡核苷酸芯片技術與常規(guī)雙脫氧核苷酸測序方 法，對 10種分支桿菌種間與種內的序列多樣性進行分析，并確證了幾種特異性 單堿基多態(tài)性；2.

12、1.2 1999年Troesch等何設計的16S rRNA和rpoB基因序列芯片，鑒定 出 70 株 27 種分枝桿菌臨床分離株以及 15 株耐利福平菌株；2.1.3 2002 年張萬江等 17報道應用基因芯片技術檢測 1 株結核分枝桿菌藥 物敏感株和 4 株耐多藥株結核分枝桿菌， 基因芯片掃描結果經分析與傳統藥敏檢 測結果相符合。2.1.4 2003年崔振玲等用18芯片檢測耐異煙肼分離株katG、ahpC調節(jié)區(qū)域 和inhA調節(jié)區(qū)域的基因突變。同年，端木和運等19報道應用基因芯片檢測 20 株耐INH、RFP結核分枝桿菌臨床分離株的katG、rpoB基因突變；李胡渤等用 DNA0芯片對59株

13、耐藥結核分枝桿菌進行耐異煙肼、耐利福平基因進行檢測。2.2基因芯片技術應用于耐多藥結核病（MDR-TB檢測的現狀至今為止，經過各國科研工作者的共同努力，已經鑒定出的結核分枝桿菌耐 藥相關基因如下表21-25結核分枝桿菌耐藥相關基因抗結核藥物耐藥相關基因編碼對象利福平（RFPrpoBRNA聚合酶B亞基katG過氧化氫酶-過氧化物 酶in hA烯?；d體蛋白還原酶異煙肼（INH）ahpC烷基過氧化氫酶kasAB -酮?；\載蛋白裂合 酶oxyR氧化-應激應答反映調節(jié)蛋白oxyR吡嗪酰胺（PZA）pncA吡嗪酰胺酶乙胺丁醇（EMBembB阿拉伯糖基轉移酶鏈霉素（SMrpsL核糖體30S亞基S12蛋白

14、rrs核糖體30S亞基16SrRNA氟喹諾酮類gyrADNA回旋酶A亞基gyrBDNA回旋酶B亞基2.3 應用基因芯片技術檢測結核分枝桿菌的優(yōu)勢基因芯片法對于結核分枝桿菌的檢測，主要是針對其基因的保守片段，由于 其具有較高靈敏度和特異性，且操作簡便，完成一個檢測周期只需6-8 h,所以對 于結核病尤其是肺外結核病具有較高的診斷價值26 o3. 展望 盡管基因芯片技術發(fā)展的時間還不長，在各個科學領域還未廣泛深入，應用 過程中還存在這樣那樣不可預知的問題， 但由于其自身的諸多特性， 使得這項技 術有著巨大的潛能， 相信隨著科學工作者不斷的追求和探索， 基因芯片技術一定 會在生命科學研究領域創(chuàng)造輝煌

15、的成就。參考文獻：1. 康潤田 , 胡德華， 等 五種方法檢測臨床標本中結核分支桿菌的比較分析 中國防癆雜志 J 2001 ， 23 （1）60.2. 蔡玉梅，張素娟 基因芯片概述 中國科技信息 2005,12.3. 劉瑛 , 溫來欣 基因芯片技術在實驗室中的應用 J. 職業(yè)與健康 2008 ，24 （14）：1448-1449.4. 裘敏燕，李瑤，等 基因芯片技術及其應用 第二軍醫(yī)大學報 2001 ，22（6）5. 張輝 ，楊小潔，等 基因芯片技術及其在病原微生物檢測和研究中的應用 動物醫(yī)學進展 2009,30（12）:100-104.6. 袁建琴，高斌站，等 基因芯片技術的研究和應用 山西

16、農業(yè)大學學報 2006,5（5）.7. 江禾，王友群 基因芯片技術與藥物的研究和開發(fā) 世界臨床藥物 M 2008，02.8. 范金坪 生物芯片 技術 及其應用研究 中 國醫(yī) 學物理學雜志 J 2009 ,26 （2）： 1115-1117.9. 嚴春光，陳軍輝，等 基因芯片及其應用 中國生化藥物雜志 J 2006 ， 27 （5）：321.10. 陳忠斌 生物芯片技術 M ，北京：化學工業(yè)出版社 .2005.11. M.謝納.生物芯片技術分析M，北京：科學出版社.2004.12. 孫國波 董飚 基因芯片技術研究進展及其應用上海畜牧獸醫(yī)通訊2009,6:27-29.13. Gingeras T

17、R ， Ghandour G， Wang E， etal Simultaneous genotyping andspeciesidentification using hybridization patternrecognition analysis of genericmycobacterium DNA arraysJGenomeRe，s 1998，8（ 5）： 435448.14. Talaat A M ， Hunter P ， Johnston S A,al Genome-directed primers for selectivlabeling of bacterial transcr

18、ipts for DNmicroarray analysisJ Nat Biotechnol 2000 ， 1 8（6）： 679682 .15. 張俊仙，吳雪瓊 基因芯片技術及其在結核分枝桿菌菌種鑒定及耐藥性檢測 方面的研究進展 實用醫(yī)學雜志 J,2000 ， 25（21）:3718-3719.16. Troesch A， Nguyen H， Miyada C G， et al Mycobacterium speciesidentification and rifampin resistance testing with high density DNA probe arrays JJ Cl

19、in Microbiol， 1999， 37（ 1 ）： 495517. 張萬江， 鮑朗，等. 利用基因芯片技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的研究 J. 中華檢驗醫(yī)學雜志， 2002， 25（4）： 209.18. 崔振玲，景奉香，等用DNA芯片快速檢測結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性J. 中華檢驗醫(yī)學雜志， 2003.19. 端木和運，張鋼，等.DNA芯片法檢測耐多藥結核分支桿菌耐藥性J.臨床 醫(yī)學， 2003， 23（5）： 252620. 李胡渤，張晨曦，等.59株耐藥結核分枝桿菌DNA芯片檢測結果分析J . 醫(yī)藥論壇雜志， 2003， 24（19）： 2526.21. Banerjee A， DubnauE， QuemardA， et al.inhA ， a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosisJ.Science ， 1994， 263（514