菌種的復(fù)蘇傳代及保存標(biāo)準(zhǔn)程序資料

1、菌種的復(fù)蘇傳代及保存標(biāo)準(zhǔn)程序目的：建立菌種的復(fù)蘇、傳代及保存標(biāo)準(zhǔn)程序。 范圍：適用于檢定用菌種的復(fù)蘇、傳代及保存的操作。 職責(zé)：質(zhì)管部生物測定人員對本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。內(nèi)容： 菌種的復(fù)蘇與傳代操作均應(yīng)在生物檢定室陽性對照間或?qū)Ｓ贸瑑艄ぷ髋_內(nèi) 進(jìn)行。操作中使用過的滴管、 吸管及菌種管等均需放入消毒液中浸泡， 試驗(yàn)結(jié)束 后經(jīng)121C 30分鐘高溫滅菌處理。1. 菌種的復(fù)蘇1.1 凍干菌種的復(fù)蘇檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國藥品生物制品檢定所提供， 為冷凍干燥菌種 （0代）。使用前需將其復(fù)蘇。1.1.1 準(zhǔn)備： 用具：滅菌1ml滴管、滅菌雙碟、滅菌鑷子、砂輪、酒精燈、接種環(huán)。 培養(yǎng)基： 根據(jù)菌種的性質(zhì)選擇合適

2、的液體培養(yǎng)基 （營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或改良馬丁 培養(yǎng)基）、營養(yǎng)瓊脂（或改良馬丁瓊脂）斜面數(shù)支。 消毒液： 75%酒精、碘酒、 0.1%新潔爾滅或 84 消毒液等。1.1.2 操作：1.1.2.1 將準(zhǔn)備妥的冷凍菌種管、 滅菌滴管、滅菌雙碟及鑷子、 培養(yǎng)基移入工作臺。1.1.2.2用砂輪將凍干菌種管頸部挫出刻痕， 再 75%酒精棉擦凈菌種管外壁， 放在 滅菌雙碟內(nèi)待干。1.1.2.3點(diǎn)燃酒精燈，將菌種安瓿的封口一端在火焰上灼燒紅熱， 用滅菌滴管吸取 液體培養(yǎng)基少許，滴在灼熱的菌種安瓿封口一端，使其驟冷而炸裂。1.1.2.4取滅菌鑷子， 在火焰旁，將炸裂的管口打開后， 把菌種安瓿放入滅菌雙碟 內(nèi)。1.1

3、.2.5 另取一支滅菌滴管，在火焰旁吸取適用液體培養(yǎng)基少許， 加至菌種管底部， 將凍干菌攪動促使溶解， 隨即吸出管內(nèi)菌液， 接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)。 用接種環(huán)取菌 液劃線接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基上。1.1.2.6 將已接種的液體培養(yǎng)基及瓊脂斜面培養(yǎng)基置規(guī)定溫度下（一般細(xì)菌在 3035C，真菌在 2328C）培養(yǎng) 24h。1.1.2.7 取出培養(yǎng)物（第 1代） ，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌，必要時(shí)涂片、 革蘭氏染色鏡檢， 若呈典型菌落即可應(yīng)用。 如發(fā)現(xiàn)菌型不典型， 可進(jìn)行平板分離 單菌落。1.2 為保證工作用菌株的傳代次數(shù)不超過 5 代，并減少購買凍干菌種的次數(shù)， 可 在對凍干菌種復(fù)蘇的同時(shí)制備部分菌懸

4、液 （第 1 代）冷凍保存， 并將此凍存菌液 復(fù)蘇后的第 2 代培養(yǎng)物凍存保藏。1.2.1準(zhǔn)備：凍存保護(hù)液（40%無菌甘油）及滅菌凍存管。 細(xì)菌凍存液： 由液體培養(yǎng)基與凍存保護(hù)液按 1： 1 比例混勻制成。1.2.2按 1.1.2.11.1.2.4操作，將凍干菌復(fù)溶后， 吸取菌懸液加入到細(xì)菌凍存液中， 混勻。1.2.3按1ml/管的量分裝至滅菌凍存管中，密閉。標(biāo)明菌名、編號及凍存日期等。置-20C或-80 C條件下冷凍保存。1.2.4制備第 2 代凍存菌懸液時(shí)，可用接種環(huán)直接刮取第 1 代凍存菌懸液復(fù)蘇后 轉(zhuǎn)種至瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基上生長的純菌落， 再接種至細(xì)菌凍存液中， 混勻后 按 1.2.

5、3凍存。1.3 凍存菌懸液的復(fù)蘇：1.3.1 準(zhǔn)備： 用具：滅菌1ml滴管、酒精燈、接種環(huán)。 培養(yǎng)基：根據(jù)菌種的特性選擇適宜的液體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10ml、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 12ml 或改良馬丁培養(yǎng)基 10ml 等）、瓊脂斜面或平板培養(yǎng) 基。 消毒液： 75%酒精、 0.1%新潔爾滅或 84消毒液等。1.3.2操作：1.3.2.1 從低溫冰柜中取出菌種凍存管，室溫下放置使其自然解凍1.3.2.2將解凍后菌種管及滅菌滴管、液體培養(yǎng)基等移入工作臺。1.3.2.3用 75%酒精棉球擦拭菌種凍存管外壁，稍干。1.3.2.4點(diǎn)燃酒精燈， 在火焰旁打開菌種凍存管蓋， 用一支滅菌滴管吸取解凍的菌

6、 懸液，接種至 10ml 液體培養(yǎng)基中（生孢梭菌需接種至 12ml 硫乙醇酸鹽流體培 養(yǎng)基中）。或用接種環(huán)取菌懸液劃線接種于瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基上。1.3.2.5將用過的滴管和菌種管投入消毒液內(nèi)浸泡，接種環(huán)在火焰上灼燒。132.6將上述接種后的培養(yǎng)基在規(guī)定溫度下培養(yǎng)（細(xì)菌在3035C恒溫培養(yǎng)18-24 小時(shí)，真菌在2328C恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)，黑曲霉*培養(yǎng)57天）。1.3.2.7仔細(xì)觀察培養(yǎng)物： 如呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種， 注明菌 名、編號、代次和接種日期后，置 28C冰箱內(nèi)保存；如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型， 可進(jìn)行平板分離單菌落。1.3.2.8注意：已解凍的凍存管不可再凍存。2

7、. 菌種的接種、傳代2.1.準(zhǔn)備 用具：接種環(huán)、酒精燈。 培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂或改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基或適宜的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已干縮，無冷凝水，則不宜再使用。 消毒液： 75%酒精、 0.1%新潔爾滅或 84消毒液。 菌種：根據(jù)2010年版中國藥典的要求，傳代次數(shù)（n）應(yīng)不超過4代。2.2將冰箱中取出的菌種斜面， 在室溫放置 30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室 內(nèi)或超凈工作臺。2.3點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管與接種管持在左手拇指、食指與中指之間，試管口斜 向上，兩試管口平齊靠近火焰旁。2.4用右手在火焰旁轉(zhuǎn)動兩管的棉塞，以便接種時(shí)易拔取，再以右手持接種環(huán)在 火焰上燒紅 30 秒鐘，隨

8、后將全部鉑金絲及金屬棒部分在火焰上灼燒，往返通過3 次。2.5右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手 再輕輕拔出棉塞，夾在無名指、小指及掌部，并勿使其與任何物品接觸。2.6 將灼燒過的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷后， 從斜面上挑取菌苔少許， 取出時(shí)， 接種環(huán)不能通過火焰， 應(yīng)在火焰旁迅速插入至 接種管內(nèi)液體培養(yǎng)基中， 或在瓊脂斜面的底部， 由底向上， 將接種環(huán)輕貼斜面的 表面曲折移動，使細(xì)菌劃在斜面的表面上，注意只劃動一次，勿重復(fù)移動，且勿 使菌苔沾在管壁口。2.7 取出接種環(huán)，立即將管口通過火焰滅菌，右手到火焰旁將試管棉塞塞上，然 后將接種

9、過細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌。2.8已接種畢的各管貼好標(biāo)簽，注明菌名、編號、代次（n+1）和接種日期，細(xì)菌 管置3035C培養(yǎng)1824小時(shí)；真菌管一般置2328C培養(yǎng)2448小時(shí)（黑曲霉 需培養(yǎng) 57天）。2.9 培養(yǎng)到期后取出培養(yǎng)物， 仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)， 是否正常， 并與上代菌種比較， 有無雜菌。必要時(shí)涂片， 革蘭氏染色鏡檢， 呈典型菌落即可作為日常工作中使用 的菌種。如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可繼續(xù)進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，分離單菌落，挑選 典型菌苔接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，代替原有的工作用菌種。2.10檢查合格的工作用菌種，放入冰箱內(nèi) 28C保存，一般1個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。 2.11菌種（第 n 代）接種至

10、適宜培養(yǎng)基中， 在規(guī)定的溫度條件下的培養(yǎng)物， 即為 第 n+1 代。注意：黑曲霉 *致病性很強(qiáng)，操作時(shí)應(yīng)特別注意： 黑曲霉抱子相當(dāng)穩(wěn)定，其在0.9%氯化鈉溶液中，4 C左右的條件下可以保存較 長的時(shí)間， 故可將此孢子懸液作為儲備液在 12月內(nèi)使用， 以減少反復(fù)操作的風(fēng) 險(xiǎn)性。 為防止黑曲霉抱子的傳播，接種傳代時(shí)應(yīng)關(guān)閉風(fēng)機(jī)，近酒精燈操作。 若傳代的母代菌種為菌懸液，則 用無菌吸管吹吸管內(nèi)液體，取12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面，用吸管涂布均勻，置 2328E培養(yǎng)57日。 接種傳代時(shí)，改良馬丁斜面必須是干燥的，否則影響其抱子的形成。 接種傳代后，使用過的器具均需在 121C, 30分鐘高壓滅菌后再作處理

11、。3. 菌種的保存：3.1 菌懸液凍存法：凍干菌種（0代）復(fù)蘇后，可按上述方法制備第1代菌懸液、第2代菌懸液進(jìn)行 凍存。3.2瓊脂斜面低溫保存法：日常使用的工作用菌種可用此法在短期內(nèi)保存。321將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基） 上,按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙包 好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡 膠塞。放在4C左右的冰箱中保藏。每隔1個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。3.2.2適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、真菌保藏。3.2.3各類菌種保藏條件及時(shí)間：菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時(shí)間細(xì)菌般多用呂養(yǎng)瓊脂或根據(jù)

12、菌種規(guī)疋選用培養(yǎng)基46C芽抱桿菌36個(gè)月其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂46C一般46個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等。46C每4個(gè)月移植一次（每2個(gè)月移植一次）3.2.4注意事項(xiàng): 保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。 保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生抱梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉， 如有異常應(yīng)及時(shí)處理。 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤 后再繼續(xù)保藏。 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，應(yīng)在室溫下保存。3.

13、3液體石蠟保存法：利用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水 平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期。3.3.1方法：3.3.1.1將菌種接種于斜面或穿刺于 0.3 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 好備用。331.2取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管 1015ml，加棉塞，瓶口包上紙，121T高壓滅菌30min,取出置37C溫箱或110170C烤箱中1 2 h或干燥器 內(nèi)除去液體石蠟中的水分。3.3.1.3將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)， 液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最 上端1 cm為宜，將試管直立，放入4 C冰箱中保藏。3.3.2適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放

14、線菌，對細(xì)菌保藏效果較差。 3.3.3注意事項(xiàng)： 保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏。 保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥，需重新移種。 使用菌種時(shí)， 先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊， 再用接種針挑取培養(yǎng)物接 種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。 將沾有少量液體石蠟的接種針浸于 95%酒精中片刻， 再燒灼滅菌， 以免直接在 酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1 cm為宜。制備無菌液體

15、石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培 養(yǎng)基中易造成污染。4. 菌種在傳代、保存或使用過程中發(fā)現(xiàn)污染、變異，應(yīng)及時(shí)銷毀，不得用于常規(guī) 檢驗(yàn)。5. 菌種傳代、保存及使用、銷毀均應(yīng)填寫相應(yīng)記錄： 0 代菌種保管使用記錄 、 凍存菌種保管使用記錄 、菌種傳代記錄、菌種使用記錄及菌種銷毀記 錄。6. 菌種按“檢定菌管理制度”管理。7. 附錄：7.1菌種編號：傳代復(fù)蘇的菌種應(yīng)有統(tǒng)一編號，編號方法為：菌種代號-G或W-代次 -管號。G 表示用于凍存的菌種， W 表示工作用菌種 - 注：菌種代號：常用菌種的代號見下表:菌種名稱代號菌種名稱代號菌種名稱代號金黃色葡萄球菌JP生孢梭菌SB大腸埃希菌DC銅綠假

16、單孢桿菌TL白色念珠菌BN短小芽孢桿菌DX枯草芽孢桿菌KC黑曲霉HQ藤黃微球菌TH 菌種購進(jìn)的年、月：如0608表示2006年8月購進(jìn) 菌種代次，用1、2、3、4、5表示。 母代凍存菌種的編號，用I、U、川表示。 菌種的序號，用1、2、3表示。7.2常用工作用菌種的生物學(xué)特征 金黃色葡萄球菌形態(tài)與染色：圓球形排列成典型的葡萄狀，菌落直徑為0.81.5mm,革蘭氏染色陽性。培養(yǎng)特性：在肉湯瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯中，生長良好。在2838C生長較好，pH為4.59.8，以pH7.4左右最好。營養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng) 2448小時(shí)，形成圓形凸出、邊緣整齊、表面光澤且金黃色的菌落，直徑12mm（應(yīng)挑選光滑型菌落

17、）。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，生長迅速，經(jīng)37C24小時(shí)培養(yǎng)呈均勻混濁，管底稍有沉淀，微微振搖即可上升，消散均勻。但培養(yǎng)基含有可發(fā)酵糖類或菌型變?yōu)榇植谛驼?，可出現(xiàn)自然凝集現(xiàn)象，抵抗力：在干燥情況下，可生存數(shù)月，在無糖培養(yǎng)基內(nèi)生存數(shù)年。對熱80C 30分鐘才被殺死。在1購炭酸液中15分鐘被殺死，碘酒中須 1分鐘，75%酒精中須數(shù)十分鐘才被殺死。 藤黃微球菌形態(tài)與染色：個(gè)體略大于葡萄球菌，直徑0.53.5um，單個(gè)成雙或四聯(lián)狀排列，或呈不規(guī)則的團(tuán)塊。革蘭氏染色呈陽性。培養(yǎng)特性：專性需氧菌，營養(yǎng)要求不高，最適溫度為2530 C。在瓊脂平板上培養(yǎng)可形成 圓形凸起，光滑、不透明黃色菌落。在液體培養(yǎng)基中均為混濁生長

18、。 枯草桿菌形態(tài)與染色：菌體細(xì)短棒狀，0.70.8um寬，2.03.0um長，單個(gè)或呈鏈狀，兩端半圓形，染色均勻。芽孢0.60.9um寬，1.01.5um長，橢圓形或圓柱形，常產(chǎn)生于菌體中央或接 近中央。革蘭氏染色呈陽性，能運(yùn)動。培養(yǎng)特性：營養(yǎng)瓊脂平板：菌落表面粗糙，圓形，凹凸不平，邊緣鋸齒狀，稍有蔓延，呈白色或微黃 色，應(yīng)挑選粗糙形菌落） ，本菌變異時(shí)可出現(xiàn)光滑型菌落。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中呈少量混濁并生沉淀，在液體表面形成皺狀厚膜，粘附于試管壁上。培養(yǎng)最適溫度 3037C,生長范圍1555C,兼性厭氧或需氧。抵抗力：菌體濕熱55C, 1小時(shí)即被殺死，芽孢能耐高溫，100C3小時(shí)才被殺死，120C40 分鐘才被殺死。 短小芽孢桿菌 形態(tài)與染色：本菌為桿狀，革蘭氏染色陽性，無莢膜，芽孢偏生，橢圓形，有動力。培養(yǎng)特性：本菌與枯草桿菌相似，培養(yǎng)最適溫度3037C，生長范圍1550C，兼性厭氧或需氧。此外， 短小芽孢桿菌有兩點(diǎn)不同于枯草桿菌：在瓊脂培養(yǎng)基上，大多數(shù)菌株的菌落 為光滑型并變?yōu)槲ⅫS色， 用于檢定的菌種，應(yīng)挑光滑型菌落； 有些菌株?duì)I養(yǎng)需要生物素 （維 生素H）及氨基酸。 大腸埃希菌形態(tài)與染色：短桿菌 0.40.7um寬，24um長，兩端鈍圓，大多數(shù)有 58根鞭毛，