細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法及時(shí)間統(tǒng)籌安排的改進(jìn)

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法及時(shí)間統(tǒng)籌安排的改進(jìn)引 言以細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)為代表的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，存在知識(shí)點(diǎn)多、技術(shù)操作要點(diǎn)多，課時(shí)有限等具體問題。如何在有限的課時(shí)內(nèi)，既完成大綱要求的教學(xué)任務(wù)，又激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情、培養(yǎng)學(xué)生綜合分析解決實(shí)際問題的能力和科學(xué)思維，就成為現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)及教學(xué)改革的重要內(nèi)容及方向。細(xì)胞生物學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的學(xué)科，也是生命科學(xué)領(lǐng)域中重要的基礎(chǔ)課程，學(xué)生通過細(xì)胞生物學(xué)課程了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活動(dòng)的基本規(guī)律，細(xì)胞生物學(xué)理論課與實(shí)驗(yàn)課密不可分。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課既是理論課程的驗(yàn)證和補(bǔ)充，又是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、獨(dú)立思考能力、分析解決問題能力的重要手段。而細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)專業(yè)性較強(qiáng)，只有在

2、順利完成基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)之后，才有可能作進(jìn)一步的設(shè)計(jì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)及科研性實(shí)驗(yàn)，這就要求我們合理分配基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)與設(shè)計(jì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)、科研性實(shí)驗(yàn)各部分的時(shí)間，充分提高時(shí)間利用率，使學(xué)生得到更多的獨(dú)立動(dòng)手機(jī)會(huì)，提高其獨(dú)立思考、分析解決問題的能力。筆者結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)實(shí)踐，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法及時(shí)間統(tǒng)籌安排等方面進(jìn)行了改進(jìn)，希望通過本實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，使學(xué)生在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)掌握基本的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，增強(qiáng)學(xué)生對(duì)理論課知識(shí)的理解，為接下來的設(shè)計(jì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)及研究性實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。1 統(tǒng)籌安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間我院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)任務(wù)繁重，每學(xué)期 64 學(xué)時(shí)，參與實(shí)驗(yàn)的本科生人數(shù)近 200 人，分 6 組進(jìn)行，每組需要做: 培養(yǎng)技術(shù)、

3、切片機(jī)使用技術(shù); 倒置顯微鏡的使用技術(shù); 植物組織培養(yǎng); 石蠟切片; 細(xì)胞內(nèi)多糖觀察; 細(xì)胞內(nèi)核酸觀察; 雞血紅細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)等多個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。我們?cè)?jīng)將每一部分分開進(jìn)行( 見圖 1) ，雖然這樣可以避免各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之間的相互干擾，減少錯(cuò)誤發(fā)生率，但是會(huì)大大延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)需 7 天。由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間分配不合理，有時(shí)學(xué)生忙的不可開交，不能很好掌握實(shí)驗(yàn)內(nèi)容; 有時(shí)卻又無事可做，使學(xué)生產(chǎn)生厭煩情緒，對(duì)實(shí)驗(yàn)效果影響頗大。為此，我們將其中的部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行整合，將實(shí)驗(yàn)分 3 天進(jìn)行( 見圖 2) : 第 1 天，進(jìn)行儀器設(shè)備及相關(guān)技術(shù)培訓(xùn)，動(dòng)物處死，組織切取及固定( 過夜) ; 第 2 天，進(jìn)行植物傷愈

4、組織培養(yǎng)、石蠟切片實(shí)驗(yàn)的脫水、透蠟、包埋( 過夜) 、動(dòng)物細(xì)胞融合; 第 3 天，進(jìn)行石蠟切片實(shí)驗(yàn)的切片、展片、烘干、復(fù)水、HE 染色與福爾根染色、PAS 染色。但是由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間限制，展片后烘干時(shí)間較短( 1 至 2 h) ，為避免在復(fù)水、染色步驟組織切片的丟失，學(xué)生往往利用酒精燈外焰對(duì)載玻片上的蠟帶進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的展片操作，往往會(huì)造成蠟帶熔化和組織破壞，學(xué)生很難針對(duì)展片程度進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)的成功率和效果。為了避免上述問題，學(xué)生通常會(huì)反復(fù)向教師詢問，是否可以進(jìn)行下一步操作，不僅大大增加了實(shí)驗(yàn)教師的工作量，而且來自教師多次否定的回答，使學(xué)生產(chǎn)生較強(qiáng)的挫敗感，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣。針對(duì)以上問

5、題，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)中的限速步驟進(jìn)行了改進(jìn)，縮短了操作時(shí)間，進(jìn)而使展片、烘干操作提至前1 天，然后過夜，充分延長(zhǎng)烘干時(shí)間，下文將對(duì)實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)進(jìn)行進(jìn)一步闡述。另外，原來動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)安排在石蠟切片之后進(jìn)行，學(xué)生觀察到的細(xì)胞融合率非常低，經(jīng)過分析，我們認(rèn)為細(xì)胞融合率低的原因主要是由于融合時(shí)間比較短，于是對(duì)實(shí)驗(yàn)時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，將動(dòng)物細(xì)胞融合安排在石蠟切片實(shí)驗(yàn)中間( 從脫水到包埋步驟之間) ，具體時(shí)間由學(xué)生自主統(tǒng)籌。這樣在石蠟切片實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生可以隨時(shí)觀察細(xì)胞融合結(jié)果，感興趣的學(xué)生還可以在實(shí)驗(yàn)教師的引導(dǎo)下，看到動(dòng)物細(xì)胞融合狀態(tài)隨時(shí)間的變化，可以自主設(shè)計(jì)研究動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中PEG 添加量、融合溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果的影響，可以進(jìn)行融合率與時(shí)間關(guān)系的研究，在不增加實(shí)驗(yàn)投入前提下，使學(xué)生能夠得到在同一實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中從多角度多層次進(jìn)行分析的訓(xùn)練，提高了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣與科研能力。2 改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法石蠟切片實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要部分，迄今為止石蠟切片仍然是疾病診斷，尤其是病變性質(zhì)判斷的重要手段。實(shí)驗(yàn)中涉及到斷頭處死小鼠，剖開腹腔，取出組織，沖洗，修切成小塊，加入固定液進(jìn)行固定，各級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，染色，顯微鏡下觀察等多個(gè)操作步驟，每一步操作都會(huì)對(duì)結(jié)果造成至關(guān)重要的影響，要求操作者具有很好的實(shí)驗(yàn)技巧，對(duì)于某些步驟( 如包埋) ，不得不由實(shí)驗(yàn)教師進(jìn)行演示實(shí)驗(yàn)，而學(xué)生不能參與，造成學(xué)生動(dòng)手能力

7、得不到提高，因此我們把其中某些步驟操作進(jìn)行改進(jìn)，使其更適宜學(xué)生操作，讓學(xué)生更多的參與到實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)手動(dòng)腦，不僅提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能，而且使他們具有分析問題、解決問題的意識(shí)，提高其獨(dú)立研究能力。石蠟切片過程中，最易受操作人員實(shí)驗(yàn)技術(shù)影響的步驟是浸蠟、包埋，而且包埋效果直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。原來本科學(xué)生浸蠟、包埋部分操作成功率僅為 10% 16%，甚至更低，不僅大大降低整體實(shí)驗(yàn)的速度、延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，而且由于大量重復(fù)操作，很容易造成學(xué)生產(chǎn)生厭煩情緒，對(duì)實(shí)驗(yàn)失去信心。已經(jīng)有相關(guān)研究人員對(duì)常規(guī)石蠟切片方法進(jìn)行了研究，并取得了較好的效果。中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的楊捷頻提到在夏季、冬季分別選擇高熔點(diǎn)( 58 60

8、) 高硬度的蠟和選擇低熔點(diǎn)( 54 56 ) 低硬度的蠟，并且不同組織采用硬度不同的蠟。但是在本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)中我們?cè)囉弥笮Ч⒉幻黠@，這可能與本科生實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的熟練程度有關(guān)，所以進(jìn)一步發(fā)掘新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)改進(jìn)，降低這一操作的技術(shù)門檻，除了對(duì)相關(guān)研究人員具有一定的輔助意義外，對(duì)本科生石蠟切片實(shí)驗(yàn)教學(xué)就顯得尤為重要; 彎雪燕等自制鐵皮包埋盒，利用這一改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，取得了較好的效果，但是該設(shè)備改造僅適用于小規(guī)模應(yīng)用，不適于 40 人甚至更多人同時(shí)參與的本科生實(shí)驗(yàn)，而如果擴(kuò)大設(shè)備規(guī)模，則會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本。經(jīng)過了多次實(shí)驗(yàn)改進(jìn)探索，試圖降低這一實(shí)驗(yàn)步驟的技術(shù)門檻，提高操作的成功率，先后進(jìn)行了下面 4個(gè)實(shí)驗(yàn):

9、烘箱或培養(yǎng)箱輔助蠟盒包埋，我們分別采用電烘箱和培養(yǎng)箱，保證石蠟的溫度，這樣做雖然保證了操作的成功率，但是由于參與實(shí)驗(yàn)學(xué)生較多，頻繁開關(guān)設(shè)備的門，對(duì)這類儀器設(shè)備損耗較大; eppendorf 管直接包埋，我們用水浴鍋在 4 5 mL eppendorf 管中直接進(jìn)行浸蠟、包埋，待蠟?zāi)毯螅茐?eppendorf 管，取出管內(nèi)的蠟塊，但是這樣得到的蠟塊是圓柱形，不僅給修蠟造成麻煩，而且由于修蠟除去的部分較多，組織也易丟失; 水浴鍋邊緣熱臺(tái)蠟盒包埋，在恒溫水浴中化蠟，把蠟盒放在水浴鍋邊沿，以提高包埋盒內(nèi)外溫度，盡量縮短浸蠟、包埋之間的時(shí)間間隔，保證溫度變化較小，但是由于實(shí)驗(yàn)中操作人員較多，水浴鍋邊

10、沿較窄，容易因操作人員間的相互擁擠，使包埋盒落水，造成實(shí)驗(yàn)的頻繁失誤和失敗; 浮漂熱臺(tái)蠟盒包埋，經(jīng)過多次探索，我們采用在 4 5 mL eppendorf 管中裝入 2至3 mL 石蠟對(duì)樣品進(jìn)行最后一步浸蠟，利用浮漂使其漂浮在恒溫水浴鍋中，同時(shí)在裝載了樣品的 eppendorf管上部配以較重的器物，保證裝載樣品的 eppendorf 管全部浸入并漂浮在60 水浴鍋中，同時(shí)另取一個(gè)浮漂放在此水浴鍋中，把容積為2 至3 mL 的包埋盒放在浮漂上，待浸蠟結(jié)束后，馬上將樣品管中的樣品和熔蠟倒于包埋盒中，此時(shí)樣品在包埋盒內(nèi)部處于接近凝固的固液混合態(tài)，可以利用浸泡在同溫度下的蠟缸內(nèi)取出的牙簽對(duì)目的樣品組織

11、進(jìn)行位置調(diào)整，最后從浮漂上取出蠟盒，將蠟盒置室溫、冷卻，整個(gè)過程一氣呵成，有效避免了浸蠟、包埋過程中的溫度變化，提高了操作成功率，而且可以手動(dòng)調(diào)整樣品組織的位置，避免了組織位置不適對(duì)下一步的修蠟造成的影響，保證了切片質(zhì)量。經(jīng)過對(duì) 197 名本科學(xué)生的教學(xué)實(shí)踐證明，實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)后學(xué)生操作成功率由原來的 10 16%，提高到83 91% ，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間由原來的 4 至 5 h 縮短為 1至2 h，此方法具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、節(jié)能低耗等優(yōu)點(diǎn)，又能充分保證和改善包埋質(zhì)量，提高工作效率，大幅度縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，在后續(xù)的切片及染色實(shí)驗(yàn)中證明新方法制得的組織包埋蠟塊具有與傳統(tǒng)方法相同或者相近的實(shí)驗(yàn)效果，更為重

12、要的是，新方法的使用避免了樣品組織沉浸在蠟塊底部、樣品組織在蠟塊中排布取向不合理、樣品組織周圍存在空洞等常見問題的出現(xiàn)。另外在實(shí)驗(yàn)時(shí)間由 4 至 5 h 縮短為 1 至 2 h 的基礎(chǔ)上，我們將實(shí)驗(yàn)時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整( 見圖 3) ，將原來第 3 天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中的切片、展片、烘干操作調(diào)整至第2 天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中，新的第 2 天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為: 植物傷愈組織培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合、石蠟切片實(shí)驗(yàn)的固定、脫水、透蠟、包埋、切片、展片、烘干( 過夜) 。這一調(diào)整的意義在于可以提高蠟帶在載玻片上的固定程度，避免在復(fù)水、HE 染色與福爾根染色、PAS 染色等實(shí)驗(yàn)步驟中組織切片的丟失。我們改造了包埋技術(shù)后，調(diào)整實(shí)驗(yàn)時(shí)間，

13、使得烘干時(shí)間由過去的 1 至 2 h 延長(zhǎng)為 10 h 以上( 過夜) ，這將極大地提高蠟帶的固著程度，降低外焰展片操作對(duì)學(xué)生帶來的實(shí)驗(yàn)失敗、技術(shù)困窘與厭煩情緒，實(shí)驗(yàn)成功率提高和實(shí)驗(yàn)效果改善也極大地激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)和獨(dú)立操作興趣。3 結(jié) 語(yǔ)筆者針對(duì)石蠟切片實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中存在的問題，對(duì)包埋方法進(jìn)行改進(jìn)，在不增加實(shí)驗(yàn)成本基礎(chǔ)上，使實(shí)驗(yàn)成功率大幅度增加、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、提高工作效率、保證包埋質(zhì)量、獲得質(zhì)量較好的切片。在此基礎(chǔ)上，統(tǒng)籌安排細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)間，使得學(xué)生通過自主時(shí)間統(tǒng)籌，將動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)和石蠟組織切片實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間有機(jī)的穿插起來，使整個(gè)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)間安排更加合理，有效減少學(xué)生重

14、復(fù)操作次數(shù)，提高實(shí)驗(yàn)成功率。在不增加實(shí)驗(yàn)投入的前提下，使得學(xué)生能夠在有限的時(shí)間內(nèi)獲得對(duì)同一實(shí)驗(yàn)進(jìn)程從多角度多層次進(jìn)行分析的訓(xùn)練，使得學(xué)生嘗試并掌握了自主統(tǒng)籌安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)技巧，提高了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣與科研能力，為發(fā)展學(xué)生創(chuàng)新思維能力，進(jìn)一步獲取和創(chuàng)造新知識(shí)打下基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)( References) :1 吳 瑩 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革J 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2010，29( 7) : 262-263WU Ying Teaching reform on experiments of the cytobiology courseJ Research and Exploration in Labo

15、ratory，2010，29( 7) : 262-2632 閆曉梅 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革中的一些探索J 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2012，31( 10) : 352-355YAN Xiao-mei Reform of cell biology experimental teachingJResearch and Exploration in Laboratory，2012，31( 10) : 352-3553 張盛周 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革J 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2009，28( 5) : 107-108ZHANG Sheng-zhou Discussion on the reform of th

16、e experimentalteaching of cell biology under the new situationJ Research andExploration in Laboratory，2009，28( 5) : 107-1084 滕利榮 生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程M 3 版 北京: 科學(xué)出版社，20085 滕利榮 生命科學(xué)儀器使用技術(shù)教程M 北京: 科學(xué)出版社，20086 滕利榮 生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程M 吉林: 吉林科學(xué)技術(shù)出版社，19997 滕利榮 生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程M 吉林: 吉林科學(xué)技術(shù)出版社，20018 莫晚莉 手術(shù)中快速石蠟切片病理診斷的臨床意義J 實(shí)用醫(yī)技雜志，2012，19( 4) : 421-4229 方捷迪 改良術(shù)中快速石蠟切片技術(shù)的應(yīng)用J 實(shí)用醫(yī)技雜志，2011，18( 11) : 1205-120610 彎雪燕 常規(guī)石蠟切片中浸