表面增強拉曼光譜分析原理及應用

1、2021/3/171表面增強拉曼光譜分析原理及應用2021/3/172一、引言二、拉曼光譜基本理論三、拉曼光譜儀器介紹四、表面增強拉曼光譜概述五、表面增強拉曼光譜的應用六、前景展望2021/3/173一、引言 用單色光照射透明介質（氣體、液體或固體）時,絕大部分的光沿著入射光的方向透過,在透射和反射方向以外會出現(xiàn)光的散射現(xiàn)象。 當激發(fā)光的光子與作為散射中心的光子相互作用時,大部分光子只是改變方向發(fā)生散射,而光的頻率與激發(fā)光的頻率相同,這種散射稱為Rayleigh散射。 約占光散射強度的10-610-9的散射,不僅改變光的傳播方向,而且散射光的頻率不同于激發(fā)光的頻率,這種散射稱為Raman散射。

2、2021/3/174光散射的過程:激光入射到樣品,產生散射光。 散射光彈性散射（頻率不改變-瑞利散射）非彈性散射（頻率改變-拉曼散射）2021/3/1752021/3/1762、拉曼光譜基本理論2.1 拉曼光譜歷史淵源 1923年德國的Smeka理論上預言了光的非彈性散射 。 1926年印度物理學家Raman在論文中開始并沒有肯定這種散射是非彈性的,以后的許多次實驗最終證明了這種散射的非彈性,他將這種效應稱為“一種新輻射”。 1928年,Raman和Kishnan首先在液體苯中觀察到了這種散射效應。此后不久,俄國物理學家Lardsberg和MandelStam在石英中也發(fā)現(xiàn)了同樣的光散射現(xiàn)象,

3、他們稱之為“聯(lián)合散射光譜”。2021/3/1771928年,Cabanues和Rocard在巴黎也證實了Raman的觀察結果,Pringsheim撰文總結并指出Raman發(fā)現(xiàn)的是一種全新的現(xiàn)象,并建議稱之為Raman效應, 1930年42歲的Raman為此獲得了諾貝爾物理學獎,這是亞洲人獲得的第一個諾貝爾科學獎。 2021/3/1782.2拉曼光譜基本原理 拉曼光譜是單色光束入射光的光子與分子發(fā)生非彈性散射的結果。在非彈性碰撞過程中,光子與分子之間發(fā)生能量交換,光子不僅改變運動方向,同時光子的一部分能量傳遞給分子,或分子的振動和轉動能量傳遞給光子,從而改變了光子的頻率,這種散射過程稱為拉曼散射

4、。 2021/3/1792.3拉曼光譜量子理論瑞利散射:彈性碰撞,無能量交換,僅改變方向。拉曼散射:非彈性碰撞;方向改變,且有能量交換。2021/3/1710拉曼散射的兩種能量差2021/3/1711A、E=h(v0 v）產生stokes線:強;基態(tài)分子多B、E=h(v0 v)產生反stokes線:弱 Stokes與反Stokes線的頻率與入射光頻率之差v稱為Raman位移。同一種物質分子,隨著入射光頻率的改變,Raman線的頻率也改變,但位移v始終保持不變,故Raman位移與入射光頻率無關。2021/3/1712 RayleighStokesAnti-StokesResonanceRaman

5、Fluorescence2021/3/1713拉曼光譜研究分子振動和轉動模式的機理與紅外光譜的異同點? 相同點:同屬于分子光譜。兩者都是研究分子振動的重要手段。不同點:一些同核原子對稱結構的官能團(如:- C=C-、-N=N-、-S-S-等)在紅外光譜儀較難檢測的信息,在拉曼光譜儀上卻有較強的反映;而在紅外光譜中有很強吸收峰的不均衡對稱的官能團,在拉曼光譜卻表現(xiàn)很弱。 2021/3/17143、拉曼光譜儀器激光Raman光譜儀激光光源:A、He-Ne激光器,波長632.8nmB、Ar激光器波長514.5nm 488.0nm2021/3/1715傅里葉變換-Raman光譜儀光源:Nd-YAG釔鋁

6、石榴石激光器（=1064nm）2021/3/17163.1 儀器結構1、激光光源 根據所用的材料不同大致可把激光器分為氣體激光器、固體激光器、半導體激光器和燃料激光器等四大類。氣體激光器的類型最多,在拉曼光譜儀中的應用也最廣泛。它包括原子氣體激光器、離子氣體激光器、分子氣體激光器以及準分子激光器。固體激光器主要有紅寶石激光器、摻釹的釔鋁石榴石（YAG）激光器、摻釹的玻璃激光器等。這類激光器的特點是輸出功率高,并且體積小又很堅固。其YAG激光器是一種比較有用的固體激光器,其激光波長為1064nm。半導體激光器在所有的激光器中是效率最高、體積最小的一種激光器。 2021/3/17172、外光路系統(tǒng)

7、 外光路系統(tǒng)一般是指在激光器之后、單色器之前的光學系統(tǒng),它的作用是為了有效地收集拉曼散射光。在外光路系統(tǒng)中,激光器輸出的激光首先經過光柵,以消除激光中可能混有的其它波長的激光以及氣體放電的譜線（若激光無雜線時,可不用此光柵）。純化后的激光經棱鏡折光改變光路再由透鏡準確地聚焦在樣品上。樣品所發(fā)出的拉曼散射光再經聚光透鏡準確地聚集在單色儀的入射狹縫上。2021/3/17183、樣品池 由于在可見光區(qū)域內,拉曼散射不會被玻璃吸收,因此拉曼光譜的一大優(yōu)點是樣品可放在玻璃制成的各種樣品池中,這給樣品的拉曼測試帶來很大便利。樣品池可以根據實驗要求和樣品的形狀和數(shù)量而設計成不同的形狀。 2021/3/171

8、94、單色器 經樣品散射的光,其絕大部分為Rayleigh散射光,Raman散射光強度僅為Rayleigh散射光強度的10-610-9,散射光由外光路系統(tǒng)收集進入單色儀。單色儀是色散型拉曼光譜儀的心臟部分,它應具有雜散光少、色散度高等特點。為了降低Rayleigh散射光對檢測強度較弱的拉曼散射光的影響,通常采用雙單色儀,有時甚至采用三單色儀來進一步降低雜散光,提高分辨率。但光柵的反射率一般小100%,使用多光柵必然要降低光通。2021/3/17205、檢測和記錄系統(tǒng) 激光拉曼光譜儀中一般采用光電倍增管做探測器,由于拉曼散射強度很弱,這就要求光電倍增管要有高的量子效率和盡可能低的熱離子暗電流。近

9、年來,液氮冷卻的CCD型電子偶合器件探測器的使用可大大提高探測器的靈敏度。由探測器輸出的信號必須經放大,然后由記錄儀記錄或輸出到計算機上。2021/3/17213.2拉曼光譜技術優(yōu)越性1、水的拉曼散射強度很微弱,因此拉曼光譜是研究水 溶液中的生物樣品和化學化合物的理想工具。2、拉曼一次可以同時覆蓋很廣波數(shù)的區(qū)間,可對有機物及無機物等多種物質進行分析。相反,若讓紅外光譜覆蓋如此廣闊的區(qū)域則必須改變各種器件的參數(shù),相比較而言程序復雜不具有通用性。 3、拉曼光譜的譜峰清晰尖銳,適合定量研究以及運用差異分析進行定性研究。在化學結構分析中,獨立的拉曼區(qū)間的強度和功能集團的數(shù)量相關。 2021/3/172

10、24、由于激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。而且,拉曼顯微鏡物鏡可以將激光束進一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小體積的樣品。 5、利用共振拉曼效應,可以用來有選擇性地增強大生物分子特個發(fā)色基團的振動,這些發(fā)色基團的拉曼光強能被選擇性地增強1000到10000倍。2021/3/17234、表面增強拉曼光譜概述4.1 SERS的發(fā)現(xiàn) 表面增強拉曼散射現(xiàn)象第一次被觀測到,是在1979年,Fleischman小組在對粗糙化的Ag電極表面的吡啶進行研究時,發(fā)現(xiàn)其具有巨大的拉曼散射現(xiàn)象4。后來直到VanDuyne和Creighion領導

11、的兩個研究小組5,6分別重復了這個實驗并證實了這一現(xiàn)象。通過計算,這種銀電極表面的吡啶分子的拉曼信號是其水溶液的106倍。這一嶄新的現(xiàn)象被稱之為表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)。2021/3/17244.2 SERS基本原理 SERS效應可以使拉曼信號得到高達幾個數(shù)量級的增強,通常是增強來自分子的信號。SERS中信號的增強主要來自于光與金屬之間的電磁作用。這種作用會通過等離子體共振激發(fā)使得激光場得到極大的增強。要產生這一現(xiàn)象,分子必須吸附在或者非常接近金屬表面(通常最大約為10nm)。SERS的命名,能很好的總結這一效應的要點:2

12、021/3/1725Surface(S): SERS是一種表面光譜技術,因此分子必須吸附在(或者很接近)金屬表面。這是對SERS的應用來說最主要的一點。必須確保要檢測的分子“貼” 到了金屬基底的表面。Enhanced(E): 信號高達104-107的增強是由金屬基底上的等離子體共振造成的。事實上,等離子體共振是與金屬的電磁輻射作用有關的一系列效應的簡稱。另外,SERS效應中,金屬以納米結構的形式出現(xiàn),從金屬溶膠到用納米光刻制或者自組裝制備,形式變化多樣。不同的金屬,要求的粗糙度也不一樣。在可見光范圍內,Ag的粗糙度在100nm左右,有較好的增強效果8。而Cu的粗糙度在50nm,在紅外區(qū)增強最明

13、顯9。2021/3/1726Raman(R): 這項技術存在于分子(SERS探針或被分析物)信號的測量。拉曼光譜研究的是非彈性散射,能解析被探測分子的化學結構尤其是振動結構。S: 表示scattering或者spectroscopy,當強調光學效應時,用scattering;當強調光譜技術及其應用時,用spectroscopy。2021/3/17274.3 SERS機理 為了解釋 SERS 的增強機制,人們提出了不同的理論模型。由于分子的拉曼散射是分子在外電場作用下被極化而產生極化率,交變的極化率在再發(fā)射的過程中,受到分子中原子間振動的影響,從而產生拉曼散射光。散射光的增強可能是由于作用在分子

14、上的局域電場的增加和分子極化率的改變,可以形象地把分子的極化偶極矩看成是電磁效應和分子效應的乘積。目前學術界普遍認同的 SERS 機理主要有物理增強機理和化學增強機理兩類, 物理增強機制通過局域場和偶極發(fā)射起作用,化學增強機制通過分子的極化率起作用。2021/3/17284.3.1物理增加機理 物理類模型致力于闡釋金屬表面局域電場的增強,它認為,具有一定表面粗糙度的類自由電子金屬基底的存在,使得入射光在表面產生的電磁場得到較大的增強,而拉曼散射強度與分子誘導偶極矩 P 的平方成正比,因此極大地增加了吸附在表面的分子產生拉曼散射的幾率,從而提高了檢測到的表面拉曼強度。物理類模型主要包括以下幾種典

15、型模型。2021/3/1729A、表面電磁場模型 表面電磁增強模型又可稱為表面等離子體共振模型。該模型認為,在光電場作用下,金屬表面附近的電子會產生疏密振動。因此當粗糙化的襯底材料表面受到光照射時,襯底材料表面的等離子體能被激發(fā)到高的能級,而與光波的電場耦合,并發(fā)生共振,使金屬表面的電場增強,從而產生增強的拉曼散射。 2021/3/1730B、天線共振子模型 天線共振子模型是 P.Watcher 教授10在1983年提出的 SERS 增強機制理論模型。該模型認為具有一定粗糙度的金屬表面的顆粒或凸起可看作是有一定形狀,能與光波耦合的天線振子。粗糙金屬表面的突出物或各種微粒可以被看作位于電磁場中的

16、天線振子,它們既可以吸收電磁波,也可以發(fā)射電磁波。當電磁波波長和粒子尺寸之間滿足一定條件時,電磁波在粒子中將發(fā)生共振,此時輻射場最大;同時,吸附在粒子表面上分子的拉曼散射光(也是一種電磁輻射)強度也會受到天線振子的增強,從而產生 SERS 效應11。2021/3/1731C、表面鏡像場模型 表面鏡象場模型是提出得比較早的電磁增強類模型之一,鏡像場模型假定金屬表面是一面理想的鏡子,吸附分子為振動偶極子,它在金屬內產生共軛的電偶極子,以此在表面形成鏡像光電場。入射光與鏡像光電場都對吸附分子的表面拉曼信號起增強作用,再加上表面反射造成兩倍的局域電場增強,可以得到總增強效應。2021/3/1732D、

17、避雷針效應 金屬粗糙過程中產生的表面粒子形狀各不相同,一些粒子或粒子的某些部位曲率半徑非常小,這些顆粒的尖端處具有很強的局部表面電磁場。曲率半徑越小,其表面電場強度越大,從而引起拉曼散射強度的增強。2021/3/17334.3.2 化學增強機理A、電荷轉移模型 電荷轉移模型認為13:在適當波長的激光照射下,金屬中的電子被激發(fā)到電荷轉移態(tài)上去,這會引起分子原子核的骨架松弛,因為分子在基態(tài)和激發(fā)態(tài)下的平衡位置不同。當電子再回到金屬中時發(fā)射的光子能量就比入射光少了一個振動量子的能量。增強的原因是散射過程同電荷轉移態(tài)共振。2021/3/1734B、活位模型 活位模型認為:在所有吸附在金屬顆粒表面的分子

18、中,只有當其吸附在金屬顆粒表面某種特殊的位置(活位)的才能產生強的表面增強拉曼信號。 總的來說,物理類模型所涉及的分子與金屬間作用為物理吸附,具有長程效應,它的代表為 EM 模型。化學類模型強調吸附分子與金屬基底間的吸附,具有短程效應,它的代表為 CT 模型。2021/3/17355、SERS應用5.1 SERS檢測微量添加物的研究 5.1.1 中成藥中微量西藥成分的研究 中藥的熒光現(xiàn)象很強,而熒光是拉曼散射的“硬傷”,特別是在成分復雜的中藥中,西藥的光譜信號常常被強熒光遮蓋,常常表現(xiàn)為以上圖譜 。2021/3/1736 SERS可以大大降低熒光的干擾,同時將信號放大10的n次方倍。以往關于S

19、ERS的研究,大都限于研究純化合物。因為SERS的高靈敏度SERS 常常作為一種檢測器同其它經典方法聯(lián)用來檢測混合物中的各成分或某些成分,常見的聯(lián)用方法有TLC-SERS、HPLC-SERS和CE-SERS等。在混合物的SERS研究方面,一般是研究同類化合物的共存情況,且各化合物在濃度數(shù)量級上相差不遠。2021/3/1737 張雁15等人對表面增強拉曼光譜檢測中成藥中的西藥成分進行了研究。馬來酸羅格列酮和鹽酸苯乙雙胍都是常用的降糖類化學藥,也是藥品市場上常見的非法添加化學藥品種。這兩種化學藥的特點是每日服用量低,即非法添加比低,用傳統(tǒng)HPLC方法檢測消耗時間長。我們用SERS對它們的光譜進行了

20、考察,檢測速度快,結果準確,且不需對中成藥樣品進行任何分離提取,操作簡便快捷。 2021/3/1738 馬來酸羅格列酮標準品溶液的 SERS 譜圖（C=0.0003% ）2021/3/1739 添加了不同比例的馬來酸羅格列酮的中成藥水溶液的SERS 譜圖（馬來酸羅格列酮添加于中成藥中的比例:a:1%,b:0.8%,c:0.5%,d:0.3%,e:0.1%,f:0% 。2021/3/1740 鹽酸苯乙雙胍標準品溶液的 SERS 譜圖（C=0.0003% ） 2021/3/1741 添加了微量鹽酸苯乙雙胍的中成藥水溶液的 SERS 譜圖（鹽酸苯乙雙胍添加于中成藥中的比例:a:1%,b:0.8%,c

21、:0.5%,d:0.3%,e:0.1%。） 2021/3/1742鹽酸苯乙雙胍與馬來酸羅格列酮標準品混合溶液的SERS 譜（C=0.0003%） 2021/3/1743 兩種西藥添加于中成藥中的比例:a:馬來酸羅格列酮0.5%,鹽酸苯乙雙胍 0.8%;b:馬來酸羅格列酮 0.3%,鹽酸苯乙雙胍 0.5%;c:馬來酸羅格列酮 0.1%,鹽酸苯乙雙胍0.3%。 2021/3/17445.1.2 蘇丹紅的表面增強拉曼光譜 蘇丹紅原料的 SERS 圖譜(C=0.0001%) 2021/3/1745 添加了 0.05%蘇丹紅的番茄醬的 SERS 2021/3/1746 實驗初步說明,SERS用于檢測復雜

22、混合體系中的微量特定成分有其獨特的優(yōu)勢。實驗不需要對復雜樣品進行任何的前處理及提取分離,可以對其中的微量特定成分進行直接檢測,且檢測靈敏度高。整個實驗過程不需要使用有機試劑,經濟、快捷、環(huán)保。2021/3/17475.2 快速檢測牛奶中的三聚氰胺 目前,檢測三聚氰胺的國家標準檢測方法為高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法、液相色譜-質譜聯(lián)用法三種方法為三聚氰胺的檢測方法,檢測定量限分別為 2 mg/kg、0.05 mg/kg 和 0.01mg/kg16。但對牛奶收購、運輸環(huán)節(jié)的三聚氰胺現(xiàn)場快速測定需求,上述技術存在成本高、檢測周期長等缺陷?，F(xiàn)場快速測定三聚氰胺的技術成為食品安全監(jiān)管部門和生產企

23、業(yè)的需求。 趙宇翔17等人采用便攜式拉曼檢測儀,結合表面增強試劑技術,牛奶中三聚氰胺檢測限可達 2.0 mg/L,且重現(xiàn)性良好,樣品前處理簡單,檢測時間短,檢測成本低,設備操作相對簡捷,適用于食品安全監(jiān)管部門和食品生產企業(yè)。2021/3/17485.2.1 三聚氰胺的表面增強特征光譜圖 含 5mg/L 三聚氰胺的牛奶樣品的表面增強拉曼光譜 2021/3/17495.2.2 靈敏度試驗三聚氰胺梯度濃度對比試驗 樣品編號三聚氰胺濃度（mg/L) 陰性 陽性1234501.02.05.010.0-(n=15)-(n=15)-(n=0）-(n=0）-(n=0）+(n=0)+(n=0)+(n=15)+(

24、n=15)+(n=15)2021/3/17505.2.3 干擾物質和梯度濃度三聚氰胺混合牛奶標準溶液的檢測 10g/L含氮化合物和梯度濃度三聚氰胺混合牛奶標準溶液的檢測結果見下表,由實驗結果可見,三個分析人員的實驗測量結果對 2.0 mg/L 及以上濃度的樣品陽性率達 100 %。2021/3/1751 表面增強拉曼光譜快速測定牛奶中的三聚氰胺方法的檢測限為 2.0 mg/L;常見的牛奶中的尿素、亞硝酸鈉等共存物均不干擾檢測,特異性較好。該方法操作簡單,易于掌握,同時可在很短的時間內進行檢測。整個操作流程從樣品制備、檢測、到結果顯示一般可在 10 min 內完成,因此尤其適宜于現(xiàn)場篩檢。方法也

25、可適用于食品安全監(jiān)管部門和食品生產企業(yè)現(xiàn)場的三聚氰胺快速測定。2021/3/17525.3 SERS快速檢測水產品中孔雀石綠 孔雀石綠是一種人工合成的三苯甲烷類堿性染料,自20世紀30年代起就被廣泛用于漁業(yè)生產,防治水霉病。研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠易為魚類吸收并代謝為無色孔雀石綠,且孔雀石綠及其代謝產物均有毒性和致癌性。目前檢測孔雀石綠的方法很多,國家標準檢測方法為高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法,檢測定量限分別為2.0g/kg、0.5g/kg。 顧振華18等人采用便攜式拉曼檢測儀,結合表面增強試劑技術,水產品水樣中孔雀石綠檢測限可達5.0g/L,且重現(xiàn)性良好,樣品前處理簡單,檢測時間短,檢測成本

26、低,設備操作相對簡捷,適用于食品安全監(jiān)管部門和食品生產企業(yè)。2021/3/17535.3.1 孔雀石綠的表面特征拉曼光譜圖 用表面增強特征拉曼光譜技術對10g/L孔雀石綠水溶液進行測定,表面增強拉曼光譜顯示432437 cm-1,11661170 cm-1,16131617 cm-1處有孔雀石綠的特征峰,可做孔雀石綠定性檢測的依據。如432437 cm-1,11661170 cm-1,16131617 cm-1,同時出現(xiàn)波峰,且強度大于1000,則證明樣品中含有孔雀石綠。2021/3/1754含10g/L孔雀石綠水溶液的表面增強拉曼光譜 2021/3/17555.3.2 靈敏度試驗孔雀石綠梯度

27、深度對比實驗 1.02.05.010.0(n=0)(n=0)(n=15)(n=15)2021/3/17565.3.3干擾物質和梯度濃度孔雀石綠混合標準溶液的檢測（n=0)(n=15)（n=0)（n=0)（n=0)（n=0)（n=0)(n=15)(n=15)(n=15)(n=15)(n=15)2021/3/17575.3.4 水產品水樣的檢測孔雀石綠現(xiàn)場樣品檢測的結果比較 由表可見,對水產品養(yǎng)殖水中孔雀石綠總含量大于5.0g/L的水樣檢測結果均為陽性,陽性符合率達100%;對水產品未檢出(檢出限0.5g/L)孔雀石綠的水樣檢測結果均為陰性,陰性符合率達100 %。2021/3/1758 表面增強拉曼光譜快速測定養(yǎng)殖水中的孔雀石綠方法的檢測限為5.0g/L常見的水體中的尿素、亞硝酸鈉以及海水晶等共存物均不干擾檢測,特異性較好。該方法操作簡單,易于掌握,同時可在很短的時間內進行檢測。整個操作流程從樣品制備、檢測到結果顯示一般可在3 min內完成,因此尤其適宜于現(xiàn)場篩檢。方法也可適用于食品安全監(jiān)管部門和食品生產企業(yè)現(xiàn)場的孔雀石綠快速測定。2021/3/17596、前景展望 表面增強拉曼光譜技術能夠快速分析分子的結構信息,而且其強大的增強信號能夠大大提高物質的檢測限。隨著納米科學的發(fā)展和材料技術的進一步提高,表面增強拉曼光譜技術的應用會越來越廣泛 。