李勤-miRNA診斷心肌梗死的可行性

1、miRNA診斷急性心診斷急性心肌梗死的肌梗死的臨床研究臨床研究導(dǎo)導(dǎo) 師：王玉明師：王玉明 教授教授 段段 勇勇 教授教授研究生：李研究生：李 勤勤昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)專(zhuān)業(yè)Company L內(nèi)容內(nèi)容研究背景研究背景1立論依據(jù)立論依據(jù)2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀3研究目的及意義研究目的及意義4預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果6研究方案研究方案5可行性分析可行性分析7研究背景研究背景 Company Lv急性心肌梗死急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction(Acute Myocardial Infarction，AMI)AMI)即即 心肌缺血性壞死；是在冠狀動(dòng)脈病變的

2、基礎(chǔ)上，發(fā)生冠心肌缺血性壞死；是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠 狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷使得心肌嚴(yán)重而持久的缺血，狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷使得心肌嚴(yán)重而持久的缺血， 進(jìn)而引起大小不等的心肌壞死。進(jìn)而引起大小不等的心肌壞死。v急性心肌梗死分類(lèi)：急性心肌梗死分類(lèi)： 1.ST 1.ST段抬高型心肌梗死（段抬高型心肌梗死（STEMISTEMI） 2. 2.非非STST段抬高型心肌梗死（段抬高型心肌梗死（NSTEMINSTEMI）研究背景研究背景 1 JingLi, XiLi, QingWang, et al.ST-segment elevation myocardial infarction in C

3、hina from 2001 to 2011 (the China PEACE-Retrospective Acute Myocardial Infarction Study): a retrospective analysis of hospital data.The Lancet, Early Online Publication, 24 June 2014.doi:10.1016/S0140-6736(14)60921-1v近年來(lái)心血管疾病已經(jīng)超過(guò)癌癥成為威脅人類(lèi)健康的最近年來(lái)心血管疾病已經(jīng)超過(guò)癌癥成為威脅人類(lèi)健康的最 主要的疾病，心血管疾病的死亡率為主要的疾病，心血管疾病的死亡率為16

4、.7716.77，僅次于惡，僅次于惡 性腫瘤及腦血管疾病；而性腫瘤及腦血管疾??；而AMIAMI在心血管疾病中的發(fā)病率及在心血管疾病中的發(fā)病率及 死亡率最高死亡率最高11。v最新調(diào)查證實(shí)中國(guó)每最新調(diào)查證實(shí)中國(guó)每1010個(gè)成年人中就有個(gè)成年人中就有2 2個(gè)患有心血管疾個(gè)患有心血管疾 病，每年約有病，每年約有5454萬(wàn)人死于萬(wàn)人死于AMIAMI，平均每分鐘就有，平均每分鐘就有1 1人死于人死于 AMIAMI11。研究背景研究背景 2 Khan NA，HenlHlelgarn BR，Tonelli M，el a1Prognostic value of troponin T and I among as

5、ymptomaticpaticnts with endstage renal disease： a metaanalysisJCirculafion，2005，112(20)： 30883096v在臨床工作中，及時(shí)而準(zhǔn)確的診斷在臨床工作中，及時(shí)而準(zhǔn)確的診斷AMIAMI，對(duì)于迅速的回復(fù)冠，對(duì)于迅速的回復(fù)冠 狀動(dòng)脈的血流再灌注以挽救心肌，改善患者生存率至關(guān)重要。狀動(dòng)脈的血流再灌注以挽救心肌，改善患者生存率至關(guān)重要。v傳統(tǒng)的心肌酶學(xué)標(biāo)志物肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋傳統(tǒng)的心肌酶學(xué)標(biāo)志物肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋 白等，不是完全只存在于心臟，當(dāng)出現(xiàn)其他與標(biāo)志物相關(guān)的白等，不是完全只存在于心臟

6、，當(dāng)出現(xiàn)其他與標(biāo)志物相關(guān)的 疾病時(shí)也會(huì)明顯升高，容易造成誤診疾病時(shí)也會(huì)明顯升高，容易造成誤診22。v因此，有必要尋找對(duì)早期診斷因此，有必要尋找對(duì)早期診斷AMIAMI具有更高特異性的生物標(biāo)具有更高特異性的生物標(biāo) 志物。志物。立論依據(jù)v miRNAmiRNA一般通過(guò)抑制一般通過(guò)抑制mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)mRNAmRNA的降解來(lái)達(dá)到抑的降解來(lái)達(dá)到抑 制相應(yīng)基因表達(dá)的作用。每種制相應(yīng)基因表達(dá)的作用。每種miRNAmiRNA可調(diào)控多個(gè)特定靶可調(diào)控多個(gè)特定靶mRNAmRNA， 并具有組織及細(xì)胞特異性，并在各種狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞及組織并具有組織及細(xì)胞特異性，并在各種狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞及組織 功能發(fā)揮重

7、要作用功能發(fā)揮重要作用44。4 Kloosferman WP，Plasterk RHThe diverse functions of microRNAs in animal development and disease JDevCell，2006，11(4)：44l一450 v MicroRNAs(miRNA) MicroRNAs(miRNA)是一種由是一種由19192525個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性、個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性、 非編碼小非編碼小RNARNA，能夠調(diào)控基因表達(dá)，并在多種病理生理過(guò)程，能夠調(diào)控基因表達(dá)，并在多種病理生理過(guò)程 中發(fā)揮關(guān)鍵作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用33。3 Soifer HS，Ros

8、si JJ，Saetrom PMicroRNAs in disease and potential therapeutic applications J Mol Ther，2007，15(12)：20702079立論依據(jù)v研究證實(shí)在外周血或血漿中均可檢測(cè)到研究證實(shí)在外周血或血漿中均可檢測(cè)到miRNAmiRNA的存在，并在的存在，并在 各種病理狀態(tài)下發(fā)生相應(yīng)的表達(dá)變化各種病理狀態(tài)下發(fā)生相應(yīng)的表達(dá)變化55。5 Skog J，Wurdinger T，van Rijn S，et a1Gliohlastoma micmvesicles tmnsport RNA and pmteins that prom

9、ote tumour gmwth and pmvitle diagnostic biomarkers JNat Cell Biol，2008，10(12)：14701476v目前已有研究發(fā)現(xiàn)在目前已有研究發(fā)現(xiàn)在AMIAMI發(fā)生時(shí)，外周血或血漿中的某些發(fā)生時(shí)，外周血或血漿中的某些 miRNA miRNA的表達(dá)可發(fā)生相應(yīng)的變化的表達(dá)可發(fā)生相應(yīng)的變化66。6 Corsten MF，Dennert R，Jochems S，et aICircuIating microRNA一208b and microRNA一499 reflect myocardial damage in cardiovascular

10、 diseaseJ Circ Cardiovasc Genet，2010，3(6)：499506國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀MicroRNATarget GeneResultant EffectsMir-1Hand 2Reduction of ventricular myocytesMir-30Increased CTGFCardiac hypertrophyMir-126Vascular endothelialgrowth factor (VEGF)Heart valve developmentMir-133Kv4-encoded fastpotassium channelQT prolon

11、gation; reduced myocardial fibrosisMir-208Myh7Cardiac remodelingMir-320Heat Shock Protein-20Cardiac Ischemia/Reperfusion InjuryMir-374Cell Adhesion Molecule 2Coronary Artery DiseaseMir-483Myomesin (MYOM2)Interconnects major sarcomere structureMir-574Coiled-coil domain family 1Myocardial infarctionMi

12、r-499Repressed histone deacetylase-4Enhanced cardiomyocyte differentiationMir-601TPM3Tropomyosin 3Mir-1275Synaptotagmin VIIHUVEC cell shear stress研究目的及意義研究目的及意義v通過(guò)熒光定量通過(guò)熒光定量PCRPCR技術(shù)分析技術(shù)分析AMIAMI患者和健康志愿者血漿患者和健康志愿者血漿miRNAmiRNA 的表達(dá)，鑒定差異表達(dá)的的表達(dá)，鑒定差異表達(dá)的miRNAmiRNA。v比較檢測(cè)所得的比較檢測(cè)所得的miRNAmiRNA結(jié)果與傳統(tǒng)心肌酶學(xué)標(biāo)志物結(jié)果的檢結(jié)果

13、與傳統(tǒng)心肌酶學(xué)標(biāo)志物結(jié)果的檢 測(cè)準(zhǔn)確性和檢測(cè)時(shí)間。測(cè)準(zhǔn)確性和檢測(cè)時(shí)間。v判斷判斷miRNAmiRNA是否適用于臨床是否適用于臨床AMIAMI的診斷；或者是否能與傳統(tǒng)的診斷；或者是否能與傳統(tǒng) 心肌酶學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合診斷。心肌酶學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合診斷。研究方案研究方案內(nèi)容及方法內(nèi)容及方法 采用采用QIAGENQIAGEN工作站及工作站及 血清血清/ /血漿提取試劑盒血漿提取試劑盒對(duì)提取的對(duì)提取的miRNAmiRNA進(jìn)行逆進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增驗(yàn)證其表達(dá)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增驗(yàn)證其表達(dá)進(jìn)行進(jìn)行cTnIcTnI、CK-MBCK-MB檢測(cè)檢測(cè)將擴(kuò)增結(jié)果與生化結(jié)果將擴(kuò)增結(jié)果與生化結(jié)果比較判斷其診斷準(zhǔn)確性比較判斷其診斷準(zhǔn)確性生化分

14、析生化分析提取提取miRNA熒光定量熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析Company L研究方案技術(shù)路線提取提取miRmiRNANA引引物物瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證電泳驗(yàn)證熒光定量熒光定量PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增mir-30cmir-30cmir-208bmir-208bmir-374bmir-374bmir-499amir-499aSTEMISTEMI患者樣本患者樣本NSTEMINSTEMI患者樣本患者樣本穩(wěn)定心絞痛患者樣本穩(wěn)定心絞痛患者樣本不穩(wěn)定心絞痛患者樣本不穩(wěn)定心絞痛患者樣本健康志愿者樣本健康志愿者樣本生化檢測(cè)生化檢測(cè)cTnIcTnI、CK-MBCK-MB、MYOMYO結(jié)果比較分析結(jié)果比較

15、分析Company L研究方案研究方案研究患者納入標(biāo)準(zhǔn)vAMIAMI患者有心肌缺血特征；持續(xù)胸痛時(shí)間患者有心肌缺血特征；持續(xù)胸痛時(shí)間12小時(shí)。小時(shí)。vST段抬高型心肌梗死：段抬高型心肌梗死： 1、胸痛時(shí)間內(nèi)心電圖至少、胸痛時(shí)間內(nèi)心電圖至少2個(gè)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)個(gè)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高段抬高0.1 mV； 2、主要冠狀動(dòng)脈完全閉塞（如：左前降支閉塞，左回旋支閉、主要冠狀動(dòng)脈完全閉塞（如：左前降支閉塞，左回旋支閉 塞，左主干閉塞或右冠狀動(dòng)脈閉塞）；塞，左主干閉塞或右冠狀動(dòng)脈閉塞）； 3、血清、血清cTnI和和CK-MB升高超過(guò)正常參考值至少升高超過(guò)正常參考值至少3倍以上。倍以上。v非非ST段抬高型心肌梗死：段抬

16、高型心肌梗死： 1、胸痛時(shí)間內(nèi)心電圖至少、胸痛時(shí)間內(nèi)心電圖至少2個(gè)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)個(gè)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段下移段下移0.1 mV及及 （或）（或）T波倒置；波倒置； 2、主要的冠狀動(dòng)脈存在病變，但未完全閉塞；、主要的冠狀動(dòng)脈存在病變，但未完全閉塞； 3、血清、血清cTnI和和CK-MB升高超過(guò)正常參考值至少升高超過(guò)正常參考值至少2倍以上。倍以上。Company L研究方案研究方案研究患者排除標(biāo)準(zhǔn)v 1 1、嚴(yán)重肝腎功能不全；、嚴(yán)重肝腎功能不全；v 2 2、惡性腫瘤；、惡性腫瘤；v 3 3、急慢性感染性疾?。?、急慢性感染性疾病；v 4 4、自身免疫性疾病。、自身免疫性疾病。Company L研究方案研究方案mi

17、RNA檢測(cè)方法及內(nèi)參的選擇vmiRNAmiRNA的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法 1 1、基因芯片技術(shù)、基因芯片技術(shù) 2 2、Northern blotsNorthern blots技術(shù)技術(shù) 3 3、熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)技術(shù)vmiRNAmiRNA的內(nèi)參的內(nèi)參 目前發(fā)現(xiàn)在血清目前發(fā)現(xiàn)在血清/ /血漿中恒定表達(dá)的血漿中恒定表達(dá)的miRNAmiRNA為為 線蟲(chóng)線蟲(chóng)Ce_miR-39_1Ce_miR-39_1。研究方案研究方案2014年年01月月-05月月2014年年06月月-09月月2014年年09月月-12月月2015年年01月月-04月月收集臨床標(biāo)本收集臨床標(biāo)本miRNAmiRNA的提取及的提取

18、及PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析撰寫(xiě)論文及撰寫(xiě)論文及準(zhǔn)備論文答辯準(zhǔn)備論文答辯進(jìn)度安排進(jìn)度安排Company L預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果v實(shí)驗(yàn)表明mir-30c，mir-208b，mir-374b，mir-499a與cTnI和CK-MB具有相關(guān)性。vmiRNA的診斷準(zhǔn)確性高于傳統(tǒng)的心肌酶學(xué)標(biāo)志物。vmiRNA的表達(dá)程度與AMI的嚴(yán)重程度有關(guān)。v可以通過(guò)檢測(cè)miRNA將STEMI與NSTEMI進(jìn)行區(qū)分?？尚行苑治隹尚行苑治鰒實(shí)驗(yàn)室具備所需儀器設(shè)備和課題實(shí)施條件。實(shí)驗(yàn)室具備所需儀器設(shè)備和課題實(shí)施條件。vAMIAMI現(xiàn)在是臨床多發(fā)病案，標(biāo)本的來(lái)源可以保證?，F(xiàn)在是臨床多發(fā)病案，標(biāo)本的來(lái)源可以保證。v已完成了前期的病例初篩工作。已完成了前期的病例初篩工作。v已較熟練的掌握了已較熟練的掌握了miRNAmiRNA的提取、擴(kuò)增技術(shù)，效果較好。的