配子與胚胎生物技術

1、第一節(jié) 動物胚胎移植 胚胎移植（embryo transfer）：將動物 的早期胚胎移植到與胚胎相對應生理狀 態(tài)的雌性受體子宮中，使之發(fā)育為成熟 的個體。 提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的 個體稱為受體。 一、胚胎移植發(fā)展歷史 1890年英國劍橋大學Walter Heape首次獲得兔胚胎移植成功。 20世紀30年代，在兔、大鼠和小鼠方面進行了更多的實驗， 成為實驗生物學中研究受精、胚胎發(fā)育等問題的一個重要方 法。 家畜的胚胎移植，最早是在20世紀30年代在綿羊和山羊方面 進行的。 在20世紀60年代以來，對家畜胚胎的采取、保存、移植等技 術環(huán)節(jié)進行了大量的試驗研究工作，取得不少進展。 20世

2、紀70年代以后，胚胎的移植技術可以說發(fā)展到在畜牧生 產(chǎn)中實際應用的階段。 近些年來，胚胎移植技術已在動物引種和改良方面廣泛應用， 已成為體外受精、嵌合體、轉(zhuǎn)基因和克隆動物實現(xiàn)的應用技 術，試管牛、轉(zhuǎn)基因豬和克隆羊均是通過胚胎移植途徑生出 的。 二、胚胎移植的意義 1.充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，提高繁殖效率 2.加速品種改良，擴大良種畜群 3.誘發(fā)肉畜懷雙胎，提高生產(chǎn)效率 4.代替種畜的引進 5.保存品種資源 6.防疫需要和克服不孕 7是實現(xiàn)克隆動物等的必需手段 三、胚胎移植的生理學基礎和 原則 (一)生理學基礎 1.發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育 2.早期胚胎的游離狀態(tài) 3.胚胎移植不存在免疫問題

3、 4.胚胎和受體的聯(lián)系 5.胚胎的遺傳特性 (二)胚胎移植的基本原則 1.胚胎移植前后所處環(huán)境的同一性 （）供體和受體在分類學上的相同屬性 （）動物生理上的一致性 （）動物解剖部位的一致性 2.胚胎發(fā)育的期限 3.胚胎的質(zhì)量 (三)胚胎移植應具備的基本條件 1.胚胎來源 2.技術條件 3.受體母畜 四、胚胎移植的技術程序 胚胎移植時，希望一次從供體母畜得到 多數(shù)胚胎，所以要進行超數(shù)排卵處理， 同時，胚胎移植成功的根本條件是供體 和受體必須同時發(fā)情，故需人為控制供 受體的發(fā)情時間，進行同期化處理。 （一）供受體準備 選擇的供體不但應有育種上的價值，期 望從它們得到很多的后代，而且生殖機 能應處于

4、較高的水平。 受體母畜可選用非優(yōu)良品種的個體或土 種家畜但亦應具有良好的繁殖性能和健 康狀態(tài)，體型中上等。 （二）超數(shù)排卵 在母畜發(fā)情周期的適當時間，注射促性 腺 激素，使卵巢中比在自然情況下有較 多的卵泡發(fā)育并排卵，這種方法稱為超 數(shù)排卵（superovulation），簡稱超排。 超數(shù)排卵主要應用于牛和羊，效果明顯， 對于產(chǎn)多胎的豬意義不大，而母馬很難 產(chǎn)生反應。一般認為以1020個最為理 想。 1母牛 在預計自然發(fā)情的前4d，即發(fā)情周期的第16天或第17天肌肉或 皮下注射PMSG15003000IU（或同時加注HCG10001500IU）。 這種方式是按照發(fā)情周期的規(guī)律，在黃體期將要結(jié)束

5、，卵泡期 即將到來之前，順勢促進較多的卵泡生長和成熟。這樣做必須 和發(fā)情周期的進程配合好，所以在安排時間上受到限制，應用 不方便。另一種方式是在發(fā)情周期的中期，在注射促性腺激素 的同時，施用PGF2a或其類似物以溶解黃體。一般是在周期的 第1013天（815天）內(nèi)進行，一次肌注上述量的PMSG，隔 日再注射以PGF2a。如用FSH（或FSH+LH），則連續(xù)注射34d， 每天早晚各一次，總量為3040mg（國產(chǎn)品400500大鼠單位， 第一天用量可稍多，第3天的第5次注射時，同時注射PGF2a。 2、母羊 在周期第12天或第13天時，一次肌注（或皮下）PMSG750 1500IU。出現(xiàn)發(fā)情后或配

6、種當日再肌注HCG500750IU。也 可像母牛一樣在發(fā)情周期中期進行處理，在注射PMSG之后， 隔日注射以PGF2a或類似物。如采用FSH，用量為1020mg （或200300大鼠單位）分3d6次注射之，PGF2a在第5次同 時注射之。 （三）供體母畜的配種 超數(shù)排卵處理的母畜發(fā)情后，根據(jù)育種 的需要，應選擇優(yōu)良公畜的精液，在適 宜時間進行人工授精。為了得到較多的 發(fā)育正常的胚胎，應使用活率高密度大 的精液，而且將授精次數(shù)增加到2次或3 次，兩次間隔810h。 （四）胚胎的收集 胚胎的收集是利用沖洗液將胚胎由生殖道中沖 洗，并收集在器皿中。 沖洗時要考慮到配種時間、發(fā)生排卵的大致時 間、胚胎

7、的運行速度和發(fā)育階段等因素，只有 這樣，才能順利迅速地進行操作，得到較高的 收集率。關于各種家畜受精后胚胎發(fā)育的速度 和運行情況（所處部位）收集時間不應早于排 卵后的第一天，亦即最早要在發(fā)生第一次卵裂 之后，否則不宜辨別卵子是否已受精。 一般是在配種后38d，發(fā)育至48個細 胞以上為宜。牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹 胚晚期或胚泡早期進行收集和移植（配 種后68d）。 1.手術法收集胚胎 按照外科手術的要求，在腹部適當部位 作一切口，用注射器吸取沖洗液注入輸 卵管或子宮角內(nèi)，進行沖洗，同時觀察 卵巢上的排卵情況，計算排卵率。沖洗 部位決定于胚胎所處位置，亦即取決于 沖洗是在配種后的第幾天進行以及胚胎

8、的運行速度。 用注射器的磨鈍針頭刺入子宮角頂端，注入沖洗液，然 后從輸卵管的傘部接取沖洗液，這種方式適用于牛、羊、兔 等。 由傘部注入沖洗液，在子宮角上端接取。豬和馬的子宮 角與輸卵管接合部有一活塞狀結(jié)構(gòu)，用第一種方式，沖洗液 不易通過，只能采用第二種方式。 從子宮角上端注入沖洗液，由基部接取，或者相反。這 種方式適合于各種家畜。 沖洗操作，要求迅速準確，防止對 傷口、生殖器官和沖洗液的污染，避免 對動物有過多刺激和對生殖器官造成損 傷。一般來說，術后生殖道易發(fā)生不同 程度的粘連，嚴重時會造成不孕。這是 手術法的最大缺點。沖洗之后，立即縫 合傷口，宜單獨飼養(yǎng)，注意傷口愈合情 況。 2.非手術法

9、收集胚胎 牛的非手術收集胚胎可利用二路式 導管沖卵器，將沖洗液通過內(nèi)管注入子 宮角內(nèi)，然后導出沖洗液，外管前端連 接以氣囊，當將沖卵器插入子宮內(nèi)時， 充氣使氣囊脹大，堵住子宮頸內(nèi)口以免 沖洗液經(jīng)子宮頸流出。 非手術法沖取胚胎，每側(cè)子宮角需用 沖洗液100150ml。應用非手術法沖洗 收集胚胎時，只能當胚胎都進入子宮角 后進行。牛、馬的胚胎用非手術法收集 時，一般在配種后68d進行。 3.沖洗液 收集胚胎的沖洗液有多種，在早期的胚胎 移植試驗中，各種生理鹽液如林格氏液、洛克 氏液、臺氏液等和自體血清以及血清和鹽液的 混合液，曾作為沖洗收集胚胎之用?，F(xiàn)在多采 用杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）、布林斯特

10、液 （Brinsters medium-3）、合成輸卵管液 （SOF）、惠屯氏液（Whittens medium）、 海姆氏液（Hams F-10）以及199培養(yǎng)液 （TCM199）。它們除含各種鹽類外，還含有 多種有機成分，不但用于沖洗收集胚胎，還用 于體外培養(yǎng)、冷凍保存和解凍等處理程序。 （五）胚胎的檢查 收集到的沖洗液，需靜置10min。待 胚胎下沉后，移去上層液，再放于解剖 鏡下，檢查胚胎數(shù)量和發(fā)育情況。正常 發(fā)育的胚胎，其中細胞（卵裂球）一般 外形整齊清晰，大小較一致，分布均勻 而緊密，發(fā)育速度與胚胎日齡相一致。 （六）胚胎的保存和培養(yǎng) 保存是使胚胎在體外一定條件下（降溫） 停止發(fā)育

11、，延長其在體外的生存時間， 當需要時，升溫后進行移植。 培養(yǎng)則是在體溫條件下，于培養(yǎng)液中， 使之繼續(xù)發(fā)育。 放在室溫條件下，胚胎只能存活1020h。當溫度 降至20以下時，胚胎即停止發(fā)育，存活時間可以 延長。 胚胎在體溫環(huán)境下（37）的培養(yǎng)，有一部分可正 常發(fā)育，但發(fā)育持續(xù)的時間和達到的階段也是非常 有限的，一般只能持續(xù)34d。 利用兔體（輸卵管）進行活體內(nèi)培養(yǎng)（保存），然 后再取出移植至同種畜體內(nèi)，在羊、豬、牛、馬都 已試驗成功，經(jīng)過長途運輸，移植后妊娠產(chǎn)仔，但 必須進行兩次沖洗和移植的手術，降低了它的實用 價值。 冷凍長期保存牛、綿羊、山羊的胚胎經(jīng) 冷凍解凍后能夠存活，且移植后均可受 胎產(chǎn)

12、仔。 在冷凍前需先依次經(jīng)過含有由低濃度到 高濃度防凍劑的杜氏培養(yǎng)液，防凍劑的 最高梯度為1.01.5mol/L。每種濃度中 停留510min，在最后一種濃度中降溫 冷凍。胚胎冷凍時必須采取緩慢降溫。 由室溫降至-5-7，每分鐘降1， 在此溫度下進行誘發(fā)結(jié)冰，然后按每分 鐘降0.30.5的速度降至-33- 38，此后可直接浸入液氮保存。 解凍時不必控制升溫速度，可直接放在室溫條件 下（2025）或在3537水浴中解凍。 解凍后必須再把防凍劑清除掉。方法是使胚胎按 相反的方向（由高濃度向低濃度）依次通過含有 不同濃度的防凍劑的培養(yǎng)液，最后移至不含防凍 劑的培養(yǎng)液中進行移植。 牛胚胎冷凍較新的一種方

13、法是在塑料細管中進行 冷凍，一端裝有胚胎和冷凍培養(yǎng)液，另一端為蔗 糖液，解凍后隨即被蔗糖液稀釋，以沖淡防凍劑 的含量，將塑料管直接裝入移植器中，然后注入 子宮。 （七）胚胎的移植 胚胎的移植也有手術法和非手術法兩種 方式，手術法一般用于所有的動物，主 要用于小動物。而非手術法僅適用于牛、 馬及馬鹿等大動物 1.手術法移植 在受體腹部作一切口，找到排卵一側(cè)的 卵巢并觀察黃體發(fā)育情況，用注射器或 移植管將胚胎注入到同側(cè)子宮角上端或 輸卵管壺腹部內(nèi)（以胚胎發(fā)育階段而 定）。只需吸取少量的沖洗液連同胚胎 一塊注入。 2.非手術移植法 牛的非手術移植，主要方式是將一只手 伸入直腸，先檢查黃體位于哪一側(cè)和

14、發(fā) 育情況，然后握住子宮頸（如同人工授 精操作一樣），另一只手將移植管（注 射器連接以導管或特制金屬移植器）插 入與黃體同側(cè)的子宮角內(nèi)，注入胚胎。 （八）供體和受體的術后觀察 對術后的供體和受體不但要求注意它們 的健康情況，同時要留心觀察它們在預 定的時間是否發(fā)情。 供體在下次發(fā)情時即可照常配種，或經(jīng) 過二、三個月再重復作為供體，收集胚 胎。受體母畜術后如發(fā)情則說明未受胎， 移植失敗。 第二節(jié) 體外受精 哺乳動物精子和卵子的受精在自然情況 下都是在動物生殖道內(nèi)完成的，將這個 生理過程在體外實驗室的培養(yǎng)皿內(nèi)進行， 則稱為體外受精（in vitro fertilization， IVF ）。 一、

15、 發(fā)展簡史 1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞學者 Austin分別發(fā)現(xiàn)了精子獲能（cap acitation） 現(xiàn)象，使動物體外受精研究進入了新紀元。 1959年張明覺在世界上首先獲得了體外受精的 的哺乳動物試管兔，推動了體外受精研究工 作的開展。 1978年首例人類試管嬰兒路易斯布朗 （Louise Brown）誕生。 直到20世紀80年代，家畜的體外受精技術才取 得突破，尤其是牛的體外受精技術發(fā)展迅速。 1981年Brackett等用體內(nèi)成熟卵母細胞獲得試 管牛犢，隨后Hanada等（1985）獲得綿羊和山 羊體外受精后代，并于1986年獲得體外成熟卵 母細胞體外受精的第一頭犢牛。 我

16、國學者盧克煥（1987）在愛爾蘭獲得全體外 過程的試管牛犢。 二、意義 1. 可以以較低的成本，大規(guī)模地批量生 產(chǎn)各發(fā)育期的動物胚胎。 2. 作為胚胎移植技術常規(guī)服務的一部分。 三、技術程序 體外受精包括以下步驟：卵母細胞的獲 取、卵母細胞成熟、精子獲能、卵母細 胞受精和受精后的體外胚胎培養(yǎng)。 ( (一一) )卵母細胞的獲得和成熟培養(yǎng) 1.屠宰場卵巢 從屠宰場采集卵巢保持在3035，運回實 驗室，吸取26mm直徑的卵泡。 2.活體取卵母細胞 20世紀80年代末90年代初，超聲波或腹腔鏡引 導經(jīng)陰道穿刺采卵，吸取有腔卵泡中的卵母細 胞的技術問世，這項技術與屠宰后動物卵巢取 卵相比，稱為活體取卵（

17、OPU，ovum pick- up）。 3.卵母細胞成熟培養(yǎng) 選擇卵丘細胞完整，形態(tài)良好的卵母 細胞進行成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件是39， 5%CO2，卵母細胞在培養(yǎng)皿液滴內(nèi)培養(yǎng) 約24h。 (二)體外受精 1.精子的獲能處理 哺乳動物的獲能方法有培養(yǎng)和化學誘導 兩種方法。 2.受精 獲能的精子和成熟的卵子共培養(yǎng)。 (三)胚胎培養(yǎng) 體外胚胎生產(chǎn)中，受精卵子在培養(yǎng)液中停留 78d。 主要有兩類培養(yǎng)系統(tǒng)：一是含有體細胞的共培 養(yǎng)系統(tǒng)，二是限定或半限定的培養(yǎng)系統(tǒng)。 牛受精卵的共培養(yǎng)通常是用TCM-l99或其他液 體添加血清，選用的體細胞有牛顆粒細胞，輸 卵管上皮細胞等。整個培養(yǎng)系統(tǒng)中不用體細胞 的稱為半限定

18、或限定培養(yǎng)系統(tǒng)，取決于是否使 用了血清和蛋白或合成的大分子添加物， 第三節(jié) 克隆技術 克?。╟longning）是指一個細胞或個體 以無性繁殖方式產(chǎn)生遺傳物質(zhì)完全相同 的一群細胞或一群個體。 在動物繁殖學中，它是指不通過精子和 卵子的受精過程而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)完全相 同新個體的一門胚胎生物技術。 哺乳動物的克隆技術包括胚胎分割和細 胞移植兩種。 一、 胚胎分割 胚胎分割（embryo splitting）是運用顯 微操作系統(tǒng)將哺乳動物附植前胚胎分成 若干個具有繼續(xù)發(fā)育潛力部分的生物技 術，運用胚胎分割可獲得同卵孿生后代。 （一）發(fā)展簡介 Spemann在1904年最先進行蛙類2-細胞胚胎 的分割實

19、驗，并獲得同卵雙生后代。 1970年，Mullen等通過分離小鼠2-細胞胚胎卵 裂球，獲得同卵雙生后代。 1979年Willadsen和Meineck-Tillman等成功地 進行了綿羊早期胚胎的分割。 20世紀80年代以后，哺乳動物胚胎分割技術發(fā) 展迅速，Willadsen等在總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎 上，建立了系統(tǒng)分割方法，并運用這種方法獲 得綿羊的四分之一和八分之一胚胎后代和牛的 四分之一胚胎后代。 （二）胚胎切割技術 1.切割器具的準備 胚胎分割需要的器械有體視顯微鏡，倒置顯微 鏡和顯微操作儀。 在進行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分 割針，固定管要求末端鈍圓，外徑與所固定胚 胎直徑相近，

20、內(nèi)徑一般為2030m。切割針 目前有玻璃針和微刀兩種，玻璃針一般用實心 玻璃拉成，微刀是用鋒利的金屬刀片與微細玻 璃棒粘在一起制成。 2.胚胎預處理 為了減少切割損傷，胚胎在切割前一般 用鏈霉蛋白酶進行短時間處理，使透明 帶軟化并變薄或去除透明帶。 3.胚胎分割 在進行胚胎切割時，先將發(fā)育良好的胚 胎移入含有操作液滴的培養(yǎng)皿中，操作 液常用杜氏磷酸緩沖液，然后在顯微鏡 下用切割針或切割刀把胚胎一分為二。 不同階段的胚胎，切割方法略有差異： （）桑椹胚之前的胚胎這一階段胚胎因為卵 裂球較大，直接切割對卵裂球的損傷較大。常 用的方法是用微針切開透明帶，用微管吸取單 個或部分卵裂球，放入另一空透明帶

21、中，空透 明帶通常來自未受精卵或退化的胚胎。 （）桑椹胚和囊胚的分割對于這一階段的胚 胎，通常采用直接切割法。操作時，用微針或 微刀由胚胎正上方緩慢下降，輕壓透明帶以固 定胚胎，然后繼續(xù)下切，直至胚胎一分為二， 再把裸露半胚移入預先準備好的空透明帶中， 或直接移植給受體。 4.分割胚的培養(yǎng) 為提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率， 分割后的半胚需放入空透明帶中或者用 瓊脂包埋移入中間受體在體內(nèi)或直接在 體外培養(yǎng)。 5.分割胚胎的保存和移植 胚胎分割后可以直接移植給受體，也可 以進行超低溫冷凍保存。 為提高冷凍胚胎移植后的受胎率，分割 的胚胎需要在體內(nèi)或體外培養(yǎng)到桑椹或 囊胚階段，再進行冷凍。 （三

22、）胚胎分割技術的進展 哺乳動物的胚胎分割技術在近20年取得 了較大進展，主要表現(xiàn)為操作方法趨于 簡化，效率提高。在牛的胚胎移植生產(chǎn) 中，胚胎分割已用于提高胚胎移植的總 受胎率和克服異性孿生不育。此外，胚 胎分割取樣已用于胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn) 基因陽性胚胎的早期選擇。 （四）胚胎分割目前存在的問題 1.初生重低 2.遺傳一致性不同 3.同卵多胎的局限性 第一節(jié) 動物胚胎移植 胚胎移植（embryo transfer）：將動物 的早期胚胎移植到與胚胎相對應生理狀 態(tài)的雌性受體子宮中，使之發(fā)育為成熟 的個體。 提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的 個體稱為受體。 2、母羊 在周期第12天或第13天時，一次肌注（或皮下）PMSG7