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1、DOC格式論文,方便您的復(fù)制修改刪減抗人DcR3單克隆抗體的研制及其鑒定(作者:單位:郵編:)作者:吳春風(fēng),馬忠森,王秀麗,楊俊玲,楊洋,張越,圖 們?yōu)趿?,喬俊華【摘要】目的:制備抗人DcR3單克隆抗體(mAb),并鑒定其特異性。方法:純化的HisDcR3融合蛋白免疫小鼠,應(yīng)用淋巴細(xì) 胞雜交瘤技術(shù)制備抗人DcR3 mAb并進行純化,純化后的抗體經(jīng)Western blot和ELISA方法鑒定其特異性、|g亞型和效價。結(jié)果:獲 得5株穩(wěn)定分泌抗DcR3 mAb的雜交瘤細(xì)胞,均屬lgG1亞型,其腹 水抗體效價為1 X10-51 X10-7, Western blot顯示5株細(xì)胞分泌的 mAb均可識

2、別DcR3蛋白,其中1株(1B1 )可與SW480細(xì)胞成分 反應(yīng)。結(jié)論:成功建立穩(wěn)定分泌抗人DcR3 mAb的雜交瘤細(xì)胞株,其 分泌的抗體特異性強、效價高,為研究DcR3在組織中的表達(dá)、分布及研制ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)?!娟P(guān)鍵詞】DcR3單克隆抗體 制備Abstract AIM: To prepare monoclonal antibodies(mAbs)aga inst huma n DcR3 and ide ntify their characterizati on. METHODS:BALB/c mice were immuni zed with purified HisDcR3 pr

3、ote in, andmAbs aga inst DcR3 which prepared by hybridoma tech nique were purified and identified by their specificity, subtype, titers via ELISA and Western blot. RESULTS: Five hybridoma cell lines secreting mAbs aga inst huma n DcR3 were obta in ed, which were determ ined as IgG1 subtype and ascit

4、es titers of five mAbs against DcR3 reached 1 X10-5-1 X10-7. Five mAbs were proved to recognize HisjDcR3 protein specifically, one of which (1B1) could recognize SW480 cell. CONCLUSION: mAbs aga in st DcR3 with high titers and specificity have bee n prepared and purified successfully, which laid a f

5、oundation for the study of DcR3 expression, distribution in tissu and development of ELISA kit.KeywordsDcR3; monoclonal an tibody; preparati on誘騙受體3(decoy receptor 3, DcR3, 又稱TR6)為近年新發(fā)現(xiàn) 的一種可溶性腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員,可競爭性結(jié)合 腫瘤壞死因子(TNF)成員LIGHT、 FasL及TL1A1, 2,但并不介導(dǎo) 細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞的生長、分化、死亡以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用,與腫瘤、自身免疫

6、疾病、移植排斥等密切相關(guān)。應(yīng)用DcR3 抗體研究DcR3在上述病變組織或細(xì)胞中的表達(dá)現(xiàn)已成為研究熱點。 目前,國外已有商品化的抗人DcR3 mAb,但價格昂貴,國內(nèi)尚無這 方面的研究報道。我們運用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備了抗人DcR3 mAb,并進行了鑒定,為研究DcR3在組織中的表達(dá)、 分布及研制ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料 純化的HisDcR3融合蛋白為本室自制3;RPMI1640 購自 Hyclone 公司;PEG4000 購自 Merck 公司;HAT、HT 購自Sigma公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔IgG抗體購自Santa Cruze公司;抗體亞類測定試劑盒購自

7、 Serotech公司;Protein A親和 層析膠購自Pierce公司;PVDF膜購自Amresco公司;ECL化學(xué)發(fā)光 試劑盒購自Amersham公司。Sp2/0細(xì)胞株取自東北師范大學(xué)細(xì)胞 遺傳所;高表達(dá)DcR3的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株由本室保存;BALB/c小鼠(68周齡,雌性,清潔級)購自吉林省生物制品所。1.2方法1.2.1動物免疫 純化的HisDcR3融合蛋白免疫 BALB/c小鼠, 初次免疫取100山(約50)抗原加等量弗氏完全佐劑充分乳化, 腹腔注射,第14天取100讓(約50)加等量弗氏不完全佐劑加強 免疫,以后每隔2周等量抗原不加佐劑腹腔免疫 2次,測定小鼠血清 抗體效

8、價達(dá)1 :06以上時準(zhǔn)備融合,融合前3 d取效價最高的小鼠腹 腔注射抗原100血。1.2.2雜交瘤細(xì)胞株的建立及 mAb的制備(1)細(xì)胞融合:無菌 條件下,取對數(shù)生長的Sp2/0細(xì)胞,1000 r/min離心8 min,棄上清, 用RPMI1640不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù),取所需的細(xì)胞數(shù)。制備 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液,將Sp2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 5的比例混合, 37 C水浴500 mL/L PEG4000作用下進行融合,融合后1000 r/min離心8 min,棄上清,用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT選擇培養(yǎng)液輕輕混懸, 接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置37 C、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 第10

9、天換HT選擇培養(yǎng)液,第14天換含200 mL/L胎牛血清的 RPMI1640完全培養(yǎng)液。篩選及克隆化:23周后當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長 至孔底面積1/10以上時,分別包被HisDcR3融合蛋白與His蛋白, 同時設(shè)立陰、陽性及空白對照,應(yīng)用間接ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液。以P/N支.1為陽性,選取與HisDcR3融合蛋白反應(yīng)陽性而與 His 蛋白反應(yīng)陰性孔的細(xì)胞通過有限稀釋法連續(xù)克隆23次,直至所有單個克隆細(xì)胞陽性孔率為100%時擴大培養(yǎng),進行細(xì)胞凍存和腹水制 備。(3)腹水制備及純化:每只BALB/c小鼠腹腔注射無菌液體石蠟 500也7 d后每只鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞 6 X105個,14 d左右采集

10、 腹水。SiO2吸附法對腹水進行預(yù)處理,采用辛酸飽和硫酸銨沉淀法 4、ProteinA親和層析進行純化,紫外分光光度法測定純化后 mAb 含量,純化后mAb過濾除菌加等量甘油,分裝-70 C凍存。1.2.3 mAb的鑒定(1)效價的測定:將純化前后的mAb倍比 稀釋,以1 :00稀釋的正常小鼠血清作為陰性對照,應(yīng)用間接ELISA 方法測定A492,以P/N支.1為陽性。(2)免疫球蛋白類和亞類的鑒 定:按操作說明將雜交瘤上清1 200稀釋,取150讓稀釋液加入含 有亞類定性試劑的試管底部,30 s后將試紙條插入管底,510 min 后觀察結(jié)果,判讀輕鏈、重鏈。(3)雜交瘤細(xì)胞染色體核型分析:生

11、長良好的雜交瘤細(xì)胞懸液10 mL加入秋水仙素,使其終濃度為0.1 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)3 h, 1000 r/min離心10 min,重蒸水室溫低滲處理20 min,離心棄上清,細(xì)胞固定后Gimsa染色,油鏡下觀察染色體計 數(shù)。(4)相對親和力鑒定:參照文獻(xiàn)5。采用非競爭ELISA方法確 定單克隆抗體的親和力。分別以不同濃度(1、5、10 g/L )的純化的DcR3融合蛋白為固相,加入倍比稀釋的純化 mAb及HRP標(biāo)記的 羊抗小鼠IgG,以O(shè)PD為底物測定A492值。按照公式Kaff=(n 1)/2(nAb b)計算各mAb親和力大小。(5) Western blot鑒定抗體 特異性:將純化的D

12、cR3蛋白、pET28a(+)空載體蛋白、 人結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞株培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解制成的細(xì)胞懸液經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,以1 :000稀釋的小鼠腹水為一抗,以1 :10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為二抗,通過ECL顯色系 統(tǒng)進行Western blot檢測。2結(jié)果2.1雜交瘤細(xì)胞株的建立 HAT選擇培養(yǎng)3日可見融合的細(xì)胞克隆,融合率為93.0% (269/288 ),陽性克隆率為85.0% (246/288 ), 經(jīng)有限稀釋法對陽性克隆進行 23次克隆,共獲得5株能穩(wěn)定分泌 特異性抗人DcR3的mAb雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1A9、1B1、1F5、1G4 及

13、 2H6。2.2腹水mAb的純化腹水經(jīng)proteinA層析柱純化后,進行 SDSjPAGE凝膠電泳掃描,鑒定其純度為95%。相對分子質(zhì)量(Mr) 為146000 (輕鏈為23000,重鏈為50000,圖1)。紫外分光光度法測 定純化蛋白的濃度為15 g/L。圖 1 純化 DcR3 mAb(1B1)的 SDSPAGE 分析(略)Fig 1 SDS PAGE analysis of antibodies after ProteinA affinity chromatograph (1B1)1: Purified mAb; 2: Pre purified mAb.2.3 mAb的特性鑒定mAb效價、

14、亞類、染色體及親和常數(shù) 的鑒定,結(jié)果見表1。表1 mAb效價、亞類、染色體及親和常數(shù)的鑒定(略)Tab 1 Identification of mAb value, isotype, chromosome and affinity con sta nt2.4 Western blot分析5株雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗 DcR3 mAb 均能與轉(zhuǎn)印至PVDF膜上的DcR3融合蛋白在Mr約為33000處形成 單一的陽性染色帶,并且與pET載體蛋白無交叉反應(yīng),其中1B1 mAb可以識別高表達(dá)DcR3的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞成分(圖2)。圖 2 mAb Western blot 分析(略)Fig 2 Wes

15、tern blot an alysis of the 1B1 mAb1: Purified DcR3 protein; 2: Induced pET28a(+) ; 3: SW480 lysate; 4: SW480 culture supernata nt.3討論DcR3 mRNA序列全長1114 bp,含一個開放讀碼框,編 碼300個氨基酸,N末端前29個氨基酸為信號肽序列,蛋白Mr約 35000。DcR3肽鏈含4個串聯(lián)的富集半胱氨酸的重復(fù)序列,此為 TNFR超家族的共同標(biāo)志,但與其他大部分TNFR超家族成員不同的 是DcR3缺乏跨膜結(jié)構(gòu),故屬于分泌性蛋白2。DcR3可競爭性地與 TNF超

16、家族成員FasL、LIGHT、TL1A結(jié)合,抑制配體與死亡受體 的結(jié)合,從而阻斷配體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,有助于腫瘤細(xì)胞、活化的自 身免疫細(xì)胞免受機體免疫系統(tǒng)的清除。 研究表明DcR3在許多惡性腫 瘤組織和細(xì)胞株(如人結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞株)以及自身免疫病的外 周血單個核細(xì)胞(PBMC)過度表達(dá)1,6。另有研究發(fā)現(xiàn),DcR3表 達(dá)水平與腫瘤分化類型和分期密切相關(guān)7, 8,因此,應(yīng)用DcR3抗體 通過免疫組化、ELISA等方法觀察DcR3在病變組織或體液中的表 達(dá)情況對相關(guān)疾病的診斷、 預(yù)后及療效觀察具有重要作用。此外,也 可以利用DcR3 mAb中和DcR3蛋白,解除其對腫瘤的抗凋亡和下調(diào) 宿主免

17、疫功能的作用,達(dá)到輔助治療腫瘤的的目的。我們利用本室自制并已經(jīng)過純化和鑒定的His_DcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,在傳統(tǒng)的淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)基礎(chǔ)上進行了 以下優(yōu)化:(1)改進免疫方案,選擇融合時機,直至小鼠產(chǎn)生百萬以 上高抗體滴度時方進行融合,此時分泌抗體的脾臟B淋巴細(xì)胞多,大 大增加了陽性克隆率;(2)根據(jù)融合后細(xì)胞生長情況適當(dāng)增減 HAT 和HT用量,以免毒性過大細(xì)胞死亡或劑量不足不能起到篩選作用;(3)對雜交瘤進行ELISA雙篩選,去除DcR3融合蛋白中His蛋白 的干擾,相對提高了免疫抗原的特異性,保證所篩選到的雜交瘤細(xì)胞 所分泌的mAb只針對DcR3抗原決定簇而非His決定簇

18、。通過上述 優(yōu)化,獲得了高效價、特異性強的抗人DcR3 mAb,其中1B1雜交瘤細(xì)胞株分泌的mAb可識別高表達(dá)DcR3蛋白的人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株的細(xì)胞裂解懸液和培養(yǎng)上清。所建立的雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)數(shù)次凍 存、復(fù)蘇,體外傳代培養(yǎng)3個月以上仍能穩(wěn)定分泌高效價 mAb???之,抗人DcR3 mAb的成功研制,為研究DcR3蛋白功能、 純化DcR3蛋白、臨床上檢測相關(guān)疾病血清 DcR3含量及在組織細(xì)胞的 表達(dá)分布奠定實驗基礎(chǔ)?!緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Yu KY, Kwon B, Ni J, et al. A newly identified member of tumor necrosis factor r

19、eceptor superfamily (TR6) suppresses LIGHT Jmediated apoptosisJ. J Biol Chem, 1999, 274(20): 13733-13736.2 Migone TS, Zhang J, Luo X, et al. TL1A is a TNF like ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell costimulatorJ. Immu ni ty, 2002, 16(3): 479-492.3 吳春風(fēng),馬忠森,王秀麗,等.人DcR3融合蛋白的表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2007,23( 12): 1160-1162.4 趙永芳.生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用M.北京:科學(xué)出版社,2002: 429-430.5 白慧玲,趙粵萍,劉廣超,等.抗死亡

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