DNA重組的載體藍(lán)背景PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1DNA重組的載體藍(lán)背景重組的載體藍(lán)背景載體的功能及特征載體的功能（P12）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因提供在受體細(xì)胞中 擴(kuò)增和表達(dá)能力注意：上述三大功能并非所有的載體分子都必須具備第1頁/共43頁載體的功能及特征載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標(biāo)記 具有較高的外源DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 第2頁/共43頁2.1.1質(zhì)粒載體2.1.1.1質(zhì)粒的基本特征 定義：質(zhì)粒是一類存在于原核細(xì)菌和真菌細(xì)胞中，能獨(dú)立于寄主染色體而自主

2、復(fù)制的共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。是處于生命與非生命的分界線上。（1）質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中；（2）絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA；（3）質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 100 kb第3頁/共43頁質(zhì)粒的基本特征1.質(zhì)粒的自主復(fù)制性：質(zhì)粒能擺脫寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)的束縛進(jìn)行自主復(fù)制；質(zhì)粒DNA上含有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori），形成獨(dú)立的復(fù)制子結(jié)構(gòu)根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 - 5拷貝 stringent plasmid松弛型復(fù)制控制的

3、質(zhì)粒 30 - 50 拷貝 relaxed plasmid第4頁/共43頁質(zhì)粒的基本特征2.質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性：革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等；非接合型質(zhì)粒：不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用。值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由bom和mob基因決定。第5頁/共43頁質(zhì)粒的基本特征3.質(zhì)粒的不相容性：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不ColE1、pMB1 擁有

4、相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容相容性群。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：第6頁/共43頁質(zhì)粒的基本特征4.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義。第7頁/共43頁2.1.1.2質(zhì)粒的構(gòu)建原因：天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的

5、要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建而成的：pSC1018.8 kb，拷貝數(shù) 5，四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 TcrColE16.5 kb，拷貝數(shù) 20 - 30，大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr第8頁/共43頁構(gòu)建過程（P14）第9頁/共43頁2.1.1.3質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因，拷貝數(shù)1000-3000，擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101，拷貝數(shù)小于10，表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)

6、出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭（polylinker）整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)，便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子，便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因，便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選第10頁/共43頁重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù) 50

7、- 100 / cell用于基因克隆 第11頁/共43頁pUC18 / 19： 拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測序 裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII第12頁/共43頁重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的

8、a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBr5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galClBrClBrONNO第13頁/共43頁重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ用于外源基因的高效表達(dá) 注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等第14頁/共43頁2.1.1.4質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒D

9、NA： 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法 質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法 質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間第15頁/共43頁氯化銫密度梯度離心法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體； 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁； 加CsCl和溴乙錠；超速離心過夜；在紫外燈下吸取cccDNA；稀釋沉淀cccDNA。proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第16頁/共43頁堿溶法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體； 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁； 加NaOH和SDS的混合溶液，破膜釋放內(nèi)含物； 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體D

10、NA及大部分蛋白質(zhì)； 離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)；乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA；用無DNase的RNase去除殘余的RNA。 cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第17頁/共43頁沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁； 沸水浴40秒鐘；離心，用無菌牙簽挑去沉淀物； 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA。緩沖液懸浮菌體； 第18頁/共43頁另一類載體 噬菌體或病毒DNA 噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。

11、 噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋?高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞； 自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。第19頁/共43頁2.1.3.1l 噬菌體的生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)l 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成 l-DNA全長48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61？個(gè)基因2.1.2l雙鏈?zhǔn)删wDNA載體第20頁/共43頁l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控

12、制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l - DNA第21頁/共43頁l 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解第22頁/共43頁l 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA第23頁/共43頁l 噬菌體生物學(xué)特性： 溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)

13、。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)。 DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)第24頁/共43頁l-DNA重組分子的體外包裝： l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。

14、第25頁/共43頁2.1.2.2l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度 野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體： 插入型載體取代型載體第26頁/共43頁取代型 （Replacement vectors）這種載體具有兩個(gè)對(duì)應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段是噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 載體：克隆

15、能力大，2025kb插入型 （Insertion vectors ）這種載體僅僅有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，一般不到10kb2.1.2.3 l-DNA載體的主要類型：第27頁/共43頁2.1.2.4 l-DNA及其重組分子的分離純化：P22將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒 密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀l-DNA 第28頁/共4

16、3頁l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 重組l-DNA分子的篩選較為方便 重組l-DNA分子的提取較為簡便 l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá) 外源基因第29頁/共43頁2.1.3 M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體2.1.3.1M13噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 M13 DNA全長6407個(gè)核苷酸M13 DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)VIIIM13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長 IIIVIVII

17、XI第30頁/共43頁宿主細(xì)胞不被溶菌。M13噬菌體的生物學(xué)特性： 感染周期第31頁/共43頁2.1.3.2M13 DNA載體的構(gòu)建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體lacZpolylinker第32頁/共43頁M13 DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大 但M13-DNA載體的最大缺陷

18、是裝載量小，只有1.5 kb第33頁/共43頁 與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病 毒基因組DNA。 動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類： 單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒 RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。插曲插曲第34頁/共43頁2.1.4質(zhì)粒與噬菌體雜合載體 l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25 kb和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提

19、高噬菌體DNA的裝載量。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第35頁/共43頁2.1.4.1考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建： 考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalI有l(wèi)-DNA cos 序列

20、和質(zhì)粒復(fù)制子的殊類型的載體，1978年由Collins由含cos序列的1.8kb的l片段和 考斯質(zhì)粒的裝載范圍為31-45kb。和Hohn發(fā)明構(gòu)建。例如，pHC79質(zhì)粒pBR322片段組合而成。第36頁/共43頁考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第37頁/共43頁2.1.4.2 噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)： 噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA概念：25頁第38頁/共43頁重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118：pUC18 + M13間隔區(qū) IGpUC1