化妝品的微生物學(xué)檢查

1、化妝品的微生物學(xué)檢查主要內(nèi)容 化妝品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 化妝品微生物學(xué)檢查基礎(chǔ)知識 化妝品中微生物總數(shù)檢查 化妝品中控制菌檢查化妝品原料中的微生物 0級 酸、堿、醇等，本身具有殺菌功能，無需檢測 1級 無水脂類、礦物油、凡士林、硬脂酸等，含極少量微生物，本身中等抗菌能力，只需一次檢查； 2級 原料含少量微生物，被水稀釋后能成為微生物營養(yǎng)物，如甘油、山梨醇等，一年檢查一次； 3級 具有微生物污染風(fēng)險。表面活性劑、增泡劑、水解蛋白溶液、蘆薈膠。需防腐體系。每批抽樣檢查 4級 極高微生物污染風(fēng)險，去離子水?；瘖y品微生物污染途徑 一級污染 二級污染防止微生物污染的措施 3個操作因素：消毒、清潔措施、員工培訓(xùn)；

2、 5個工程因素：設(shè)備、廠房、倉庫、水系統(tǒng)和空氣系統(tǒng)的良好的可消毒設(shè)計。 執(zhí)行HACCP，消毒標(biāo)準(zhǔn)的建立贏包括工廠的每一個區(qū)域和相關(guān)的功能設(shè)施?；瘖y品微生物檢驗 原料和產(chǎn)品中的微生物數(shù)量是否達(dá)到執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)； 檢驗用于化妝品和藥品中的防腐劑的防腐效能檢驗方法 APC法：好樣平板計數(shù)法 防腐劑效能實驗檢驗方法可靠性 精確性實驗人員的實驗技能 靈敏性、準(zhǔn)確性試驗方法的合理性目前參照執(zhí)行的方法 USP法（美國藥典） CTFA法（美國化妝品、盥洗用品及香料協(xié)會） ASTM法（美國檢驗方法及材料協(xié)會） 英國藥物學(xué)方法 GB7918.1-87 相同點：測試微生物種類和恢復(fù)系統(tǒng)、測定APC方法相同。 不同點：培養(yǎng)

3、溫度、接種物的制備程序、培養(yǎng)時間一、2007版“化妝品衛(wèi)生規(guī)范”粘膜用、粘膜用、嬰兒及嬰兒及兒童用兒童用化妝品化妝品眼部及口唇等眼部及口唇等細(xì)菌菌落總數(shù)不得大于細(xì)菌菌落總數(shù)不得大于500CFU/mL 或或500CFU/g。其他化其他化妝品妝品細(xì)菌菌落總數(shù)細(xì)菌菌落總數(shù)不得大于不得大于1000CFU/mL 或或1000CFU/g所有化妝品所有化妝品霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌總數(shù)總數(shù)不得大于不得大于100CFU100CFUmL mL 或或100CFU100CFUg g每克或每毫升產(chǎn)每克或每毫升產(chǎn)品中不得檢出品中不得檢出糞糞大腸菌群大腸菌群、銅綠銅綠假單胞菌假單胞菌和和金黃金黃色葡萄球菌色葡萄球菌。二、

4、檢查的必備知識 1.采樣 采樣應(yīng)具有代表性。從兩個包裝單位以上的樣品中共取10g 或10mL作為檢驗量。 樣品應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。 接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。及時檢驗的樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。 若樣品需同時做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗，再將剩余樣品做其它分析。 在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。 如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，

5、自報告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個月。2.供檢樣品（供試品）的制備 水溶性液體樣品樣品樣品10mL10mL90mL90mL生生理鹽水理鹽水1:101:10供試液供試液2.供檢樣品（供試品）的制備 油性液體樣品5mL5mL滅菌液滅菌液體石蠟體石蠟1:101:10供試液供試液10mL10mL滅滅菌吐溫菌吐溫80804044404410mL樣品樣品混勻混勻10min10min75mL 404475mL 4044滅菌生理鹽水滅菌生理鹽水40444044乳化乳化均質(zhì)器均質(zhì)器2.供檢樣品（供試品）的制備 親水性半固體（膏、霜、乳劑）樣品振蕩振蕩90mL90mL生理生理鹽水鹽水10g樣品樣品15mi

6、n15min上清液作為上清液作為1:101:10供試液供試液膏、霜劑若用均膏、霜劑若用均質(zhì)器，混合均質(zhì)質(zhì)器，混合均質(zhì)12min12min即可。即可。2.供檢樣品（供試品）的制備 疏水性半固體樣品5mL5mL滅菌液滅菌液體石蠟體石蠟1:101:10供試液供試液10mL10mL滅滅菌吐溫菌吐溫80804044404410mL樣品樣品混勻混勻10min10min75mL 404475mL 4044滅菌生理鹽水滅菌生理鹽水40444044乳化乳化均質(zhì)器均質(zhì)器膏、霜劑若用均膏、霜劑若用均質(zhì)器，混合均質(zhì)質(zhì)器，混合均質(zhì)35min35min即可。即可。2.供檢樣品（供試品）的制備 固體樣品振蕩振蕩90mL90

7、mL生理生理鹽水鹽水上清液作為上清液作為1:101:10供試液供試液10g樣品樣品15min15min三、細(xì)菌、真菌總數(shù)檢查 1.意義 測定總數(shù)主要是作為判定化妝品被細(xì)菌、霉菌及酵母菌污染程度的標(biāo)記，也可以觀察化妝品中細(xì)菌、霉菌及酵母菌的性質(zhì)和在化妝品中的繁殖動態(tài)，以便對樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供科學(xué)依據(jù)。3.3.平皿法平皿法數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處理處理混合平板混合平板的制備的制備細(xì)菌、真細(xì)菌、真菌的培養(yǎng)菌的培養(yǎng)檢查結(jié)果、檢查結(jié)果、觀察與計數(shù)觀察與計數(shù)供試液供試液的制備的制備書寫檢驗書寫檢驗記錄單記錄單 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的操作過程1010-1-11010-2-21010-2-21010-1-11010

8、-1-11010-2-21010-2-2 1010-1-1對照對照對照對照對照對照對照對照1.0ml1.0ml倒置培養(yǎng)倒置培養(yǎng)48h48h1h1h363611卵磷脂、吐卵磷脂、吐溫溫80-80-營養(yǎng)肉湯瓊營養(yǎng)肉湯瓊脂脂282822虎紅瓊脂虎紅瓊脂倒置培養(yǎng)倒置培養(yǎng)72h72h2h2h9.0ml9.0ml 稀釋液稀釋液10g/10g/mlml供供試品試品 9.0ml9.0ml1010-2-21010-1-11.0ml1.0ml操作注意事項操作注意事項 1.1.盡量使菌細(xì)胞分散開，使每個菌細(xì)胞生成一個菌落，否盡量使菌細(xì)胞分散開，使每個菌細(xì)胞生成一個菌落，否則將會導(dǎo)致重大的技術(shù)誤差。則將會導(dǎo)致重大的技

9、術(shù)誤差。 2.2.為防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生菌苔，制成供試液后，應(yīng)盡快稀為防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生菌苔，制成供試液后，應(yīng)盡快稀釋，注皿。一般稀釋后應(yīng)在釋，注皿。一般稀釋后應(yīng)在1 1小時內(nèi)操作完畢。小時內(nèi)操作完畢。 3.3.使用吸量管時，應(yīng)小心沿管壁加入，不用觸及管內(nèi)溶液使用吸量管時，應(yīng)小心沿管壁加入，不用觸及管內(nèi)溶液，以防吸管尖端外側(cè)黏附的溶液混入其中。，以防吸管尖端外側(cè)黏附的溶液混入其中。 4.4.注意抑菌現(xiàn)象。由于防腐劑未被中和，往往使平板計數(shù)注意抑菌現(xiàn)象。由于防腐劑未被中和，往往使平板計數(shù)結(jié)果受影響，如低稀釋時菌落少。而高釋釋度時菌落數(shù)反結(jié)果受影響，如低稀釋時菌落少。而高釋釋度時菌落數(shù)反而增大。遇此

10、情況應(yīng)重復(fù)檢驗，以確定是防腐劑影響還是而增大。遇此情況應(yīng)重復(fù)檢驗，以確定是防腐劑影響還是操作技術(shù)誤差。操作技術(shù)誤差。 操作注意事項操作注意事項 5.5.為檢查和控制滅菌效果，應(yīng)做空白對照，以檢驗所使用為檢查和控制滅菌效果，應(yīng)做空白對照，以檢驗所使用的物品是否徹底滅菌及檢驗過程是否無菌操作。的物品是否徹底滅菌及檢驗過程是否無菌操作。 6.6.為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL 100mL 卵磷卵磷脂吐溫脂吐溫80 80 營養(yǎng)瓊脂中加入營養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.51mL0.5的的TTC TTC 溶液，如有細(xì)溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化

11、妝品的顆粒顏色無變化菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。菌落計數(shù)及報告方法菌落計數(shù)及報告方法 宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)3030030300之間、霉菌平均之間、霉菌平均菌落數(shù)菌落數(shù)550550之間的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)之間的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。字）的依據(jù)。 （1 1）當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù); ; （2 2）若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30 30 個個300

12、300 個個之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于或等于2 2，應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于，應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于 2 2 則報告其中稀釋度則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)較低的平皿的菌落數(shù)菌落計數(shù)及報告方法菌落計數(shù)及報告方法 （3 3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300 300 個，則應(yīng)按稀個，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之; ; （4 4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30 30 個，則應(yīng)按稀個，則應(yīng)按稀釋度最

13、低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之; ; （5 5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30 30 300 300 個之間個之間，其中一個稀釋度大于，其中一個稀釋度大于300 300 個，而相鄰的另一稀釋度小于個，而相鄰的另一稀釋度小于30 30 個時，則以接近個時，則以接近30 30 或或300 300 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之；告之； （6 6）若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每）若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g g 或每或每mL mL 小于小于10CFU;10CFU;控制菌檢查 （1 1

14、）陰性對照試驗：應(yīng)無菌生長。）陰性對照試驗：應(yīng)無菌生長。 （2 2）陽性對照試驗：供試品）陽性對照試驗：供試品+ +陽性對照菌陽性對照菌，應(yīng)檢出相應(yīng)的陽性對照菌。，應(yīng)檢出相應(yīng)的陽性對照菌。 （3 3）供試品控制菌檢查：依相應(yīng)的檢查方）供試品控制菌檢查：依相應(yīng)的檢查方法進(jìn)行。法進(jìn)行。 供試品供試品增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)純培養(yǎng)純培養(yǎng)染色鏡檢染色鏡檢生化反應(yīng)試驗生化反應(yīng)試驗報告結(jié)果報告結(jié)果1.1.增菌培養(yǎng)目的增菌培養(yǎng)目的 使被檢藥物中的被使被檢藥物中的被檢菌增殖，避免出檢菌增殖，避免出現(xiàn)漏檢?，F(xiàn)漏檢。2.2.分離培養(yǎng)目的分離培養(yǎng)目的 經(jīng)增殖培養(yǎng)后經(jīng)增殖培養(yǎng)后,被檢菌被檢菌大量繁殖，同時其他

15、大量繁殖，同時其他一些雜菌也出現(xiàn)增殖一些雜菌也出現(xiàn)增殖。因此分離培養(yǎng)能使。因此分離培養(yǎng)能使目的菌從混合菌中分目的菌從混合菌中分離出來。離出來。3.3.純培養(yǎng)目的純培養(yǎng)目的 只是大量增殖被檢菌，用于后面的進(jìn)一只是大量增殖被檢菌，用于后面的進(jìn)一步檢驗。步檢驗。4.4.染色鏡檢目的染色鏡檢目的n初步鑒定，觀察細(xì)初步鑒定，觀察細(xì)菌的形態(tài)大小。菌的形態(tài)大小。5.5.生化試驗?zāi)康纳囼災(zāi)康膎最終的鑒定依據(jù)，最終的鑒定依據(jù)，結(jié)合染色鏡檢得出結(jié)合染色鏡檢得出實驗結(jié)果，填寫檢實驗結(jié)果，填寫檢驗報告。驗報告。糞大腸菌群糞大腸菌群 糞大腸菌群系一群需氧及兼性糞大腸菌群系一群需氧及兼性厭氧厭氧革蘭氏陰性革蘭氏陰性無

16、芽胞桿菌，無芽胞桿菌，在在44.544.50.50.5培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h48h 48h 能發(fā)酵乳糖能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。糞大腸菌群主要存在于溫血動糞大腸菌群主要存在于溫血動物糞便中，隨糞便排出體外后物糞便中，隨糞便排出體外后可直接污染化妝品，若產(chǎn)品中可直接污染化妝品，若產(chǎn)品中檢出該菌群，表明該產(chǎn)品受到檢出該菌群，表明該產(chǎn)品受到糞便污染，可能存在腸道致病糞便污染，可能存在腸道致病菌并引起疾病，是評價化妝品菌并引起疾病，是評價化妝品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。產(chǎn)酸：黃色產(chǎn)酸：黃色產(chǎn)氣：氣泡產(chǎn)氣：氣泡雙倍膽鹽乳糖雙倍膽鹽乳糖MMEMBEMB瓊脂瓊脂液面玫瑰紅色液面玫瑰

17、紅色紫黑色紫黑色靛基質(zhì)試驗靛基質(zhì)試驗糞大腸菌群檢查結(jié)果報告糞大腸菌群檢查結(jié)果報告 根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞質(zhì)試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。大腸菌群。銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌屬于假銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為單胞菌屬，為革蘭氏革蘭氏陰性陰性桿菌，桿菌，氧化酶陽氧化酶陽性性，能產(chǎn)生，能產(chǎn)生綠膿菌素綠膿菌素。此外還能。此外還能液化明膠液化明膠，還原硝酸鹽還原硝酸鹽為亞硝為亞硝酸鹽，在酸鹽，在424211條條件下能生長

18、。件下能生長。 銅綠假單胞菌在特殊情況銅綠假單胞菌在特殊情況下可引起皮膚化膿感染、下可引起皮膚化膿感染、泌尿道感染、中耳炎等。泌尿道感染、中耳炎等。外傷及燒傷患者感染后最外傷及燒傷患者感染后最易引起化膿，并引起敗血易引起化膿，并引起敗血癥。為保證消費(fèi)者安全，癥。為保證消費(fèi)者安全，化妝品中不得檢出銅綠假化妝品中不得檢出銅綠假單胞菌。單胞菌。最終結(jié)最終結(jié)果判斷果判斷增增菌菌培培養(yǎng)養(yǎng)供試供試液的液的制備制備書寫檢驗書寫檢驗記錄單記錄單分分離離純純化化無菌落或無特征菌落無菌落或無特征菌落配培配培養(yǎng)基養(yǎng)基和稀和稀釋液釋液革蘭染色、鏡檢革蘭染色、鏡檢 氧化酶試驗氧化酶試驗 綠膿菌素試驗綠膿菌素試驗生化試驗

19、生化試驗 硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗 4242生長試驗生長試驗 明膠液化試驗明膠液化試驗SCDLPSCDLP培養(yǎng)基培養(yǎng)基十六烷三甲基十六烷三甲基溴化銨瓊脂溴化銨瓊脂3636111824h1824h3636111824h1824h特征菌落特征菌落灰白色、扁灰白色、扁平、周圍有平、周圍有水溶性藍(lán)綠水溶性藍(lán)綠色素色素灰白色灰白色濕潤濕潤黃綠色黃綠色菌膜菌膜粉紅粉紅/紫紅色紫紅色十六烷三甲基溴化銨平板十六烷三甲基溴化銨平板SCDLP培養(yǎng)基培養(yǎng)基氧化酶試驗氧化酶試驗綠膿菌素試驗綠膿菌素試驗鹽酸層呈粉紫色氯仿層呈藍(lán)綠色鹽酸層呈粉紫色氯仿層呈藍(lán)綠色硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗明膠液化明膠液化明膠培

20、養(yǎng)基（高層）明膠培養(yǎng)基（高層）明膠液化試驗明膠液化試驗銅綠假單胞菌檢查結(jié)果報告銅綠假單胞菌檢查結(jié)果報告 被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實為革蘭氏陰被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和4242生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。檢出銅綠假單胞菌。金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄

21、球菌為金黃色葡萄球菌為革革蘭氏陽性球菌蘭氏陽性球菌，呈葡，呈葡萄狀排列，無芽胞，萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能無莢膜，能分解甘露分解甘露醇醇，血漿凝固酶陽性血漿凝固酶陽性。 金黃色葡萄球菌在外金黃色葡萄球菌在外界分布較廣，抵抗力界分布較廣，抵抗力也較強(qiáng)，能引起人體也較強(qiáng)，能引起人體局部化臟性病灶，嚴(yán)局部化臟性病灶，嚴(yán)重時可導(dǎo)致敗血癥，重時可導(dǎo)致敗血癥，因此化妝品中檢驗金因此化妝品中檢驗金黃色葡萄球菌有重要黃色葡萄球菌有重要意義。意義。革蘭染色、鏡檢革蘭染色、鏡檢 生化試驗生化試驗: :血漿凝固酶試驗血漿凝固酶試驗 甘露醇發(fā)酵試驗甘露醇發(fā)酵試驗最終結(jié)最終結(jié)果判斷果判斷增增菌菌培培養(yǎng)養(yǎng)供試供試品的品的處理處理書寫檢驗書寫檢驗記錄單記錄單分分離離純純化化無菌落或無特征菌落無菌落或無特征菌落配培配培養(yǎng)基養(yǎng)基和稀和稀釋液釋液363611363611SCDLPSCDLP培養(yǎng)基或培養(yǎng)基或7.5%NaCl7.5%NaCl肉湯肉湯24242h hBaird ParkersBaird Parkers或血瓊脂或血瓊脂2448h2448h特征菌落特征菌落灰黑色、邊緣灰黑色、邊緣有渾濁帶、周有渾濁帶、周圍有透明帶圍有透明帶金黃色葡萄球菌檢查流程圖金黃色葡萄球菌檢查流程圖灰灰/黑色黑色Baird Parkers平板平板甘露醇發(fā)酵試驗甘露