藥物分析與檢驗(yàn)：第八章 電泳法分析

1、第八章 電泳法分析 生命科學(xué)學(xué)院制藥工程電泳技術(shù)原理1各種電泳技術(shù)2本章內(nèi)容第一節(jié) 電泳技術(shù)原理一、電泳 指帶電粒子在電場(chǎng)中向與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。 當(dāng)溶液pH大于蛋白質(zhì)pI， 蛋白質(zhì)帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。如果pH小于pI，帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)。蛋白質(zhì)pH值在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，在電場(chǎng)中不向任何一極移動(dòng)。二、電泳技術(shù)分類按支持介質(zhì)不同分為紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。按凝膠形狀分為水平平板電泳，圓盤柱狀電泳，垂直平板電泳。三、遷移率 定義：指帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下泳動(dòng)的速度。 影響遷移率因素：電荷：遷移率與顆粒表面電荷成正比。顆粒大小和形狀：遷

2、移率與顆粒半徑，介質(zhì)黏度成反比。電場(chǎng)強(qiáng)度：指單位長(zhǎng)度支持物體上的電位降。電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動(dòng)速度越快。 常壓電泳（100-500V） 高壓電泳（500-10000V）緩沖溶液pH值：決定顆粒帶電情況溶液離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，遷移率越小溫度和黏度第二節(jié) 各種電泳技術(shù)紙電泳法醋酸纖維素電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法高效毛細(xì)管電泳等電聚焦電泳 （一）儀器裝置（水平式電泳室）一、紙電泳法一、紙電泳法（二） 操作方法：1 電泳緩沖液：枸櫞酸鹽緩沖液2 濾紙：選擇質(zhì)地均勻，吸附力小的濾紙3 點(diǎn)樣 濕法點(diǎn)樣：將裁好的濾紙全部浸入電泳緩沖液濕潤(rùn)后取出，夾在干燥濾紙

3、中吸干平放濾紙上，濾紙兩端浸入緩沖液，微量注射器10微升點(diǎn)樣。 干法點(diǎn)樣：將樣品直接點(diǎn)在濾紙上吹干，點(diǎn)完規(guī)定量的樣品溶液，噴霧器濾紙噴濕，適于低濃度樣品溶液。4 電泳 樣品點(diǎn)移6-8cm切斷電源，一般電壓梯度18-20V/cm，1-2小時(shí)，紫外光檢視。5 剪下樣品供試液斑點(diǎn)和斑點(diǎn)位置面積接近的空白濾紙，剪成細(xì)條放于試管，加鹽酸溶液過(guò)濾離心取上清液測(cè)吸光度值，計(jì)算含量。例：三磷酸腺苷二鈉片的含量測(cè)定三磷酸腺苷二鈉（ATP）在生產(chǎn)過(guò)程及貯存期間均易引入二磷酸腺苷（ADP）與單磷酸腺苷（AMP）等雜質(zhì)。1 緩沖液與濾紙制備 枸櫞酸鹽緩沖液（pH3.0） 濾紙甲酸溶液浸泡，水漂洗，烘箱烘干2 供試品溶

4、液的制備精密稱取加水，振搖，取濾液3 電泳距底部5cm劃基線，干法點(diǎn)樣，放置于電泳槽架，電泳1-1.5h，吹干，置紫外燈檢視，鉛筆劃出紫色斑4 含量測(cè)定剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置面積接近的空白濾紙，剪成細(xì)條放于試管，加鹽酸溶液過(guò)濾離心取上清液，257nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，計(jì)算含量。一、紙電泳法1 試劑： 緩沖液配置：醋酸-鋰鹽緩沖液 染色液：甲苯胺藍(lán)溶液2 操作： 制膠：瓊脂糖加水，加熱后溶脹，加緩沖液，涂 布玻璃板上 點(diǎn)樣與電泳：電泳槽加入緩沖液，凝膠板放置電 泳槽架上 染色：甲苯胺藍(lán)，水洗多余染色液3 優(yōu)點(diǎn)：電泳速度快，分辨率高，透明而不吸收紫 外線，區(qū)帶易染色，樣品易回收 二、瓊脂糖凝膠

5、電泳法 醋酸纖維薄膜由醋酸纖維素加工制成。1 試劑配置：巴比妥緩沖液，氨基黑染色液， 漂洗液 透明液2 操作：點(diǎn)樣，電泳，染色，漂洗，透明，含量測(cè)定（洗脫法，掃描法）3 優(yōu)點(diǎn)：電泳區(qū)帶清晰，電泳速度快，蛋白質(zhì)，染料不吸附，無(wú)拖尾現(xiàn)象。三、醋酸纖維素薄膜電泳法（一）支持介質(zhì)是聚丙烯酰胺凝膠，是常用的電泳方法。（二）制備原理 聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺聚合而成。 化學(xué)聚合（過(guò)硫酸銨）光聚合 （核黃素）（三）優(yōu)點(diǎn)： 1 電滲作用小 2 凝膠孔徑可按需要控制大小 3 熱穩(wěn)定性好 4 化學(xué)純度高，污染小。 5 280nm 波長(zhǎng)處無(wú)吸收，利于蛋白質(zhì)檢測(cè)。四、聚丙烯酰胺凝膠電泳法（四）

6、電泳原理：1 樣品濃縮效應(yīng) 連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng) 濃縮膠：樣品濃縮在膠界積聚薄層 分離膠：電泳2 凝膠分子篩效應(yīng)3 電泳分離電荷效應(yīng) 四、聚丙烯酰胺凝膠電泳法（五）操作方法儀器裝置：電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成試劑：三羥基甲基氨基甲烷，四甲基乙二胺， 過(guò)硫酸銨操作：制膠、標(biāo)準(zhǔn)液與供試液制備 電泳、染色、脫色、檢測(cè) 相對(duì)遷移率計(jì)算、掃描 進(jìn)膠端到供試品或標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)帶的距離 進(jìn)膠端到溴酚藍(lán)區(qū)帶的距離 四、聚丙烯酰胺凝膠電泳法相對(duì)遷移率= （一）原理：根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉SDS按質(zhì)量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白分子所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白分子凈電荷，消除不同蛋白分子電荷效應(yīng)

7、。蛋白分子相對(duì)遷移率大小完全取決于分子量高低。蛋白分子按大小分離。（二）優(yōu)點(diǎn)：消除不同蛋白質(zhì)分子電荷效應(yīng)干擾，誤差小，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。五、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（三）操作方法1 試劑（1）30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺（2）分離膠緩沖液：三羥甲基氨基甲烷，加水，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8（3）濃縮膠緩沖液：三羥甲基氨基甲烷，加水，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.82 操作（1）制膠（2）對(duì)照品和供試品溶液制備（3）電泳五、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（4）固定與染色考馬斯亮藍(lán)染色銀染色（5）相對(duì)遷移率計(jì)算 蛋白遷移距離 脫色前膠條長(zhǎng)度 脫色后膠條長(zhǎng)度 溴酚藍(lán)指示劑遷移距離五、SDS-

8、聚丙烯酰胺凝膠電泳法相對(duì)遷移率= （一）原理：等電聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH值梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H值位置上。（二）優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，等電聚焦區(qū)帶窄，穩(wěn)定，精確度高，濃度低樣品液可分離，濃縮作用。六、等電聚焦電泳法以A，B兩種蛋白質(zhì)為例，作出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環(huán)境中的pH值，縱軸代表蛋白質(zhì)的凈電荷，在 pH 6.5時(shí)，A帶有兩個(gè)正電荷，B帶有一個(gè)負(fù)電荷。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的等電點(diǎn)。（三）pH梯度形成 1 人工pH值梯度

9、：用兩種不同pH的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成pH梯度，不穩(wěn)定，離子運(yùn)動(dòng)影響pH梯度。 2 天然pH值梯度：利用兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下自然形成pH梯度，電解硫酸鈉稀溶液，陽(yáng)極吸引負(fù)電荷聚焦硫酸，陰極吸引正電荷帶負(fù)電。甲向陽(yáng)極移動(dòng)時(shí)接近硫酸失電荷到達(dá)等電點(diǎn)。具有很高緩沖能力。環(huán)境pH等于其等電點(diǎn)。用增加pI級(jí)數(shù)的方法形成陽(yáng)極向陰極逐漸升高，穩(wěn)定的pH梯度。六、等電聚焦電泳法（四）載體兩性電解質(zhì)條件 等電點(diǎn)處具有足夠緩沖能力，不能被樣品改變pH值梯度，化學(xué)組成穩(wěn)定不影響等電點(diǎn)，具有足夠高電導(dǎo)，均勻，分子量要小，便于與樣品分離，化學(xué)樣品組成不干擾測(cè)定。（五）密度梯度等電點(diǎn)聚焦 密度梯度防止對(duì)流以保持

10、pH值梯度，如蔗糖密度梯度，用溶解度高，黏度低，密度大的重溶和輕溶液以梯度混合形成。pH值梯度選擇，蛋白質(zhì)樣品及分離容量。（六）檢測(cè)方法 蛋白質(zhì)染色，已知pI值蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)電泳pI值位置，距離縱坐標(biāo)，繪制pI梯度曲線，橫坐標(biāo)。六、等電聚焦電泳法 （一）基本原理：高效毛細(xì)管電泳以彈性（熔融毛細(xì)管脆易折斷，涂聚酰亞胺，石英毛細(xì)管富有彈性）石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中個(gè)組分之間淌度（離子淌度，遷移率）和分配行為上的差異實(shí)現(xiàn)分離的分析方法。電泳與電滲作用。帶電粒子遷移速度等于電泳電滲矢量和。電滲速度一般大于電泳速度。 （二）毛細(xì)管分離模式 （三）優(yōu)點(diǎn) 高效 快速 微量 多模式 自動(dòng) 經(jīng)濟(jì) 潔凈等。七、高效毛細(xì)管電泳法電泳現(xiàn)象： 帶電離子在電場(chǎng)作用下的遷移，速度電泳電滲流現(xiàn)象： 玻璃表面存在硅羥基, pH3時(shí), 形成雙電層，在高電場(chǎng)的作用下引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度電滲流。帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子：無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出； 陰離