質(zhì)粒DNA的提取、純化和電泳檢測(cè)

1、質(zhì)粒DNA的提取、純化和電泳檢測(cè)姓名 學(xué)號(hào) 同組人 班級(jí) 實(shí)驗(yàn)時(shí)間摘要：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA，它是基因工程中一種非常重要的載體。質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)最基本的工作。堿變性提取法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法。電泳是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。本次實(shí)驗(yàn)利用堿變法對(duì)E.coli DH5受體菌中質(zhì)粒pUC19的DNA進(jìn)行提取、純化和電泳檢測(cè)，旨在學(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒DNA提取的原理、純化及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，我們達(dá)到了預(yù)期效果

2、。關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNA、堿變性提取法、質(zhì)粒DNA的純化、DNA凝膠電泳1.引言質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量大小從1kb至200kb以上不等。一些質(zhì)粒永遠(yuǎn)獨(dú)立于染色體之外，另外一些質(zhì)粒在一定條件下會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子（簡(jiǎn)稱cccDNA）。由于質(zhì)粒分子小、便于分離和提取的特點(diǎn)，在DNA重組中，質(zhì)?；蚪?jīng)過(guò)改造后的質(zhì)粒可通過(guò)連接外源基因構(gòu)成重組體，攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)

3、菌、動(dòng)物細(xì)胞或植物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增與表達(dá)，因此質(zhì)粒是基因工程中一種非常重要的載體。質(zhì)粒特征的分析已被廣泛用于細(xì)菌種屬鑒定、耐藥性、毒力及同源性分析。近年來(lái)由于基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)?；蛱结樀拈_(kāi)發(fā)和應(yīng)用也得到了飛速的發(fā)展，所以這就要求我們從宿主細(xì)胞中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。因此，質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)最基本的工作。提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿裂解/堿變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分

4、離目的，適用于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡(jiǎn)單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測(cè)定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來(lái)，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性；質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。當(dāng)用pH值4.8的KAc（或NaAc）高

5、鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無(wú)水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。電泳是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分

6、子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因帶電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如EB染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。溴化乙錠（EB）是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿

7、基之間，并在300 nm波長(zhǎng)的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來(lái)顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光的強(qiáng)度是同DNA片段的大?。ɑ驍?shù)量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面六個(gè)因素：（1）樣品DNA分子的大?。弘娪緯r(shí)，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與分子量（所含堿基）的對(duì)數(shù)值成反比，這是因?yàn)榇蠓肿佑懈蟮哪Σ磷枇?。?）DNA分子的構(gòu)象：分子量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA（cccDNA）的一條

8、鏈斷裂，變成開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA（Liner DNA）分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型（cccDNA）遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開(kāi)環(huán)狀（ocDNA）分子。（3）瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。通常凝膠濃度愈低，則凝膠孔徑愈大，DNA電泳遷移速度越快，即分子量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越小。（4）電泳所用電場(chǎng)：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比。電壓愈高帶電顆粒泳動(dòng)愈快，但隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加，高分子量DNA的泳動(dòng)速率以不同幅度增

9、加，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減小，為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)小于5V/cm。（5）電泳緩沖液: 在進(jìn)行分子電泳時(shí)所使用的緩沖溶液，用以穩(wěn)定體系酸堿度。常見(jiàn)的核酸電泳緩沖液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。電泳緩沖液的作用：維持合適的pH。電泳時(shí)，正極發(fā)生氧化反應(yīng)（4OH-+4e-2H2O+O2），負(fù)極發(fā)生還原反應(yīng)（4H+4e-2H2），長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿。一個(gè)好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強(qiáng)的緩沖能力，使溶液兩極的pH保持基本不變；使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應(yīng)含有0.010.04mol/L的Na+離子

10、，Na+離子的濃度太低時(shí)電泳速度變慢；太高時(shí)就會(huì)造成過(guò)大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化；電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，加入濃度為12mM，目的是螯合Mg2+等離子，防止電泳時(shí)激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率，當(dāng)電泳液為無(wú)離子水（如不慎在凝膠中忘記加緩沖液，即誤用蒸餾水配置凝膠），溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動(dòng)很慢，DNA幾乎不移動(dòng)；而在高離子強(qiáng)度下（如錯(cuò)用10電泳緩沖液），導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動(dòng)很快，產(chǎn)生大量的熱，有時(shí)甚至熔化凝膠或使DNA變性。（6）溫度：DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的行為受堿基組成和凝膠溫度影響不明顯。不同大小DNA

11、片段的相對(duì)電泳遷移率在430內(nèi)無(wú)變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行，而當(dāng)瓊脂糖含量少于0.5時(shí)凝膠很脆弱，最好在4下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。2.材料和方法2.1 材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料：E.coli DH5受體菌（生長(zhǎng)在LB固體培養(yǎng)基）、有Amp標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19實(shí)驗(yàn)試劑：LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素（Amp）母液（儲(chǔ)存濃度100mg/mL）、溶液、溶液、溶液、TE緩沖液、Tris飽和酚、氯仿/異戊醇混合液、酚/氯仿/異戊醇（PCI）（25：24：1）混合液、3M NaAc溶液、冰乙醇、70%乙醇、RNase A、滅菌雙蒸水ddH2O、50TAE緩沖液、10mg/mL溴化乙錠（EB）溶液、6上樣緩

12、沖液（6loading buffer）、瓊脂糖、Supercoiled DNA Ladder Marker、pUC19、pUC19/Hind實(shí)驗(yàn)儀器：接種環(huán)、三角瓶、天平、紅蓋瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、100mL離心管、1.5mL塑料離心管、4離心機(jī)、渦旋振蕩器、微量移液器、不同型號(hào)槍頭、制膠板、制膠槽、樣品梳、電泳儀、紫外燈、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、記號(hào)筆、盛冰的搪瓷杯、離心管架、手套2.2 方法2.2.1 E.coli DH5（pUC19）菌體培養(yǎng)（1）用Amp母液和LB液體培養(yǎng)基配制LB+Amp（Amp工作濃度為100g/mL）液體培養(yǎng)基。（2）用酒精燈灼燒且冷卻后的接種環(huán)在LB固

13、體培養(yǎng)基上挑取E.coli DH5單菌落，將接種環(huán)伸至LB+Amp液體培養(yǎng)基中，在液體培養(yǎng)基與三角瓶瓶壁交界面處向液體培養(yǎng)基中接種E.coli DH5（pUC19）。（3）將培養(yǎng)基在37、200rpm下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。（4）從過(guò)夜培養(yǎng)基中取1%接種量接種到新的LB+Amp（Amp工作濃度為100g/mL）培養(yǎng)基，將新的培養(yǎng)基在37、200rpm下振蕩46小時(shí)，最后得到菌液。2.2.2 堿裂解/變性法提取質(zhì)粒DNA（1）取出一支滅菌的100mL離心管，標(biāo)記上組號(hào)，用天平稱量其重量，并記錄為W1。（2）向100mL離心管中倒入菌液至距瓶口1/3處，每?jī)山M的兩支100mL離心管配平。（3）將菌液在4離

14、心機(jī)中6000rpm離心5min，棄上清。（4）向菌液中加入5mL溶液，渦旋振蕩，將菌液在4離心機(jī)中6000rpm離心5min，棄上清。（5）將100mL離心管稱重，標(biāo)記其質(zhì)量為W2，計(jì)算W2-W1。（6）每100mg菌體量，加入（按菌體量接近的重新分組，溶液補(bǔ)平）：1.0mL溶液，充分渦旋振蕩，用溶液再次配平；2.0mL溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴35min；1.5mL溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴5min。（7）將菌液在4離心機(jī)中12000rpm離心15min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管內(nèi)，記錄體積V。（8）加入2V冰乙醇，顛倒混勻；-20靜置15min。（9）將菌液在4離心機(jī)中12000rpm離心1

15、5min，棄上清。（10）加入5mL 70%乙醇，12000rpm離心3min，吸棄上清。（11）重復(fù)70%乙醇洗滌一次，37風(fēng)干510min。（12）分次加入1mL TE溶液并轉(zhuǎn)移到EP管中，得質(zhì)粒DNA粗提物。（13）向質(zhì)粒DNA粗提物中加入5L RNase A（10mg/mL），終濃度為50g/mL，37孵育12小時(shí)。2.2.3 質(zhì)粒DNA的純化將1mL質(zhì)粒DNA粗提物分出500L到一新EP管中，使得每組兩管。每個(gè)EP管進(jìn)行如下操作：（1）加入等體積的Tris飽和酚，渦旋振蕩，12000rpm離心5min；（2）轉(zhuǎn)移上清（上清體積是V1）至新管，加入V1的酚/氯仿/異戊醇混合液，渦旋振蕩

16、，12000rpm離心5min；（3）轉(zhuǎn)移上清（上清體積是V2）至新管，加入V2的氯仿/異戊醇混合液，混勻，12000rpm離心5min；（4）轉(zhuǎn)移上清（上清體積是V3）至新管，加入1/10V3的3M NaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混勻，-20保存30min；（5）12000rpm離心15min，棄上清；（6）加入500L 70%乙醇洗滌，12000rpm離心2min，棄上清；（7）重復(fù)洗滌一次，吸棄上清，37風(fēng)干5min；（8）每管加入25L TE溶解沉淀，合并，得50L純化質(zhì)粒DNA。2.2.4瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA（1）1%瓊脂糖凝

17、膠的制備。配制2L1TAE：取40mL 50TAE，用雙蒸水將其稀釋至2L。正確組裝制膠槽、制膠板、樣品梳。取40mL 1TAE至250mL干凈紅蓋瓶中，稱量0.4g瓊脂糖，混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無(wú)顆粒。待溶液冷卻至60左右，加入20L 1mg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，使EB溶液終濃度為0.5mg/L，混勻后緩緩倒入架好樣品梳的制膠槽中，冷卻凝固待用（冷卻凝固時(shí)間要在30min以上）。之后輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳槽中事先加入1TAE電泳緩沖液），即可上樣。（2）電泳上樣。取2.0L純化DNA、2L雙蒸水、1L上樣緩沖液（6loading buffer），

18、用微量移液器吹吸混勻。將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1TAE至高出膠面約1mm。將上述混合好的DNA樣品，按照表1順序，點(diǎn)樣到凝膠中。其中第11泳道為對(duì)照組，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有用RNA酶處理粗提物，其他實(shí)驗(yàn)過(guò)程不變。（3）凝膠電泳與DNA分離。開(kāi)啟電泳儀電源。選擇合適的電壓（100-120V）和時(shí)間（40min）。將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連。啟動(dòng)電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開(kāi)。電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝膠。紫外燈下觀察電泳結(jié)果，攝片，保存，分析。表1 DNA樣品加樣順序泳道123456789樣品超螺旋

19、markerpUC19pUC19/Hind1組DNA樣品2組DNA樣品3組DNA樣品4組DNA樣品5組DNA樣品超螺旋marker樣量6L5L5L5L5L5L5L5L6L泳道1011121314151617樣品6組DNA樣品6組DNA樣品（對(duì)照組）7組DNA樣品8組DNA樣品9組DNA樣品10組DNA樣品pUC19/HindpUC19樣量5L5L5L5L5L5L5L5L3.結(jié)果在堿裂解/變性法提取質(zhì)粒DNA中，W1為14.16g，W2為14.26g，W2-W1為100mg。堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳得到的條帶情況如圖一所示。在溶液中，由于DNA核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在

20、電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。圖上方是17個(gè)點(diǎn)樣孔，DNA條帶離點(diǎn)樣孔越遠(yuǎn)，說(shuō)明DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率越快。圖1. 堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17bp3,0492,087圖2. Supercoiled DNA Ladder Marker的DNA條帶泳道1與泳道9 加的樣品是Supercoiled DNA Ladder Marker。Supercoiled DNA Ladder Marker 由 8種超螺旋的質(zhì)粒DNA 構(gòu)成，DNA大小分別為：2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp

21、、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp（如圖2所示）。其中2 kbp6 kbp間約以1 kbp遞增，6 kbp12 kbp間約以2 kbp遞增。每次取6L電泳時(shí)，每條帶的DNA量約為50 ng，其中5 kbp條帶的DNA量約為其他條帶的3倍（150ng），顯示亮帶。此DNA 溶液中已含有1Loading Buffer，可直接上樣。1Loading Buffer中含有色素Xylene Cyanol FF（0.01%）以及Bromophenol Blue （0.01%）。在圖1中Supercoiled DNA Ladder Marker形成的

22、DNA條帶中，可以清晰地看清從下往上6條DNA條帶（對(duì)應(yīng)的DNA由小到大），而且從下往上數(shù)第4條DNA條帶（DNA大小為5026bp）最明亮，而其余2條位置靠上（DNA較大）的DNA條帶較不明顯。泳道2與泳道17加的樣品是質(zhì)粒DNA，即pUC19，可以起到對(duì)照作用。pUC19的DNA是cccDNA，即超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA。在圖1中，可以看到泳道2與泳道17對(duì)應(yīng)的電泳圖中有一條清晰明亮的DNA條帶。泳道3與泳道16加的樣品是pUC19/Hind。Hind是限制性核酸內(nèi)切酶，可以酶切pUC19。Hind酶切pUC19的結(jié)果是使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的pUC19質(zhì)粒DNA的鏈斷裂，

23、DNA的鏈斷裂的pUC19遷移速度變慢。但是Hind沒(méi)有將所有pUC19酶切，因此泳道3與泳道16電泳后會(huì)形成兩條條帶。在泳道3與泳道16對(duì)應(yīng)的DNA帶中，圖中上面那條較細(xì)較暗的條帶是Hind酶切后的pUC19，圖中下面那條較粗較亮的條帶是沒(méi)有被Hind酶切的pUC19。泳道4加的樣品是1組DNA樣品。其DNA條帶很明亮而且寬。這說(shuō)明1組樣品中DNA含量較高。泳道5加的樣品是2組DNA樣品，可以看見(jiàn)一條較暗的pUC19 DNA條帶。另外泳道11對(duì)應(yīng)的電泳圖中也可以看到一條較暗的pUC19 DNA條帶。在pUC19對(duì)應(yīng)的DNA條帶位置處全班10個(gè)組均無(wú)明顯的DNA條帶。泳道6加的樣品是我們組（3

24、組）DNA樣品。我們的DNA帶較明亮，說(shuō)明提取出的DNA較多。但DNA條帶位置沒(méi)有在pUC19 DNA對(duì)應(yīng)的位置。我們組DNA條帶位置比pUC19 DNA對(duì)應(yīng)的條帶位置靠下，說(shuō)明我們組DNA遷移距離比pUC19 DNA大，我們組DNA的相對(duì)分子質(zhì)量比pUC19 DNA小。在pUC19 DNA對(duì)應(yīng)的條帶位置上可以看到模糊的DNA條帶，產(chǎn)生的原因是因?yàn)橄旅娴腄NA條帶中有些DNA因?yàn)檫w移速度較慢而使DNA條帶拉長(zhǎng)。泳道11加的樣品是6組DNA樣品（對(duì)照組）。該樣品在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有用RNA酶處理，其他實(shí)驗(yàn)操作不變。因此該樣品中含有大量的RNA，所以在DNA帶下方形成大片很寬很明亮的RNA區(qū)域。泳道4

25、泳道8、泳道10泳道15在電泳圖中都有明顯的拖尾現(xiàn)象，而且在電泳圖泳帶的的中間偏上處都有一條或亮或暗的DNA條帶，這是E.coli DH5受體菌的DNA碎片，DNA碎片相對(duì)分子質(zhì)量較大，泳動(dòng)得較慢，所以形成的DNA條帶較靠上。某些點(diǎn)樣孔的邊緣（尤其是下邊緣）出現(xiàn)熒光，泳道4、泳道7、泳道10、泳道12等對(duì)應(yīng)的點(diǎn)樣孔下邊緣可明顯觀察到此現(xiàn)象。該現(xiàn)象說(shuō)明這些提取的質(zhì)粒DNA中含有較多的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)阻礙了部分DNA泳動(dòng)，從而在點(diǎn)樣孔的邊緣形成熒光。另外在這些點(diǎn)樣孔下邊緣的下方還有一條寬度比點(diǎn)樣孔下邊緣寬的DNA條帶，這是提取的樣品中殘留的E.coli DH5受體菌染色體DNA產(chǎn)生的DNA條帶。4.

26、討論為獲得高純度的質(zhì)粒DNA，必須徹底去除雜蛋白、染色體DNA和RNA。在整個(gè)質(zhì)粒提取過(guò)程中除去染色體DNA的關(guān)鍵步驟是加入溶液、溶液的變性和復(fù)性環(huán)節(jié)，應(yīng)控制好變性和復(fù)性的時(shí)機(jī)。溶液中含有50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl（pH 8.0）、10mM EDTA。加入溶液后溶液變渾濁，可劇烈振蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂。葡萄糖能使菌液密度增加，使大腸桿菌重懸并使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，沉淀菌體的量適宜即可，如果菌體過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致溶液無(wú)法混勻，細(xì)胞裂解不充分。加入溶液重懸要充分，如果細(xì)胞沒(méi)有完全散開(kāi)懸浮，將會(huì)影響溶液裂解細(xì)胞，

27、最終導(dǎo)致提取產(chǎn)物中含較多的蛋白質(zhì)，染色體DNA等雜質(zhì)。另外葡萄糖可以維持細(xì)胞滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂。葡萄糖還可以防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的輔助因子，因此EDTA可避免DNase對(duì)DNA的降解作用。Tris-HCl可以提供適當(dāng)?shù)膒H。溶液在離心后要盡可能去除干凈溶液含有0.2M NaOH、1% SDS。溶液使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配制，配制時(shí)要防止NaOH吸收空氣中的H2O和CO2而減弱了堿性。加入溶液時(shí)，菌液變黏稠、透明，無(wú)菌塊殘留。NaOH可以使細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿性使染色體DNA、質(zhì)粒

28、DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS在加入溶液后起到使蛋白質(zhì)變性的作用。加入溶液時(shí)搖勻一定要輕柔，劇烈會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂；靜置時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)榛蚪MDNA在堿性條件下會(huì)慢慢斷裂。溶液含有5M KAc 60mL、冰醋酸11.5mL、重蒸水28.5mL，溶液終濃度為：K3M，Ac5M。加入溶液時(shí)，會(huì)立即出現(xiàn)白色沉淀。溶液中的SDS遇到KAc后變成了十二烷基硫酸鉀（PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，此外大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。HAc起到中和NaOH的作用，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件下會(huì)打斷基因組DNA，基因組

29、DNA被打斷就無(wú)法被PDS共沉淀。同時(shí)加HAc可以使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。該步反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了這一沉淀。冰浴使反應(yīng)更充分。加入溶液和溶液后，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在渦旋振蕩器上劇烈振蕩，否則，染色體DNA會(huì)斷裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒DNA提純。因此，操作時(shí)一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體DNA充分利用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。之后的實(shí)驗(yàn)操作是將菌液在4離心機(jī)中12000rpm離心15min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管內(nèi)。上清液中含有大量RNA、斷裂的DNA片段和質(zhì)粒DNA。注意此時(shí)沉淀不實(shí)，寧愿少吸上清，

30、也不要帶入沉淀，因?yàn)閹氲某恋碓谥蟛僮髦袩o(wú)法去除。在使用離心機(jī)時(shí)，樣品放置要對(duì)稱平衡，否則會(huì)嚴(yán)重?fù)p害離心機(jī)的使用壽命。沉淀DNA通常使用預(yù)冷無(wú)水乙醇，在低溫條件下長(zhǎng)時(shí)間放置可使DNA沉淀完全。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。TE溶液是pH緩

31、沖液，含有10mM Tris-HCl（pH 8.0）、1mM EDTA，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)。同時(shí)TE溶液含有EDTA，EDTA可抑制DNA酶的作用。RNase A是一種廣泛應(yīng)用的核糖核酸內(nèi)切酶，專一性催化C-U間3-5磷酸二酯鍵的裂開(kāi)形成具有2,3-環(huán)磷酸衍生物寡聚核苷酸，可以去除殘留的RNA。寡聚核糖核苷酸會(huì)保存在質(zhì)粒DNA溶液中，但不影響后續(xù)的常規(guī)操作。質(zhì)粒DNA中蛋白質(zhì)的去除通常采用酚、氯仿抽提。質(zhì)粒DNA純化過(guò)程中使用酚/氯仿/異戊醇混合液。苯酚是強(qiáng)的蛋白阻斷劑，可使蛋白變性析出。同時(shí)，Tris飽和酚的pH在8.0左右，此時(shí)DNA分布于水相而RNA分布于有機(jī)相，從而可分離上清獲得DNA。pH為8.0的Tris飽和酚比重略大于水，且與水有很大的互溶性，即酚可以進(jìn)入水相從而影響后續(xù)的酶反應(yīng)。因此，需要使用氯仿。氯仿也是蛋白阻斷劑，但強(qiáng)度弱于苯酚，其主要作用是將同水以極小比例互溶的苯酚萃取出來(lái)。如果不加氯仿，殘留的苯酚會(huì)阻礙酶切反應(yīng)等，且不利于獲得含質(zhì)粒