微生物限度檢查法實驗準(zhǔn)備

1、微生物限度檢查法微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為3035 ；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328 。檢驗結(jié)果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g 、ml 或cm2）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100 cm2；要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應(yīng)增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于陽性對照試驗）。檢驗時,應(yīng)從2 個以上最

2、小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。一般應(yīng)隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3 倍量供試品。供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45 。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1 小時。除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。2.固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1OOml ，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10 的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80 ，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。（6）具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品有抑菌活

3、性時，采用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。 離心沉淀法 取一定量的供試液，500 轉(zhuǎn)分鐘離心3 分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌（Escherichia coliCMCC ( B ) 44l02金黃色葡萄球菌（Staphylococcus a

4、ureus） CMCC ( B ) 26003 枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis ) CMCC ( B ) 63501 白色念珠菌（Candida albicans ） CMCC ( F ) 98001 黑曲霉（Aspergillus niger) CMCC ( F ) 98003 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448 小時。上述培養(yǎng)物用0 . 9 無菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數(shù)為50100CFU 的菌懸液

5、。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 7 天，加人3 5ml 含0.05 % ( ml /ml ）聚山梨酯80 的0.9 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9無菌氯化鈉溶液制成每lml 含孢子數(shù)50 100CFU 的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時內(nèi)使用；若保存在28 ，可在24 小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 8 ，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂

6、培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置3035 培養(yǎng)48 小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置23 28 培養(yǎng)72 小時，計數(shù)；取白色念珠菌50 100CFU ，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置23 28 培養(yǎng)72 小時，計數(shù)。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。結(jié)果判定 若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70 % ，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查

7、符合規(guī)定。計數(shù)方法的驗證當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進行驗證。（細(xì)菌，酵母菌和霉菌分別都需要計數(shù)方法的驗證）菌種及菌液制備 同計數(shù)培養(yǎng)鑒的適用性檢查。驗證方法 驗證試驗至少應(yīng)進行3 次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。( l )試驗組 平皿法計數(shù)時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml 和50 100CFU

8、 試驗菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加人50100CFU 試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。( 2 )菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。( 3 )供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。( 4 )稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每lml 供試液含50 100CF

9、U ，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。結(jié)果判斷 在3 次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70 % 。若試驗組的菌數(shù)回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70 % ，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1 ）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。計數(shù)方法驗證時，采用上述方

10、法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。驗證試驗也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。供試品檢查計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。按計數(shù)方法的驗證試驗確認(rèn)的程序進行供試液制備。用稀釋液稀釋成1 : 10 、1:l02 、l:103 等稀釋級的供試液。1 平皿法根據(jù)菌數(shù)報告規(guī)則取相應(yīng)稀釋級的供試液lml ，置直徑90mm 的無菌平皿中，注人15 20ml 溫度不超過45 的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置

11、培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2 個平板。陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液lml ，置無菌平皿中注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2 個平板，均不得有菌生長。培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3 天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5 天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至7 天進行菌落計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15 則兩個平板的菌落數(shù)不能相差l 倍或以上。一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡

12、萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。在特殊情況下若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細(xì)菌，則應(yīng)分別點計霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。菌數(shù)報告規(guī)則細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300CFU 、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100CFU 的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落

13、數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、lml 或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1 時，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)?？刂凭鷻z查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種 對試驗菌種的要求同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC ( B ) 44l02金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） CMCC ( B ) 26003 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副

14、傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 24 小時，用0.9 無菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數(shù)為10 100CFU 的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2 小時內(nèi)使用若保存在28 可在24 小時內(nèi)使用。適用性檢查 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養(yǎng)基的檢測項目及所用菌株見表2。表2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示能力檢查控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基

15、或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力大腸埃希菌液體培養(yǎng)基促生長能力檢查 分別接種不大于100CFU 的試驗菌（表2） 于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。固體培養(yǎng)墓促生長能力檢查 取試驗菌各0.1ml （含菌數(shù)50100CFU ）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。培養(yǎng)基抑制能力檢查 接種不少于100CFU 的試驗菌（表2 ）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng)，

16、試驗菌應(yīng)不得生長。固體培養(yǎng)基指示能力檢查 取試驗菌各0.1ml （含菌數(shù)不大于100CFU ) （表2 ）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。液體培養(yǎng)基指示能力檢查 分別接種不大于100CFU 的試驗菌（表2 ）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致?？刂凭鷻z查方法的驗證當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行控制菌檢查方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適

17、合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢查方法應(yīng)重新驗證。驗證時，依各品種項下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗證的菌株，菌種及菌液制備同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查。驗證方法 取規(guī)定量供試液及10 100CFU 試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。結(jié)果判斷 若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。供試品檢查供試品的控制菌

18、檢查應(yīng)按已驗證的方法進行。陽性對照試驗 陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加菌量為1010OCFU 。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對照試驗 取稀釋液10ml 照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長大腸桿菌檢查方法（1）大腸埃希菌（Escherichia coli ） 取供試液10ml （相當(dāng)于供試品lg 、lml 、10cm2 ) ，直接或處理后接種至適量（不少于100ml ）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 24 小時，必要時可延長至48 小時。取上述培養(yǎng)物0.2ml ，接種至含5ml MUG 培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5 小時、24 小時在366nm 紫外光

19、下觀察，同時用未接種的MUG 培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG 陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG 陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加人數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG 陰性和靛基質(zhì)陰性。結(jié)果驗證如MUG 陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG 陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824 小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落與表3 所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢

20、出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。表3 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌（Escherichia coliCMCC (

21、B ) 44l02金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） CMCC ( B ) 26003 枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis ) CMCC ( B ) 63501 白色念珠菌（Candida albicans ） CMCC ( F ) 98001 黑曲霉（Aspergillus niger) CMCC ( F ) 98003 稀釋液稀釋液配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。1 .pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液照無菌檢查法（附錄XII A ）制備。2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液按緩沖液（二部附錄XV D ）配制后，過濾，分裝

22、，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。3.0.9無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml ，過濾，分裝，滅菌。4. 靛基質(zhì)試液培養(yǎng)基及其制備方法培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。照無菌檢查法（附錄XII A ）制備1.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、對照2.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、3.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、4改良馬丁培養(yǎng)基5.改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基2.玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 對照胨 5.0g玫瑰紅鈉 0.0133g葡萄糖 10.0g瓊脂 14.0g磷酸二氫鉀 1.0g水 1000ml 硫酸鎂0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝滅菌。3.酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD ) 對照胨 10.0g瓊脂 14.0g酵母浸出粉 5.0g 水 1000ml 葡萄糖 20.0g除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，濾過，加人葡萄糖，分裝滅菌。4 膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL ) 對照胨 20.0g磷酸二氫鉀 1.3g 乳糖 5.0g牛膽鹽 2.0g氯化鈉 5.0g（或去氧膽酸鈉） ( 0.5g) 磷酸氫二鉀 4.0g水 1000ml除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，