層析原理與技術(shù)

1、 1 2021-7-12 2 2021-7-12內(nèi)容提要內(nèi)容提要1、層析原理與技術(shù)、層析原理與技術(shù)2、層析方法、層析方法凝膠過濾層析凝膠過濾層析離子交換層析離子交換層析羥基磷灰石層析羥基磷灰石層析疏水層析疏水層析親和層析親和層析 3 2021-7-12 層析的起源和原理層析的起源和原理 起源-1906年，俄國植物學(xué)家Tsweet 原理-利用物質(zhì)分配系數(shù)不同達(dá)到分離 目的0.050.0100.0% Buffer B-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.200

2、0.2500.3000.3500.4000.4500.50000:00:0001:00:0002:00:00FractionsHr:Min:SecVoltsAU層析原理層析原理Chromatography層析層析色譜色譜 4 2021-7-12什么是蛋白層析什么是蛋白層析 根據(jù)蛋白分子物理化學(xué)特性的不同而達(dá)到分離 極性/疏水性：polarity (solubility, volatility) HIC, RP 離子特性：ionic characteristics (charge) IEX 大小與形狀：size/mass (diffusion, sedimentation) GF 結(jié)構(gòu)特征與活性

3、位點(diǎn)：shape (ligand binding, affinity) AC 這些特性的區(qū)別使不同蛋白質(zhì)分子在層析的固定相和流動(dòng)相的分配不同而達(dá)到分離層析原理層析原理 5 2021-7-12分離機(jī)制 分子的大小分子的大小-凝膠過濾凝膠過濾(size-exclusion)（分子篩，分子（分子篩，分子 排阻）排阻） 分子的電性分子的電性-離子交換（離子交換（IEC）陽離子交換、陰離子交換）陽離子交換、陰離子交換 分子的表面疏水結(jié)構(gòu)分子的表面疏水結(jié)構(gòu)-疏水層析（疏水層析（HIC），反相），反相 其它：羥基磷灰石，金屬螯合其它：羥基磷灰石，金屬螯合(IMAC)，親和，染料配基介質(zhì)層析，親和，染料配基介

4、質(zhì)層析 精制（精制（polishing）：高分辨率層析）：高分辨率層析 分離機(jī)制分離機(jī)制 6 2021-7-12層析的基本概念層析原理層析原理 7 2021-7-12層析的基本概念固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì) ，能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。（在柱層析中稱其為層析填料。）它對(duì)層析的效果起著關(guān)鍵的作用。 層析原理層析原理流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體等。（柱層析中一般稱為洗脫劑。）A good gel for gel filtration contains about 95% water 8 2021-7-12凝膠過濾層析凝膠過濾層析

5、離子交換層析離子交換層析羥基磷灰石層析羥基磷灰石層析疏水層析疏水層析親和層析親和層析 9 2021-7-12GelFiltration凝膠過濾IonExchange離子交換Hydrophobic Interaction疏水層析Affinity親和層析 CHT羥基磷灰石層析原理層析原理 10 2021-7-12凝膠過濾層析凝膠過濾層析/分子篩分子篩 11 2021-7-12 分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。 具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。凝膠過濾凝膠過濾 12 2021-7-1

6、21. Spherical particles packed into a column2. Sample applied3.Buffer mobile phase and sample move through column, molecules diffuse in and out of matrix4. large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size, molecules larger than the matrix pores pass straight thro

7、ugh.DiffusionBufferDiffusion into the poresDiffusion out of the poresBuffer凝膠過濾凝膠過濾 13 2021-7-12凝膠過濾層析凝膠過濾層析分離純化原理分離純化原理 14 2021-7-12Steric exclusion leads to early elution 按照分子量大小洗脫按照分子量大小洗脫 大分子首先洗脫，最小的分子在最后面大分子首先洗脫，最小的分子在最后面洗脫洗脫 15 2021-7-12 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2Bio-Gel P4Bio-Gel P6B

8、io-Gel P10Bio-Gel P30Bio-Gel P60Bio-Gel P1001,8008004,0001,0006,000，用于脫鹽用于脫鹽1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝膠過濾層析凝膠過濾層析凝膠的選擇凝膠的選擇 16 2021-7-12柱長的選擇柱長的選擇 分離：30120cm 脫鹽：30cm以下 洗脫液洗脫液 離子強(qiáng)度低高離子作用 排阻作用（0.1-0.5M) 疏水作用 pH中性中性流速，流速，根據(jù)層析介質(zhì)的說明，一般很低樣品容量樣品容量：13CV凝膠過濾層析凝膠過濾層析操作參數(shù)選擇操作參數(shù)選擇 17 2021

9、-7-12 1.可分離相對(duì)分子量從幾百到幾十萬的物質(zhì)可分離相對(duì)分子量從幾百到幾十萬的物質(zhì) 具有3000個(gè)理論塔板的凝膠過濾可將分子量相差2倍的蛋白質(zhì)完全分開,6000個(gè)理論塔板的可將分子量相差1.5倍的蛋白質(zhì)完全分開;建議柱高在80-120cm,直徑=H/30 2.脫鹽脫鹽凝膠過濾層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析的應(yīng)用凝膠過濾層析的應(yīng)用 18 2021-7-12凝膠過濾層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析的特點(diǎn)：凝膠過濾層析的特點(diǎn)：層析柱規(guī)模很大，實(shí)驗(yàn)室1.0-2.530-100cm，工藝1020200cm，從而設(shè)備成本很高；上樣體積少，必須少于柱床體積的3才能達(dá)到較好的分離效果，如果大體積樣品必須濃縮，

10、從而造成樣品的損失和增大工藝的復(fù)雜性；工藝時(shí)間（生產(chǎn)周期）長，甚至24小時(shí)或以上；分辨率低；不需摸索純化條件，按照分子量區(qū)帶分離因此，往往用分子篩分離時(shí)只適用于純化的最后一步，或離子交換上樣前的脫鹽 19 2021-7-12離子交換層析離子交換層析 20 2021-7-12 離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。離子交換層析離子交換層析 21 2021-7-12cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQ Quaternary amineCMCar

11、boxy-methylSSulfonate離子交換層析離子交換層析離子交換層析類型及其選擇離子交換層析類型及其選擇-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3- 22 2021-7-12pIstability rangestability range與陽離子交換與陽離子交換介質(zhì)結(jié)合介質(zhì)結(jié)合+-denaturationdenaturationpH102離子交換層析離子交換層析離子交換層析原理離子交換層析原理蛋白質(zhì)滴定曲線蛋白質(zhì)滴定曲線蛋白質(zhì)凈電荷蛋白質(zhì)凈電荷與陰離子交換與陰離子交換介質(zhì)結(jié)合介質(zhì)結(jié)合 23 2021-7-12Products:UNOs

12、phere Q & S, Macro-Prep High Q & S, CM, DEAE, AG resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration-+-+-+離子交換層析離子交換層析離子交換層析原理離子交換層析原理 24 2021-7-12sampleapplicationand washelutionequilibrationregeneration-+-anionexchangerbead離子交換過程離子交換過程 25 2021-7-12離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 洗脫時(shí)多采用離子濃度梯度,常加NaCl,K

13、Cl,LiCl等. 在不同鹽濃度（離子強(qiáng)度）及其不同變化率（梯度）條件下保留行為不同，需對(duì)該條件進(jìn)行摸索。一般的，隨離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)保留值減小。緩沖液與緩沖液與pH 選擇適當(dāng)?shù)木彌_體系，起始濃度要盡可能低些(0.01-0.05M) 緩沖液PH值： 陽離子低于pI一個(gè)pH單位以上 陰離子通常高于pI一個(gè)pH單位以上 蛋白質(zhì)在不同pH下保留行為差別較大，所以許對(duì)緩沖體系和操作pH進(jìn)行摸索，以得到最佳層析條件。離子交換層析離子交換層析離子交換層析操作參數(shù)選擇離子交換層析操作參數(shù)選擇 26 2021-7-12pI5.5+-pH102離子交換層析離子交換層析緩沖液與緩沖液與pHpI7.5陽離子交換陽

14、離子交換陰離子交換陰離子交換堿性蛋白，采用陽離子交換酸性蛋白，采用陰離子交換蛋白質(zhì)凈電荷蛋白質(zhì)凈電荷pH4.0pH9.0蛋白質(zhì)穩(wěn)定性范圍蛋白質(zhì)穩(wěn)定性范圍 27 2021-7-12pH 7.0pH 8.0pH 8.9pH 6.0pH6.0pH7.0pH 8.0pH 8.9緩沖液與緩沖液與pH的影響的影響陰離子交換陰離子交換離子交換層析離子交換層析離子交換層析操作參數(shù)選擇離子交換層析操作參數(shù)選擇 28 2021-7-12離子交換層析離子交換層析離子交換層析操作參數(shù)選擇離子交換層析操作參數(shù)選擇鹽溶液梯度的影響鹽溶液梯度的影響 29 2021-7-12疏水層析疏水層析 30 2021-7-12 基于生

15、物分子表面疏水性不同而達(dá)到分離的技術(shù)基于生物分子表面疏水性不同而達(dá)到分離的技術(shù) 疏水作用來自于分子的水化結(jié)構(gòu)，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結(jié)構(gòu)，使蛋疏水作用來自于分子的水化結(jié)構(gòu)，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子外表面，從而可與疏水介質(zhì)結(jié)合白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子外表面，從而可與疏水介質(zhì)結(jié)合 不同離子的疏水性不同離子的疏水性 Anions: SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN- Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ 蛋白質(zhì)以高濃度鹽溶液結(jié)合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫蛋白質(zhì)以高濃度鹽溶液結(jié)合與疏水層

16、析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫原理原理疏水層析疏水層析 31 2021-7-12疏水層析疏水層析生物分子表面大都有或強(qiáng)或弱的疏水區(qū)域，在不同環(huán)境下，與各種疏水介質(zhì)產(chǎn)生不同強(qiáng)弱的結(jié)合高離子強(qiáng)度可加強(qiáng)疏水性跟離子交換相反，高鹽吸附，低鹽洗脫；洗脫樣品又 可直接或稍加稀釋后加上其他層析柱，作為連接層析 步驟的橋梁，取代鹽析沉淀技術(shù)配體種類繁多，很難預(yù)測哪一種、哪一個(gè)條件最適合 ，可用疏水層析試盒選擇介質(zhì) 32 2021-7-12作用原理作用原理溶質(zhì)曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG = DH - T DS 33 2021-7-12操作參數(shù)選擇操作參數(shù)選擇疏水層析疏水層析疏水介質(zhì)選擇：甲基，丁基，苯

17、基疏水疏水介質(zhì)選擇：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)：甲基，丁基疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白質(zhì)：丁基，苯基疏水性弱的蛋白質(zhì)：丁基，苯基鹽：硫酸銨，醋酸銨等等鹽：硫酸銨，醋酸銨等等緩沖體系和緩沖體系和pH洗脫梯度洗脫梯度 34 2021-7-12Sample: GFP sample brought up to 2 M AS, filteredLoad:5 mlBuffer: A:2 M (NH4)2SO4+ 0.1 M NaP, pH 7B: 0.1 M NaP, pH 7Flow Rate: 3 ml/min (230 cm/hr)0.025.050.075.0100.0

18、% Buffer B12345678910111213141516171819202122-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.20000:00:0000:10:0000:20:0000:30:00FractionsHr:Min:SecVoltsAU0.025.050.075.0100.0% Buffer B19:16.8123456789101112131415161718-0.0100.0000.0100.020

19、0.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.20000:00:0000:10:0000:20:0000:30:00FractionsHr:Min:SecVoltsAUMacro-Prep 甲基疏水甲基疏水苯基疏水苯基疏水20% EtOH疏水層析疏水層析 35 2021-7-12親和層析親和層析 36 2021-7-12親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。親和層析親

20、和層析 37 2021-7-12EquilibrationSample applicationBinding and washingDesorption and elutionEquilibrate the column and the sample to binding conditions.MatrixSpecific ligand親和層析親和層析 38 2021-7-12親和層析親和層析EquilibrationSample applicationBinding and washingDesorption and elutionTarget bindsOthers wash outApp

21、ly sample under binding conditions. 39 2021-7-12親和層析親和層析EquilibrationSample applicationBinding and washingDesorption and elutionTarget elutesChange the eluent to elute the target. 40 2021-7-12Profinity IMAC純化His-tagged ProteinChelex 100純化DNA，PCR樣品制備Affi-Gel Protein A純化單克隆抗體Dye - Affi-Gel Blue (DEAE

22、or CM) 純化單抗，分離HSAAffi-Gel 肝素凝膠肝素凝膠多種蛋白，如凝結(jié)因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶Affi-Gel Polymixin去除內(nèi)毒素（熱原）Affi-Gel 硼膠硼膠分離核苷酸、核苷、兒茶酚胺、糖類等小分子親和層析親和層析產(chǎn)品與應(yīng)用產(chǎn)品與應(yīng)用 41 2021-7-12Profinity IMAC Resins固定化金屬螯合層析：Immobilized Metal Affinity Chromatography （IMAC） 基于純化重組組氨酸標(biāo)記蛋白設(shè)計(jì)，專門純化His-tagged Protein 螯合帶電離子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+, 現(xiàn)有的產(chǎn)品為螯合Ni2

23、+的介質(zhì) UNOsphere 技術(shù)技術(shù) 更好的流動(dòng)特性，在高流速下載量，目的蛋白得率和純度不會(huì)受到影響。IDA 42 2021-7-12不同 IMAC 介質(zhì)純化氨基肽酶(aminopeptidase)純度比較Profinity IMAC, IDA ligandProfinity IMAC Resins 43 2021-7-12Profinity IMAC Resins 純化 6His-tagged proteinSample：E.coli. lysate96% 純度Profinity IMAC Resins 44 2021-7-12羥基磷灰石層析羥基磷灰石層析 45 2021-7-12 Ca1

24、0(PO4)6(OH)2 5 個(gè)帶正電荷的Ca離子對(duì)（C位點(diǎn)） 2 個(gè)磷酸三價(jià)離子，每個(gè)含有帶6個(gè)負(fù)電荷的氧原子（P位點(diǎn)） 2 個(gè)羥基 于其他層析介質(zhì)不同，CHT的骨架是化學(xué)反應(yīng)的表面CHT陶瓷羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)陶瓷羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)陶瓷羥基磷灰石（陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術(shù)）分離技術(shù) 46 2021-7-12 蛋白質(zhì)帶正電氨基蛋白質(zhì)帶正電氨基 經(jīng)典的陽離子交換經(jīng)典的陽離子交換 用中性鹽溶液用中性鹽溶液 (NaCl) 或緩沖鹽溶或緩沖鹽溶液液 (PO4)洗脫洗脫初級(jí)保留機(jī)制初級(jí)保留機(jī)制陶瓷羥基磷灰石（陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術(shù)）分離技術(shù) 47 2021-7-12 帶負(fù)電羧基帶負(fù)電羧基 經(jīng)典的金屬螯合作用，并受離子排阻調(diào)節(jié)經(jīng)典的金屬螯合作用，并受離子排阻調(diào)節(jié) 比離子間靜電相互作用強(qiáng)比離子間靜電相互作用強(qiáng)1560倍倍 在無在無PO4 條件下不能被任何濃度條件下不能被任何濃度NaCl洗脫洗脫 用用PO4洗脫洗脫初級(jí)保留機(jī)制初級(jí)保