單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)(3)3+6h

1、 v單細(xì)胞藻類(Unicelluler algae)，簡(jiǎn)稱 單胞藻。因藻體微小，又稱微藻 （Microalgae）。 v單胞藻具有利用太陽(yáng)光能效率高、營(yíng) 養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)繁殖迅速、對(duì)環(huán)境的適 應(yīng)性強(qiáng)和容易培養(yǎng)等重要特性，因而 受到重視。 v通過(guò)研究人們發(fā)現(xiàn)單胞藻在下列6個(gè)方面，可 以開(kāi)發(fā)利用： 1、作為植物生理研究的試驗(yàn)材料。 2、單胞藻的營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸 的種類組成及配比合理。脂肪含量高，富含動(dòng) 物需要的不飽和脂肪酸。還含有各種維生素和 藥用成分?？衫脼槿祟惖臓I(yíng)養(yǎng)食品和健康食 品。 3、可作為水產(chǎn)動(dòng)物的餌料和禽、畜飼料添加劑。 4、可利用單胞藻提取色素、藥物及甘油等 化學(xué)產(chǎn)品。

2、5、叢粒藻（Botryococcus braunii Kutzing） 含油量一般為干藻重的30%-50%，最高可 達(dá)80%，是作為能源開(kāi)發(fā)的對(duì)象。 6、可利用單胞藻光合作用放出的大量氧氣 和吸收水中的富營(yíng)養(yǎng)化成分來(lái)凈化污水和 保持良好的水環(huán)境條件。 目前，有關(guān)海水藻類的培養(yǎng)較多，我國(guó)在 海水養(yǎng)殖方面，已大規(guī)模展開(kāi)了某些浮游植物 的培養(yǎng)，如扁藻（Platymonas spp）、中肋骨 條藻（Skeletonema costatum）、三角褐指藻 （Phaeodactylum tricornutum）、鹽藻（ Dunaliella spp.）、新月菱形藻（Nitzschia clostertum

3、）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）及球等鞭金藻（Isochrysis galbana ）等，已解決貝類人工養(yǎng)殖的早期幼體餌料問(wèn) 題。在淡水養(yǎng)殖方面，我國(guó)只進(jìn)行了螺旋藻、 魚(yú)腥藻、小球藻、柵列藻等的培養(yǎng)。 今后，隨著養(yǎng)殖事業(yè)的發(fā)展， 對(duì)一些新品種的養(yǎng)殖以及解決某 些品種幼魚(yú)的餌料，必然涉及到 藻類的培養(yǎng)。因此，有必要了解 藻類培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)。先僅就藻 類、主要是單細(xì)胞藻類的一般培 養(yǎng)方法及有關(guān)理論加以簡(jiǎn)述。 v單細(xì)胞藻類在 培養(yǎng)過(guò)程中， 生長(zhǎng)繁殖的速 度，出現(xiàn)一定 的起伏，這種 生長(zhǎng)模式可劃 分為五個(gè)時(shí)期 （延緩期、指 數(shù)生長(zhǎng)期、相 對(duì)生長(zhǎng)下降期、 靜止期、死亡 期） 單

4、胞藻的培養(yǎng)方式，以藻 類培養(yǎng)的目的要求而各種各樣。 但可分為密閉式培養(yǎng)和開(kāi)放式 培養(yǎng)兩大類。 密閉式培養(yǎng)的目的是不使外界雜藻、 菌類及其他有機(jī)體混入培養(yǎng)物中。將培養(yǎng) 液密封在與外界完全隔離的透明容器中， 由此通氣、攪拌、輸送培養(yǎng)液及調(diào)節(jié)水溫 和取樣等設(shè)備，也都要與外界隔離。培養(yǎng) 容器多為管狀、也有池狀，用有機(jī)玻璃或 透明的聚乙烯塑料做成水平管道，直立或 斜立在地上，暴露陽(yáng)光或人工光照下。這 種培養(yǎng)方式，成本高，好控制，產(chǎn)量亦穩(wěn) 定。 將藻類培養(yǎng)于敞開(kāi)的容器 （如水泥池、管道、木盆等）中。 方法設(shè)備較簡(jiǎn)便，可進(jìn)行小量或 大面積的培養(yǎng)。該法培養(yǎng)物中易 發(fā)生敵害生物污染，但成本低， 使用較普遍，也是

5、今后藻類培養(yǎng) 所應(yīng)采取的方式。 v開(kāi)放式培養(yǎng)可分如下幾種類型： 開(kāi)放循環(huán)培養(yǎng)：其特點(diǎn)是培養(yǎng)液借助循環(huán)水泵 而不斷循環(huán)流動(dòng)。培養(yǎng)物能循環(huán)，就可省卻攪拌 工作。 開(kāi)放非循環(huán)培養(yǎng)：其特點(diǎn)是培養(yǎng)液不循環(huán)流動(dòng)， 而定時(shí)由小管通入CO2和空氣到培養(yǎng)液中；同時(shí) 也起攪拌作用。此法在大面積培養(yǎng)中使用較普遍。 優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，無(wú)需動(dòng)力，水泵及大量的CO2 及通氣設(shè)備。 半開(kāi)放循環(huán)培養(yǎng)：半開(kāi)放培養(yǎng)是指培養(yǎng)容器或 池、槽等場(chǎng)所雖仍敞開(kāi)，但有些部分密閉，或用 塑料布覆蓋。這種培養(yǎng)方式，利用管道，依靠動(dòng) 力，使培養(yǎng)液流動(dòng)和通入含二氧化碳的空氣。該 方式設(shè)備復(fù)雜，但效果較好。 在實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)單胞藻有多 種培養(yǎng)基配方。這

6、些配方大多數(shù) 是早先發(fā)表過(guò)的配方的修改方， 有些則從分析天然生境的水而得 到，有些是從生態(tài)角度考慮的。 v發(fā)展藻類培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)配方時(shí)主要 考慮的問(wèn)題是： a、鹽的總濃度：大多是取決于有 機(jī)體的生態(tài)來(lái)源。 b、主要離子組分的組成及濃度： 他們是鉀、鎂、鈉、鈣、硫酸鹽 和磷酸鹽。 c、氮源：硝酸鹽、氨和尿素常用作 配方中的氮源，根據(jù)藻中的性能 和pH的最適點(diǎn)而定。藻類的生長(zhǎng) 主要依賴氮的可利用性。大多數(shù) 單胞藻干物中含有79的氮。 因此在1L培養(yǎng)液中生產(chǎn)10g細(xì)胞就 至少需要500600mg/L KNO3。 d、碳源：無(wú)機(jī)碳通常是用含15 CO2的空氣來(lái)供應(yīng)的，碳的另一種供 應(yīng)辦法是用碳酸氫鹽。選用

7、何種辦法 主要是根據(jù)藻類生長(zhǎng)的pH最適點(diǎn)而定。 e、pH：通常用偏酸的pH值來(lái)避免鈣 鎂和其它微量元素發(fā)生沉淀。 f、微量元素：培養(yǎng)基中的微量元素通 常是用早已證明有效濃度的混合溶液 來(lái)提供的（濃度在ug/L級(jí)范圍）。然 而，這些微量元素的組分對(duì)藻類生長(zhǎng) 是否必須卻不能總能顯示。為增加微 量元素的穩(wěn)定性，常用檸檬酸鹽和 EDTA作為螯合劑。 維生素：許多藻類要求有硫胺素 和維生素B12的供應(yīng)。 1、單細(xì)胞綠藻（柵列藻）培養(yǎng)液、單細(xì)胞綠藻（柵列藻）培養(yǎng)液 v水生4號(hào) （NH4）2SO4 0.200g Ca(H2PO4)2H2O+2（CaSO4H2O） 0.030g MgSO47H2O 0.080

8、g NaHCO3 0.100g KCl 0.025g FeCl3（1） 0.150mL 土壤浸出液 0.500mL 水 1000mL v水生6號(hào) NH2CONH2 0.133g H2PO4 0.033mL MgSO47H2O 0.100g NaHCO3 0.100g KCl 0.033g FeSO4（1水溶液） 0.200mL CaCl2 0.050mL 土壤浸出液 0.500mL 水 1000mL v水生四號(hào)培養(yǎng)液中，藻類呈深綠色，生長(zhǎng) 繁殖速率較低。水生6號(hào)培養(yǎng)液中，藻類呈 草綠色，色素不夠正常，但生長(zhǎng)繁殖迅速。 v土壤浸出液是用田園土壤按水與土2:1的比 例，攪勻浸泡后的上層清液，用前煮

9、一小 時(shí)后鏡檢，發(fā)現(xiàn)污染生物，應(yīng)再加溫消毒 后使用。 2浮游硅藻培養(yǎng)液浮游硅藻培養(yǎng)液 v水生硅水生硅1（mg/） 硝酸氨 120 硫酸鎂 70 磷酸氫二鉀 40 磷酸二氫鉀 80 氯化鈣 20 氯化鈉 10 硅酸鈉 100 檸檬酸鐵 5 土壤浸出液 20 硫酸錳 2 水 1000mL pH 7.0 v水生硅水生硅2（mg/） 尿素 150 氯化鉀 30 過(guò)磷酸鈣 50 硅酸鈣 100 硫酸鎂 50 碳酸氫鈉 3 硫酸錳 3 土壤浸出液 4mL EDTA鐵 1mL 水 1000mL v水生硅2號(hào)是用化肥尿素過(guò)磷酸鈣為 氮磷來(lái)源，適于大量培養(yǎng)硅藻時(shí)選用， 生長(zhǎng)適溫為2030；光強(qiáng)為 2,0005,

10、000米燭光。 3朱氏朱氏10號(hào)培養(yǎng)液：適用于培養(yǎng)硅藻、藍(lán)號(hào)培養(yǎng)液：適用于培養(yǎng)硅藻、藍(lán) 綠藻等。綠藻等。 H2O 1000mL Ca(NO3)2 0.04 g K2HPO4 0.01 g MgSO47H2O 0.025 g Na2CO3 0.02 g Na2SiO3 0.025 g FeCl3 0.008 g 使用時(shí)按1/2、1/4、1/10稀釋使用。 4f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)液 硝酸鈉（NaNO3） 75 mg 磷酸二氫鈉（NaH2PO4） 4.4 mg f/2微量元素溶液 1mL f/2維生素溶液 1mL 海水 1000mL 本配方適應(yīng)與目前生產(chǎn)上使用的各種 微藻的培養(yǎng)，但用于硅藻培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)再加

11、 50mgNa2SiO3。 附附I：f/2微量元素溶液配方：微量元素溶液配方： 硫酸鋅（ZnSO44H2O） 23mg 硫酸銅（CuSO45H2O） 10mg 氯化錳（MnCl24H2O） 178mg 檸檬酸鐵（FeC6H5O75H2O） 3.9g 鉬酸鈉（NaMoO45H2O） 7.3mg 乙二銨四乙酸鈉（Na2EDTA） 4.35g 六水氯化鈷（CoCl26H2O） 12mg 純水 1000mL 附附II：f/2維生素溶液配方：維生素溶液配方： 維生素B12 0.5mg 維生素H（生物素） 0.5mg 維生素B1 100mg 純水 1000mL 為了要進(jìn)行某種藻類的科學(xué)研究和大 量培養(yǎng)，有

12、必要把某種藻類與其他生物分 離。分離培養(yǎng)藻種，可分為兩大類: 1、單種培養(yǎng)，即藻類雖只有一種，但還混 雜細(xì)菌。 2、純培養(yǎng)，即不僅藻類只有一種，亦無(wú)其 它任何生物。 純培養(yǎng)比較困難，一般的分離培養(yǎng)往 往只能做到單種培養(yǎng)。 決定培養(yǎng)哪一種藻類，主要根據(jù)培養(yǎng)的目的 要求，及某一種類的生物學(xué)特征。藻類的分離主 要有以下幾種常用方法。 1、離心法、離心法：將混合液用離心機(jī)離心，水中不同 藻體及細(xì)菌就以不同的速度下沉，因此得以分開(kāi)。 這樣將不同時(shí)間下從導(dǎo)管底的藻體取出，經(jīng)鏡檢 選定某種藻類最多的沉積物，再加清水，繼續(xù)離 心，如此反復(fù)就可得到比較單純的藻體，在接種 相應(yīng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。該法可消除細(xì)菌，并增加

13、純 粹分離的可能性，至少可作為藻種平板培養(yǎng)的準(zhǔn) 備工作。另外，在水液中藻體含量較少時(shí)，可用 此法集中藻體。但此法不能做到使不同藻類完全 分離。 2、稀釋法、稀釋法：該法源于中野治房（1933）的方法。用已 消毒試管5只，在第一管盛蒸餾水10mL，第25管都裝 5mL，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，第1管用滴管滴入混 合藻液12滴，充分振蕩，使均勻稀釋。次用消毒吸管， 從第1管中吸取5mL滴入第二管中如前振蕩，使均勻稀釋。 以后依次同樣滴入第35管，并都充分均勻稀釋。然后 把五個(gè)已盛又消毒的瓊膠培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，加熱使之溶解， 待冷卻而尚未凝固時(shí)，分別滴入五個(gè)試管的藻液各一滴， 用力振蕩，使藻液充分混于

14、培養(yǎng)基中。待冷凝后，把五 個(gè)培養(yǎng)皿放在受著漫射光窗口，一直到出現(xiàn)藻群時(shí)為止。 在20左右時(shí)，約10天即出現(xiàn)藻群。用消過(guò)毒的白金絲 取些藻群，進(jìn)行瓊膠固體培養(yǎng)基的不通氣培養(yǎng)。此過(guò)程 反復(fù)多次，直至得到完全分離的純?cè)宸N群為止。 此法稀釋要使用較多容器分組培養(yǎng)，比較麻煩，但 較易成功。 3、微吸管法、微吸管法：將水樣在載玻片上滴成綠豆 粒大小的一些水滴，這樣可使每個(gè)水滴中 有很少生物而便于分離；在解剖鏡下用微 吸管（口徑小至0.0080.16mm，圓口， 可自行拉制）。將要分離的藻體吸出，用 蒸餾水或平衡礦物質(zhì)溶液沖洗數(shù)次，然后 主導(dǎo)成有培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待生 長(zhǎng)旺盛后，再擴(kuò)大培養(yǎng)。此法較適用

15、于能 運(yùn)動(dòng)的藻類。 4、趨向反應(yīng)法：、趨向反應(yīng)法：利用藻類的特殊 趨向性（如向光、向地等）不同 而分離藻體。此過(guò)程反復(fù)幾次就 可得到一定純度的藻體。分離效 果較好，只是不能應(yīng)用于不運(yùn)動(dòng) 的藻體。 5、平板分離法、平板分離法：在培養(yǎng)液中加入占培養(yǎng)液 1.5的瓊膠，加溶解后，注入培養(yǎng)皿中， 加蓋后用15磅壓力121滅菌20分鐘，即 制成膠質(zhì)培養(yǎng)基（也可用硅酸膠和明膠制 備）。在瓊膠培養(yǎng)基放在40以下的水浴 鍋內(nèi)，開(kāi)蓋用吸管注入混合藻液，搖勻， 使之分散在培養(yǎng)基平面上。之后，可放在 恒溫箱內(nèi)，用熒光燈照射，使藻群生長(zhǎng)。 再經(jīng)鏡檢，反復(fù)此法不斷提純，即可分離 出較純的藻種。 6、固氮藍(lán)藻分離培養(yǎng)法、固

16、氮藍(lán)藻分離培養(yǎng)法：將一小 片藻絲群接種到培養(yǎng)基上，幾天 后再用滅菌白金絲挑取生出的新 藻絲接種到平板培養(yǎng)基上。這樣 經(jīng)幾次分離接種就得到較純的藻 種。 1藻種的選擇：藻種的選擇： 雖然藻類種類較多，但其中僅少數(shù)經(jīng)過(guò)人工 培養(yǎng)。應(yīng)該研究在室外培養(yǎng)其他藻種的可能性和 他們生產(chǎn)的潛力，所選擇的生物種應(yīng)具有下列特 征： 生長(zhǎng)迅速； 對(duì)極端的溫度和輻射條件的耐性范圍大； 蛋白質(zhì)，脂類和糖類含量高，或有選擇地積累一 種特殊的代謝產(chǎn)物（如甘油）； 無(wú)毒性，且易于收獲。 根據(jù)系統(tǒng)的要求和特殊的方法，還可有其他 要求。 2接種接種： 在分離到單純?cè)迦汉?，就可接種到培 養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而移養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)。接 種方法

17、有液體接種和干藻接種。前者是將 藻液直接加入培養(yǎng)液中進(jìn)行攪拌，加入的 藻種分量視水溫而定，水溫較低（10以 內(nèi)）時(shí)，多加；約占培養(yǎng)液總量的3040 左右，水溫適宜時(shí)（2530左右）， 可加58左右。后者若用干藻的藻體接 種，接種量為0.10.2。 3藻種的保存：藻種的保存： 一旦藻種分離得到，就要保存好 以便在一定的時(shí)間內(nèi)供接種用。為此， 要將藻種消毒，避免其他來(lái)源的污染。 給以適當(dāng)?shù)墓庹蘸蜏囟取?在液體培養(yǎng)中，為了快速增殖， 可用5400lx。再得到良好生長(zhǎng)后（1 2周），培養(yǎng)液移到更低的光照條件 （5401100lx），以求緩慢生長(zhǎng)及 儲(chǔ)藏。 藻類在瓊脂培養(yǎng)基上接種后的 藻種，先給予270

18、0lx光照67天， 直到得到良好生長(zhǎng)，然后移到 540800lx光強(qiáng)的地方。 大多數(shù)藻類保存在室溫下 （1520）即可，少數(shù)藻種存 活需較高溫度。 藻種接代一次的頻率視物種及 貯存條件而不同，單胞藻及絲狀 不運(yùn)動(dòng)的物種可以每六個(gè)月到十 二個(gè)月移種一次，有鞭毛的物種 移種次數(shù)要更頻繁些。某些藻種 曾成功地做到了在液氮下長(zhǎng)期保 存。 1、管理、管理 v藻類培養(yǎng)的管理包括培養(yǎng)基養(yǎng)料的補(bǔ) 給、光照及溫度調(diào)節(jié)、CO2的補(bǔ)給、 攪拌、防污等。在培養(yǎng)過(guò)程中，補(bǔ)給 的養(yǎng)料，要選擇肥效速，并有持久性， 來(lái)源較廣，價(jià)格低廉的種類。一般都 以有機(jī)肥料為補(bǔ)肥。 v光照、溫度的調(diào)節(jié)視種類及季節(jié) 而定。室內(nèi)照光一般都采用

19、白熾 電燈和熒光管。溫度調(diào)節(jié)一般采 用室內(nèi)用白熾燈照射培養(yǎng)物或用 溫室、安裝電熱管等升溫，室外 冬季升溫較困難，主要采用玻璃 棚；用冷水管道降溫，或經(jīng)通風(fēng) 遮陽(yáng)降溫。 vCO2的補(bǔ)給一般通過(guò)空氣壓縮機(jī)或橡 皮管將含5CO2的空氣通過(guò)培養(yǎng)物中。 v攪拌是藻類培養(yǎng)不可少的一道工序。 攪拌可使培養(yǎng)物均勻分布，水溫均勻， 利于藻類生長(zhǎng)。攪拌的方法一般為人 力攪拌、風(fēng)力攪拌、空氣攪拌和磁力 攪拌。此外還有循環(huán)流動(dòng)法。 v防污在藻類培養(yǎng)中很重要，對(duì)雜藻及 細(xì)菌的防治主要采用石灰、漂白粉、 硫酸銅等試劑。用10.5ppmCuSO4 防止雜藻的效果較好。當(dāng)有浮游動(dòng)物 污染時(shí)，可施用化學(xué)試劑、殺蟲(chóng)劑等 殺滅，如

20、硫酸銅12ppm可殺滅輪蟲(chóng)、 纖毛蟲(chóng)；漂白粉4ppm對(duì)各種蟲(chóng)類均有 效；食鹽9，可殺滅輪蟲(chóng)；碘液5， 再稀釋到十萬(wàn)分之一，可殺滅纖毛蟲(chóng)。 v培養(yǎng)物的采收的時(shí)間要適當(dāng)，主要根據(jù)其密度大 小決定。采收的方法有： （1）物理濃縮： 離心法：國(guó)外使用最普遍。它利用離心力來(lái)把藻 體與水液分離，是藻體下沉達(dá)到濃縮目的。主要 工具是離心機(jī)。 重力沉降法：利用重力使培養(yǎng)物下沉而得到濃縮 物。使用的工具是沉淀器。 遮光法和降溫法：對(duì)趨光性強(qiáng)的藻類，如衣藻等 進(jìn)行遮蔽光線，使培養(yǎng)物下沉而得到濃縮物。低 溫使藻類也有下沉現(xiàn)象。 （2）化學(xué)濃縮法： 用沉淀劑如明礬、石灰等，使培養(yǎng)物 下沉，而得到濃縮物。明礬0.30.4， 將之研碎，加入培養(yǎng)物中攪拌，半小時(shí)培 養(yǎng)物大部分下沉，在612小時(shí)后，全部 下沉。石灰一般是將其1斤溶在100200 斤水中，制得飽和石灰水，其用量是6。 但該兩法沉淀的藻濃縮物的灰分較多。 此外，較大體積的種