微生物限度方法學(xué)驗證

1、微生物限度檢查方法學(xué)驗證一、檢驗方法依據(jù)微生物計數(shù)法中國藥典2021年版四部1105;控制菌檢查法中國藥典2021年版四部1106;非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中國藥典2021年版四部1107; 抑菌效力檢查法中國藥典2021年版四部1121檢查。二、菌種、培養(yǎng)基及稀釋液表1菌種菌種名稱菌種代數(shù)菌種狀態(tài)廠家大腸埃希菌CMCC(B)441023正常浙江省食品藥品檢驗研究院金黃色葡萄球菌CMCCB260033正?？莶菅勘U菌CMCCB635013正常白色念珠菌CMCC(F)980013正常黑曲霉CMCC(F)980033正常乙型副傷寒沙門菌CMCCB500943正常表2培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱批號廠家營養(yǎng)肉湯

2、培養(yǎng)基150222北京三藥科技開發(fā)公司改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基150134北京三藥科技開發(fā)公司改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基150215北京三藥科技開發(fā)公司營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基150317北京三藥科技開發(fā)公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基150323北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽乳糖培養(yǎng)基150127北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基150214北京三藥科技開發(fā)公司四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基150416北京三藥科技開發(fā)公司MUGt養(yǎng)基150122北京三藥科技開發(fā)公司曙紅亞甲監(jiān)瓊脂培養(yǎng)基150137北京三藥科技開發(fā)公司二糖鐵瓊脂培養(yǎng)基150207北京三藥科技開發(fā)公司表3對照用培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基名稱批號廠家營養(yǎng)肉湯對照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院

3、營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院膽鹽硫乳瓊脂對照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院四硫磺酸鈉亮綠對照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院MUG寸照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院曙紅亞甲監(jiān)瓊脂對照培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院三糖鐵瓊脂對照培養(yǎng)基表4試劑試劑名稱批號級別磷酸二氫鉀130826分析純氫氧化鈉分析純氯化鈉分析純聚山梨酯80化學(xué)純95%乙 醇藥用級二甲氨基苯甲醛分析純鹽酸分析純稀釋液：(1) 緩沖液取L磷酸二氫鉀溶液250ml,加L氫氧化鈉溶液118ml,用水稀釋至1000ml，搖勻,既得。(2) %無菌氯化鈉溶

4、液取氯化鈉，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝、滅菌。(3) %( ml/ml )聚山梨酯80的無菌氯化鈉溶液取聚山梨酯80，用無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至 1000ml，濾過，分裝，滅 菌，備用。(4) 靛基質(zhì)試液取對二甲氨基苯甲醛，參加95匯醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml 徐徐滴入。三、菌液的制備1 細(xì)菌、霉菌、酵母菌 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48小時。上述培養(yǎng)物用無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液備 用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物

5、至改進(jìn)馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 7 天，參加 5ml 含 ml/ml聚山梨酯80的菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，然后吸出抱子懸液用 帶有無菌棉花的能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管用 %無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含孢子 數(shù) 50100cfu 的抱子懸液。菌液制備后假設(shè)在室溫下放置，應(yīng)在2 小時內(nèi)使用，假設(shè)保存在28C可在24小時內(nèi)使用。2 控制菌 接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24小時。用 %無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 10100cfu 的 菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在 2小時內(nèi)使用，假設(shè)保存在28C可在24小時內(nèi)使 用。四、驗證

6、內(nèi)容1 、計數(shù)方法驗證將制備好的菌懸液用 %無菌氯化鈉溶液以每 10 倍體積分別稀釋成一系列濃度菌 懸液，利用血球計數(shù)板計數(shù)，確定具體菌懸液濃度，取接近于 10cfu-100cfu 的稀釋 濃度，選取各項試驗項下的規(guī)定濃度進(jìn)行實驗。稀釋及觀察均應(yīng)在陽性室內(nèi)完成。經(jīng)過驗證當(dāng)原液稀釋至 10-6時，菌液濃度接近 100cfu/ml 。2、適用性檢查細(xì)菌、霉菌、酵母菌取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各1ml內(nèi)含菌約50100cfu ，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，混勻，凝固，置3035C培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉 1ml內(nèi)含菌約5

7、0100cfu,注入無菌平皿中取用黑曲霉時應(yīng)注意自身平安，立 即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，混勻，凝固，置 23 28C培養(yǎng)72小時，計數(shù)。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗，作為對照。其大小、形態(tài)應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致，且數(shù)量應(yīng)不小于對照培養(yǎng)基的70%細(xì)菌、霉菌及酵母菌培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱菌種名稱測試培養(yǎng)基cfu 對照培養(yǎng)基cfu 回收率%大小形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)論碟1碟2平均碟1碟2平均營養(yǎng)瓊脂拉H甘 培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌878385959997一致大小形態(tài)一致且回收率?70%符合規(guī)定金黃色 葡萄球 菌888285949896一致大小形態(tài)一致且回收率?70

8、%符合規(guī)定大腸埃希菌8386959595一致大小形態(tài)一致且回收率?70%符合規(guī)定玫瑰紅鈉拉H甘 培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌84879994一致大小形態(tài)一致且回收率?70%符合規(guī)定金黃色 葡萄球 菌9086889710199一致大小形態(tài)一致且回收率?70%符合規(guī)定大腸埃希菌88839299一致大小形態(tài)一致且回收率?70%符合規(guī)定培養(yǎng)基中細(xì)菌、霉菌、酵母菌的生長情況良好，回收率在80%且與對照培養(yǎng)基狀態(tài)一致，證明此批次培養(yǎng)基可以準(zhǔn)確的檢測出相應(yīng)微生物情況。控制菌促生長能力取大腸埃希菌菌懸液內(nèi)含菌約10100cfu，分別置于膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG 培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；取乙型副傷寒沙門菌內(nèi)含菌約1010

9、0cfu ，分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，取乙型副傷寒沙門菌內(nèi)含菌約10100cfu涂布于膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中；于 35C培養(yǎng)18小 時，同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗，作為對照，每個培 養(yǎng)基平行制備2個平皿。膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MUG&養(yǎng)基與對照管比 較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基 與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。抑制能力取金黃色葡萄球菌100 cfu左右，注入無菌平皿中，立即傾注膽鹽乳糖培養(yǎng)基、四 硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3

10、5C培養(yǎng)18小 時，應(yīng)不得有菌生長。指示能力取乙型副傷寒沙門菌10100cfu，接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基平行 制備2個平皿，混勻，凝固，置3035C培養(yǎng)18小時；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞 甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基指示能力見中乙型副傷寒沙門菌測試結(jié)果，MUGS養(yǎng)基指示能力 見中大腸埃希菌測試結(jié)果。與對照培養(yǎng)基管比擬，被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長的菌落大 小、形態(tài)特征、指示劑反映情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。控制菌培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱促牛長性 與對照比擬抑制性與對照比擬 金黃色平葡萄球菌指示性 與對照比擬 乙型副傷寒沙門菌結(jié)論菌種名稱形態(tài)大小形態(tài)大小指示 反響膽鹽乳糖培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致無生長

11、-符合 規(guī)定MUG口 養(yǎng)大腸埃希菌一致一致-一致一致一致符合 規(guī)定營養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基大腸埃希菌一致一致-符合 規(guī)定乙型副傷寒 沙門菌一致一致-符合 規(guī)定四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致無生長-符合 規(guī)定膽鹽硫乳瓊脂培 養(yǎng)基乙型副傷寒 沙門菌一致一致-一致一致一致符合 規(guī)定曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致-一致一致一致符合 規(guī)定三糖鐵瓊脂培養(yǎng) 基-一致一致一致符合 規(guī)定培養(yǎng)基的促生長性及指示性菌落生長狀態(tài)一致，抑制性均無菌落生長，說明培 養(yǎng)基適用性良好。3、抑菌性：取連續(xù)生產(chǎn)的三批樣品進(jìn)行測定細(xì)菌、霉菌、酵母菌供試液的制備：稱取本品10g,加緩沖液100ml，混勻，制成1:

12、 10的供試 液。試驗組：取大腸埃希菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和枯草芽抱桿菌菌懸 液各1ml,分別加上述供試液1ml,注入平皿中，立即傾注1520ml溫度不超過45C溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。菌液組：取上述各試驗菌液1ml,參加相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。供試品對照組：取供試液1ml,分別注入1520ml溫度不超過45C溶化的營 養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個培養(yǎng)基平行制備2個平皿?；厥章蕵?biāo)準(zhǔn)以供試品對照組為樣品空白Co、以菌液組為對照T、以試驗組為測試品C計：C-Co/T 70%細(xì)菌、霉菌及

13、酵母菌抑菌性檢測結(jié)果統(tǒng)計批號培養(yǎng)基名稱菌種培養(yǎng)時間h菌液組菌數(shù)Cfu試驗組菌數(shù)Cfu供試品對照組菌數(shù)回收率%數(shù)值平均數(shù)值平均數(shù)值平均150804營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌72848690810728895金黃色葡萄球菌7286849372829012大腸埃布困72849192728793玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌120868485001208786金黃色葡萄球菌12087858612088870大腸埃布困1208783831208483150805營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌7288859565728690金黃色葡萄球菌7285957284924大腸埃布困728189728794玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯

14、草芽抱桿菌120838587001208788金黃色葡萄球菌12086848812082850大腸埃布困120888486881208090150806營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌72879466728497金黃色葡萄球菌72838696967289966大腸埃布困72859596728697玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌12084848587001208489金黃色葡萄球菌12085908912086880大腸埃布困1208289871208585通過連續(xù)三批次不同種菌類的加樣，回收率均在90鳩上，說明本產(chǎn)品對于細(xì)菌、霉菌及酵母菌不具備抑菌性。控制菌321大腸埃希菌取10 ml供試液(制備方法同3

15、.1.1 )及大腸埃希菌菌懸液1ml(10100cfu)加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml,于35C培養(yǎng)24小時。取上述培養(yǎng)物，接種至含5ml MUGt 養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外燈下觀察，同時用未接種的MUG 培養(yǎng)基作本底對照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁參加數(shù)滴靛基質(zhì)試液。紫外燈照射時管 內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MU陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG!性；參加靛基質(zhì)試液時液面呈 玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。322沙門氏菌取10 ml供試液制備方法同3.1.1 及乙型副傷寒沙門菌1ml10100cfu，直接接種至200ml的營養(yǎng)肉湯培 養(yǎng)基中，混勻，于35C培養(yǎng)培養(yǎng)

16、24小時，取上述培 養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，35E培養(yǎng)24小時后，分別劃線接種 于膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基和曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的平板上，35C培養(yǎng)24小時。合格標(biāo)準(zhǔn)假設(shè)上述試驗檢測出試驗菌，那么按此供試液制備方法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試 品的該控制菌檢查?？刂凭志詸z查大腸埃布困試驗組+/-陰性對照組+/-MUG+ +- -靛基質(zhì)+ +- -沙門氏菌試驗組+/-陰性對照組+/-四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基+ +- -膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基+ +- -曙紅亞甲監(jiān)瓊脂對照培養(yǎng)基+ +- -三糖鐵瓊脂對照培養(yǎng)基+ +- -經(jīng)控制菌的驗證，當(dāng)樣品被1:10稀釋時，本品不具有抑菌性，可以直接采用平皿 法進(jìn)行檢驗而不對檢測結(jié)果造成假陰性的影響。五、本品微生物限度檢查方法確實定綜上所述，本品細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查采用常規(guī)平皿法，取1: 10稀釋級供試 液1ml置90m