western blot 詳解

1、垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置 電泳槽 玻璃板、梳子、加樣校準(zhǔn)架等 電轉(zhuǎn)移槽 切膠板、黑白夾板、海綿墊等 電泳儀 用途：用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中對(duì)特定目的蛋白質(zhì)的分離，定性及定量的檢測(cè)分析，是Western-blot（蛋白免疫印跡）實(shí)驗(yàn)中非常重要的部分。 Western BlotWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，白質(zhì)，“探針探針”是抗體，是抗體，“顯色顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGEPAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如例如NCNC膜膜）上，）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)

2、，且能保持電泳分離的固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體（一抗）起抗體（一抗）起免疫反應(yīng)，再與酶或免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。Western blot 實(shí)驗(yàn)原理抗原一抗生物素

3、標(biāo)記的二抗ECL發(fā)光試劑Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程SDS-PAGESDS-PAGE電泳的電泳的基本原理基本原理 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠是在PAGE凝膠中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉，含有大量帶負(fù)電荷的SO32-），SDS能破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，在含有強(qiáng)還原劑的溶液中可與蛋白質(zhì)形成SDS-SDS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合物復(fù)合物。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了，從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE膠中的遷移率主要取決于其分子量的大小。PAGEP

4、AGE：聚丙烯酰胺凝膠：聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。化學(xué)惰性強(qiáng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式： 單體：丙烯酰胺（Acr）； 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）； 催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素（AP）； 加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）； 產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚

5、丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基(free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（APTEMED）和光化學(xué)催化（核黃素TMTED）體系。一一 配配分離分離膠膠準(zhǔn)備物品：準(zhǔn)備物品： 玻璃板玻璃板 洗衣粉洗衣粉 灌膠架灌膠架 移液槍移液槍 兩個(gè)燒杯（兩個(gè)燒杯（ 1 ml 1 ml 200ul 20ul200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M 30%Acrylamide 1M （4 4度冰箱），度冰箱）， Tris-HCL Tris-HCL 溶液（溶液（PH=8.8PH=8.8）， dd

6、H2O 10%APddH2O 10%AP （-20-20冰箱）冰箱） ， TEMDTEMD（4 4度）度） ，SDSSDS（常（常溫）溫）1 1 清洗玻璃板：清洗玻璃板： 一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸洗衣粉輕輕擦洗一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用ddH2OddH2O沖洗干凈后立在通沖洗干凈后立在通風(fēng)處或烘箱中風(fēng)處或烘箱中2 2 配制分離膠：配制分離膠：玻璃板對(duì)齊后放入夾中玻璃板對(duì)齊后放入夾中加緊加緊，注意使兩玻璃板，注意使兩玻璃板對(duì)齊對(duì)齊。然后垂直。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠?？ㄔ诩茏由蠝?zhǔn)備灌膠。先配制分離膠。配方如下：

7、先配制分離膠。配方如下： 具體情況依照說(shuō)明書(shū) 灌分離膠灌分離膠：用用1ml1ml的移液槍吸取的移液槍吸取1ml1ml膠沿玻璃放出，溶液緩慢膠沿玻璃放出，溶液緩慢加入到裝配好的玻璃板中至凝膠高度為加入到裝配好的玻璃板中至凝膠高度為6cm6cm左右左右，預(yù)留，預(yù)留1.5cm1.5cm高度配制濃縮膠。高度配制濃縮膠。用用1ml1ml的移液槍吸取的移液槍吸取1ml1ml左右的左右的異丙醇，壓平異丙醇，壓平。沿。沿玻璃放出，注意速度要慢，否則膠會(huì)被沖變形。玻璃放出，注意速度要慢，否則膠會(huì)被沖變形。溫箱放置溫箱放置0.5-1h0.5-1h左右至聚合完全。左右至聚合完全。注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅

8、速灌膠，注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速灌膠， 灌灌膠速度須緩慢膠速度須緩慢，避免產(chǎn)生氣泡，避免產(chǎn)生氣泡 灌膠之上輕輕加一層異丙醇，用來(lái)壓平灌膠之上輕輕加一層異丙醇，用來(lái)壓平灌制分離膠灌制分離膠 隔絕空氣隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:8%二 配制濃縮膠準(zhǔn)備物品：準(zhǔn)備物品： 移液槍移液槍 燒杯（燒杯（ 1 ml 200ul 20ul1 ml 200ul 20ul） TipsTips：30%Acrylamide 1M 30%Acrylamide 1M （4 4度冰箱），度冰箱）， Tris-HCL Tris-HCL 溶溶液（液（PH=6.8PH=6.8），）， ddH2O 10%AP d

9、dH2O 10%AP （-20-20冰箱）冰箱） ， TEMD TEMD（4 4度）度） ，SDSSDS（常溫）（常溫）當(dāng)水和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí)，說(shuō)明膠已經(jīng)凝了。當(dāng)水和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí)，說(shuō)明膠已經(jīng)凝了。 傾倒掉膠上層的異丙醇，后用吸水紙吸干傾倒掉膠上層的異丙醇，后用吸水紙吸干。 注意注意吸水紙不要觸碰分離膠吸水紙不要觸碰分離膠10%10%的分離膠配合的分離膠配合6%6%的濃縮膠使用。配制濃縮膠，的濃縮膠使用。配制濃縮膠，配方如下：配方如下：6%的濃縮膠的濃縮膠4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1M Tris-HCL 溶液（溶液（PH=6.8） 1.02m

10、l10%APS40.82ulTEMD2.04ul配膠方法同上，各種溶液加入配膠方法同上，各種溶液加入到到燒杯中燒杯中，后后震蕩。震蕩。灌灌濃縮濃縮膠膠：用用1ml1ml的移液槍將玻璃板中的剩余的移液槍將玻璃板中的剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠，灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板空間灌滿(mǎn)濃縮膠，灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生以免膠中有氣泡產(chǎn)生。將。將剩余空間灌滿(mǎn)剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。中。 灌灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)梳子時(shí)要使梳子保持水平要使梳子保持水平。冰箱過(guò)夜冰箱過(guò)夜待濃縮膠凝固

11、后，取保險(xiǎn)膜鋪平于桌上，另取兩張待濃縮膠凝固后，取保險(xiǎn)膜鋪平于桌上，另取兩張草紙鋪于保鮮膜上。用草紙鋪于保鮮膜上。用ddH2OddH2O浸濕草紙。取玻璃板浸濕草紙。取玻璃板放于草紙上，包好。放入放于草紙上，包好。放入44冰箱過(guò)夜。冰箱過(guò)夜。濃縮膠的濃度比較低濃縮膠的濃度比較低（5%5%丙烯酰胺丙烯酰胺- -甲甲叉雙丙叉雙丙烯酰胺），里面的孔徑也比較大烯酰胺），里面的孔徑也比較大，所有，所有的蛋白的蛋白都能夠在進(jìn)入分離膠之前在同一水平線(xiàn)都能夠在進(jìn)入分離膠之前在同一水平線(xiàn)上（上（因因?yàn)樵谀慵訕拥臅r(shí)候?yàn)樵谀慵訕拥臅r(shí)候蛋白是蛋白是分布在加樣孔中的，分布在加樣孔中的，不在同一水平線(xiàn)不在同一水平線(xiàn)上。）上

12、。） 分離膠分離膠的膠濃度比較大的膠濃度比較大（1010%），），里面膠孔里面膠孔徑也比較小，這樣施加電壓的徑也比較小，這樣施加電壓的時(shí)候小時(shí)候小的蛋白可的蛋白可以穿過(guò)孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可以穿過(guò)孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被攔住，就跑的慢能被攔住，就跑的慢。通過(guò)。通過(guò)這種方式以分子量這種方式以分子量大小的區(qū)別來(lái)分離蛋白質(zhì)大小的區(qū)別來(lái)分離蛋白質(zhì)插梳子插梳子三三 電泳：電泳：固定：將玻璃板等裝置固定在電泳槽內(nèi)上樣：上所需要的蛋白質(zhì)樣品電泳31 31 固定固定用用ddH2OddH2O水沖洗一下玻璃板，將其放入電泳水沖洗一下玻璃板，將其放入電泳槽中。注意，小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板

13、面向槽中。注意，小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。外。向向電泳槽中加入電泳槽中加入1x1x電泳液電泳液拔掉拔掉梳子，注意動(dòng)作輕柔梳子，注意動(dòng)作輕柔。 5X5X電泳液緩沖液電泳液緩沖液 TrisTris（MW121.14MW121.14） 15.1g 15.1g 甘氨酸（甘氨酸（MW75.07MW75.07） 94g 94g SDS 5.00g SDS 5.00g 蒸餾水至蒸餾水至 1000ml 1000ml 32 32 上上樣樣 蛋白質(zhì)樣品的提取與制備蛋白質(zhì)樣品的提取與制備蛋白濃度的測(cè)定蛋白濃度的測(cè)定計(jì)算上樣量計(jì)算上樣量用用微量注射器吸取蛋白加入到上樣孔中。一般微量注射器吸取蛋白加入到上樣孔中。

14、一般蛋白蛋白MARKMARK的上樣孔在兩邊。的上樣孔在兩邊。311 蛋白樣品制備制備 （1 1） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：?jiǎn)螌淤N壁細(xì)胞總蛋白的提?。?1 1、 倒掉培養(yǎng)液，將瓶倒扣在倒掉培養(yǎng)液，將瓶倒扣在吸水紙使其吸吸水紙使其吸干培養(yǎng)液。干培養(yǎng)液。 2 2、 向培養(yǎng)皿中加入裂解液，通常向培養(yǎng)皿中加入裂解液，通常6 6孔板孔板150-200ul/150-200ul/孔孔， 1212孔板孔板50-60ul/50-60ul/孔，冰上放置，搖床孔，冰上放置，搖床20min 20min 3 3、 用勺子刮下細(xì)胞，并吸出液體至用勺子刮下細(xì)胞，并吸出液體至1.5ml1.5ml離心管中，離心管中，勺勺 子子

15、在處理不同樣本前清水洗凈、擦干（注意冰上操作）在處理不同樣本前清水洗凈、擦干（注意冰上操作） 4 4、 于于44下下12000rpm12000rpm離心離心5min5min。 5 5、 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒1.5min1.5min的離心管中放于的離心管中放于- -8080保存。保存。 （2 2） 組織中總蛋白的提?。航M織中總蛋白的提取： 1 1. .將將200mg200mg組織塊剪碎，置于組織塊剪碎，置于1ml1ml裂解液中（裂解液中（5ml5ml離離心管）心管）。 2 2. .勻漿器進(jìn)行勻漿，注意冰上操作，勻漿后置于冰勻漿器進(jìn)行勻漿，注意冰上操作，勻漿后置于冰上上

16、。 3.103.10，000g ,4,10min,000g ,4,10min,（5ml5ml管管）離心）離心 4 4. .取上清至取上清至1.5ml1.5ml管，管，1212，000g ,4,60min, 000g ,4,60min, 離心離心 5 5. .取上清至新取上清至新1.5ml1.5ml管管,-80,-80儲(chǔ)存儲(chǔ)存 312 蛋白蛋白樣品濃度的樣品濃度的測(cè)定方法測(cè)定方法定氮法雙縮脲法Folin-酚試劑法紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)法BCA法1.Bradford法簡(jiǎn)介原理：考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，

17、該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) （插入表格）檢測(cè)樣品蛋白含量：取一管考馬斯亮藍(lán)+95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入比色杯中測(cè)試。2.BCA法簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)試劑: BCA試劑，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液試驗(yàn)方法: 根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)操作: 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可寧酸)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋(píng)果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個(gè)Cu+螯合二個(gè)B

18、CA分子，工作試劑由原來(lái)的蘋(píng)果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。313313蛋白蛋白上上樣樣量量的計(jì)算的計(jì)算 取含有提取好的蛋白的EP管，放在冰上融化，計(jì)算上樣量?？捎?jì)算含50-100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，沒(méi)有固定的量）取出樣品至EP管中，加入1上樣緩沖液至相同的上樣體積（上樣總體積一般不超過(guò)30l）。上樣前要將樣品于沸水中煮5-10min使蛋白變性。4X上樣緩沖液 1.0 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2ml SDS 0.8g 溴酚藍(lán) 0.04g 甘油 4ml去離子水定容至10ml。混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4保存。使

19、用時(shí)稀釋成1X。314 上樣上樣 (注意：最外兩泳道易跑歪，盡量不用。) Marker 6l （Marker加在最邊上的加樣孔中） 樣本樣本 20-30l 實(shí)驗(yàn)所用Marker電泳后出現(xiàn)10條帶：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa 根據(jù)分子量的大小確定電壓和時(shí)間，marker 跑開(kāi)后變壓，一般溴酚藍(lán)離膠下 cm停止電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（一般要讓目的條帶跑過(guò)分離膠的1/3比較好）主要目的是確定靶蛋白的分子量大小；主要目的是確定靶蛋白的分子量大?。皇褂妙A(yù)染的使用預(yù)染的MarkerMarker還可以實(shí)時(shí)檢測(cè)電泳還可以實(shí)時(shí)檢測(cè)電泳分離情況，并可以轉(zhuǎn)移到膜上。分離情況，并可以

20、轉(zhuǎn)移到膜上。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)MarkerPrestained protein laddersUnstained protein laddersFermentas上樣緩沖液 Loading buffer顯示電泳進(jìn)程其中甘油可以增大樣品密度，使樣品沉降到點(diǎn)樣孔上，防止樣品漂出上樣Anode -內(nèi)槽緩沖液帶有負(fù)電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode +帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從上到下運(yùn)動(dòng)（負(fù)極到正極），分開(kāi)電泳進(jìn)程可以根據(jù)前沿指示劑來(lái)確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比較快小分子量蛋白跑的比較快. . 蛋白根據(jù)分子量大小分開(kāi)蛋白根據(jù)分子量大小分開(kāi)蛋白

21、質(zhì)帶有負(fù)電荷，因此電泳時(shí)可以從負(fù)極向正極移動(dòng)蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，因此電泳時(shí)可以從負(fù)極向正極移動(dòng)標(biāo)本加入到上樣孔中四四 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜準(zhǔn)備物品準(zhǔn)備物品：轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移槽槽 黑紅夾子黑紅夾子 NC NC膜膜 濾紙濾紙 海綿墊海綿墊 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜緩沖緩沖液液（1 1） 轉(zhuǎn)一張膜需轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備準(zhǔn)備6 6張張濾紙和濾紙和1 1張張NCNC膜膜。 切切濾紙濾紙和膜時(shí)一定要戴和膜時(shí)一定要戴手套。手套。將切將切好的好的NCNC膜膜和濾紙置于和濾紙置于1X1X轉(zhuǎn)模緩沖液轉(zhuǎn)模緩沖液浸濕浸濕。 10X10X轉(zhuǎn)膜緩沖液轉(zhuǎn)膜緩沖液 甘氨酸（甘氨酸（MW75.07MW75.07） 151.1g 151.1g TrisTris（MW12

22、1.14MW121.14） 30.3g 30.3g 蒸餾水至蒸餾水至 1000ml 1000ml 溶解后室溫保存溶解后室溫保存, ,用時(shí)稀釋用時(shí)稀釋1010倍，并倍，并加入甲醇至加入甲醇至20%20% （2 2）夾子黑的一面：）夾子黑的一面：海綿海綿-3-3張張濾紙濾紙- -膠膠-NC-NC膜膜-3-3張張濾紙濾紙- -海綿海綿將將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿海綿墊。墊。在墊子上在墊子上墊墊三三層層濾紙濾紙，固定濾紙，固定濾紙, ,搟搟去其中的氣泡去其中的氣泡。 刮去刮去玻璃板上的濃縮膠玻璃板上的濃縮膠，小心剝下下層小心剝下下層膠，膠，用

23、手調(diào)整用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將將NCNC膜膜蓋于蓋于膠上，膠上，要蓋滿(mǎn)整個(gè)膠并除氣泡要蓋滿(mǎn)整個(gè)膠并除氣泡。在膜。在膜上蓋上蓋3 3張張濾紙并除濾紙并除去去氣泡氣泡。膜膜蓋下后不可再蓋下后不可再移動(dòng)移動(dòng)。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作整個(gè)操作在在1X1X轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。將夾子放入將夾子放入轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，中，要使夾的黑面

24、對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用100V100V轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移1.5h1.5h。實(shí)際上。實(shí)際上應(yīng)該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間應(yīng)該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間不同不同的轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)移效率是不一樣的，所以換的轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)移效率是不一樣的，所以換用轉(zhuǎn)膜裝置，最好再摸個(gè)條件；用轉(zhuǎn)膜裝置，最好再摸個(gè)條件； 轉(zhuǎn)膜時(shí)電極方向注意是膜正膠負(fù)。轉(zhuǎn)膜時(shí)電極方向注意是膜正膠負(fù)。五五 封閉封閉準(zhǔn)備物品：準(zhǔn)備物品： 封閉液封閉液BSABSA（5%5%脫脂牛奶脫脂牛奶) ) 搖床搖床 1x1x洗膜液洗膜

25、液 1 1 轉(zhuǎn)完膜后，關(guān)閉電源。取出轉(zhuǎn)膜槽，拿出夾轉(zhuǎn)完膜后，關(guān)閉電源。取出轉(zhuǎn)膜槽，拿出夾子，取膜。子，取膜。2 2 取已經(jīng)配制好的取已經(jīng)配制好的封閉液（封閉液（5%5%脫脂牛奶脫脂牛奶) ) ，加入到容器中。用鑷子將膜的一角夾起，放加入到容器中。用鑷子將膜的一角夾起，放入到入到封閉液（封閉液（5%5%脫脂牛奶脫脂牛奶) ) ，注意使轉(zhuǎn)有蛋，注意使轉(zhuǎn)有蛋白的一面朝上。放置在搖床上封閉白的一面朝上。放置在搖床上封閉2-3h2-3h或過(guò)或過(guò)夜。夜。根據(jù)蛋白根據(jù)蛋白MarkerMarker的的標(biāo)記，切出目的蛋白的條標(biāo)記，切出目的蛋白的條帶和內(nèi)參蛋白的條帶。帶和內(nèi)參蛋白的條帶。1XTBST1XTBST緩

26、沖液緩沖液 10XTBS 10XTBS緩沖液緩沖液 100ml 100ml 蒸餾水蒸餾水 900ml900ml Tween-20 1 ml Tween-20 1 ml因因Tween-20Tween-20比較粘稠，應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪比較粘稠，應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫掉一塊，即可防止產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫保存保存。封閉液封閉液BSABSA（5%5%脫脂牛奶脫脂牛奶) )： 1XTBST1XTBST緩沖液緩沖液 95-100 ml95-100 ml 脫脂奶粉脫脂奶粉 /BSA/BSA 5g5g溶解后溶解后44保存，可于一周內(nèi)使用保存，可于一周內(nèi)使用。六六 抗體的孵

27、育抗體的孵育一抗的孵育一抗的孵育準(zhǔn)備物品：準(zhǔn)備物品： 目的蛋白一抗目的蛋白一抗 內(nèi)參蛋白（內(nèi)參蛋白（GAPDHGAPDH，beta-actinbeta-actin或或beta-tubulinbeta-tubulin）一抗）一抗 搖床搖床 將將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度（目的蛋白一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度（目的蛋白GluT3 1:300, actin 1:2000GluT3 1:300, actin 1:2000）；將；將膜蛋白面朝上放膜蛋白面朝上放于槽中，加入于槽中，加入抗體抗體放在搖床上放在搖床上室溫下孵育室溫下孵育1-2h1-2h或過(guò)夜或過(guò)夜（目的蛋白目的蛋白GluT3 1.5h,acti

28、n 1hGluT3 1.5h,actin 1h）洗膜洗膜 TBST洗膜洗膜放在放在搖床上震蕩搖床上震蕩10min10min，棄去洗膜，棄去洗膜液，如此反復(fù)液，如此反復(fù)3 3次。次。 。二抗的孵育二抗的孵育根據(jù)根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦濃度使用說(shuō)明書(shū)推薦濃度使用TBSTTBST稀釋二抗稀釋二抗。如果如果說(shuō)明書(shū)沒(méi)有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比說(shuō)明書(shū)沒(méi)有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索最佳稀釋度（例進(jìn)行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:200001:1000-1:20000）。孵育孵育條件一般為室溫條件一般為室溫1-21-2小時(shí)或過(guò)夜小時(shí)或過(guò)夜洗洗膜膜 TBST洗膜洗膜放在放在搖床搖床上上震蕩震蕩10min1

29、0min，棄去，棄去洗膜液，如此反復(fù)洗膜液，如此反復(fù)3 3次。次。準(zhǔn)備物品：準(zhǔn)備物品： 目的蛋白二抗目的蛋白二抗 內(nèi)參蛋白（內(nèi)參蛋白（GAPDHGAPDH，beta-actinbeta-actin或或beta-tubulinbeta-tubulin）二抗）二抗 容容器器 44冰箱冰箱 搖床搖床 從從-20-20冰箱中取出已經(jīng)稀釋好的二抗溶液冰箱中取出已經(jīng)稀釋好的二抗溶液，室溫下融化。，室溫下融化。七七 ECLECL化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光檢測(cè)檢測(cè)（顯影）（顯影） 準(zhǔn)備準(zhǔn)備物品及儀器：物品及儀器： ImagequantImagequant儀器儀器 顯影液（顯影液（A+BA+B）移液槍移液槍 TipsTips 玻璃板玻璃板 EPEP管管 淺盤(pán)淺盤(pán)1 1 洗膜后，將膜放于草紙上，將洗膜液吸洗膜后，將膜放于草紙上，將洗膜液吸凈凈2 2 進(jìn)入進(jìn)入曝光室后，關(guān)閉電源，注意避光。曝光室后，關(guān)閉電源，注意避光。3 3 根據(jù)根據(jù)膜的大小來(lái)估計(jì)加入顯影液的量。將等量膜的大小來(lái)估計(jì)加入顯影液的量。將等量A A液