色譜分析第五章(1)

1、 液相色譜儀器液相色譜儀器 液相色譜柱固定相液相色譜柱固定相(分類及選擇分類及選擇) 液相色譜分離原理液相色譜分離原理（液固色譜法、液固色譜法、液液色譜和鍵合相色譜、離子交換液液色譜和鍵合相色譜、離子交換色譜法色譜法）第五章第五章 液相色譜法（液相色譜法（1 1）一一 色譜系統(tǒng)色譜系統(tǒng)12346578910 1. 進樣裝置進樣裝置(2)無限直徑柱無限直徑柱流動相+樣品篩板(1)有限柱，可以出現(xiàn)肩峰一一 色譜系統(tǒng)色譜系統(tǒng) 2 梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置溶劑A 混合室高壓泵1高壓泵2 程 序控制器色譜柱計量泵 (低壓)溶劑A溶劑B混合室高壓泵色譜柱一一 色譜系統(tǒng)色譜系統(tǒng)一一 色譜系統(tǒng)色譜系統(tǒng) 3.

2、檢測器和記錄儀器檢測器和記錄儀器 紫外吸收檢測器紫外吸收檢測器 二極管陣列式檢測器二極管陣列式檢測器 示差折光檢測器示差折光檢測器 熒光檢測器熒光檢測器 二二 色譜填充柱色譜填充柱（1）液相色譜速率理論方程的特點）液相色譜速率理論方程的特點（2）評價高效液相色譜柱參數(shù)的表達）評價高效液相色譜柱參數(shù)的表達（3）液相色譜固定相）液相色譜固定相 二二 色譜填充柱色譜填充柱1. 1. 柱阻參數(shù)和柱滲透性柱阻參數(shù)和柱滲透性 柱阻參數(shù)被定義為柱阻參數(shù)被定義為, 由下式計算由下式計算.3210LudPP23210PmPdLtdLuP滲透性由以下經(jīng)驗公式定義滲透性由以下經(jīng)驗公式定義PLuKF 二二 色譜填充柱

3、色譜填充柱2. 2. 柱效考察柱效考察 分配比 k( tR tm)/ tm 理論板數(shù) n 16( tR / tw )2 理論板高 H L /n 折合板高 h L / dP 折合流速 v(L dP) /(Dmtm) 柱阻參數(shù) (P tm dP2) /( L2 ) 對稱因子 SI 二二 色譜填充柱色譜填充柱3. 3. 正相色譜和反相色譜法正相色譜和反相色譜法 正相色譜正相色譜: 流動相是非極性流動相是非極性, 固定相是極性的固定相是極性的 流動相的極性流動相的極性 固定相的極性固定相的極性（氣相色譜法：流動相是惰性氣體或雙原子氣體是非極性的，固定相的極性相對于流動相肯定是極性的） 反相色譜反相色譜

4、: 流動相是極性流動相是極性, 固定相是非極性的固定相是非極性的 流動相的極性流動相的極性 固定相的極性固定相的極性 三三 液相色譜分離原理液相色譜分離原理 液固色譜分離原理與色譜固定相液固色譜分離原理與色譜固定相 1. 液固色譜原理和分離對象液固色譜原理和分離對象 XmnSa = XanSm)316( amnaSXSXK分配比分配比kk與溶質的吸附系數(shù)與溶質的吸附系數(shù)K的關系為的關系為: : k=K(Ws /Wm)液固色譜適用于分離中等分子量液固色譜適用于分離中等分子量( 小于小于1000 )低揮發(fā)性化合物低揮發(fā)性化合物, 分分子是非極性或中等極性的子是非極性或中等極性的, 非離子型的油溶性

5、樣品非離子型的油溶性樣品. 只要它們具有只要它們具有不同的官能團或者官能團的數(shù)目不同不同的官能團或者官能團的數(shù)目不同, 都適用于液固色譜分離分析都適用于液固色譜分離分析. 特別適用于分離分析異構體特別適用于分離分析異構體( 包括結構異構和空間異構包括結構異構和空間異構 ). 液固色譜固定相的吸附劑有極性和兩類液固色譜固定相的吸附劑有極性和兩類. .非極性吸附劑主要是活性碳非極性吸附劑主要是活性碳, ,因機械性能差因機械性能差, ,已很少使用已很少使用. .極性吸附劑有硅膠、聚酰胺、氧化鋁、氧化鎂和分子篩極性吸附劑有硅膠、聚酰胺、氧化鋁、氧化鎂和分子篩, , 常用的是硅膠和氧化鋁常用的是硅膠和氧

6、化鋁, , 特別是硅膠用得最多特別是硅膠用得最多 硅膠的硅羥基結構硅膠的硅羥基結構SiOHHOSiSiOHHOSiSiOSiSiOHHOSiSiOHSiOHSi OSi 液液色譜和鍵合色譜液液色譜和鍵合色譜 化學鍵合固定相是通過化學反應將固定液鍵合化學鍵合固定相是通過化學反應將固定液鍵合到載體表面到載體表面. .用化學鍵合固定相的液相色譜法稱用化學鍵合固定相的液相色譜法稱為化學鍵合相色譜為化學鍵合相色譜. . 適用于分離分子量不太大適用于分離分子量不太大( (最大最大3000)3000)的同系物的同系物, ,苯并系物和齊聚物等苯并系物和齊聚物等 正相鍵合相色譜用極性鍵合相正相鍵合相色譜用極性鍵

7、合相, ,非極性流動相非極性流動相. . 色譜分離類似于液固色譜色譜分離類似于液固色譜. . 反相鍵合相色譜用非極性鍵合相反相鍵合相色譜用非極性鍵合相( (例如例如, C8, C8或或C18C18鍵合相等鍵合相等 ), ), 極性流動相極性流動相. .化學鍵合相的合成化學鍵合相的合成 酯化反應和酰鹵氨解反應酯化反應和酰鹵氨解反應 SiOH HOR SiOR SiOH SOCl2 SiCl NH2R Si-NHR2 硅膠與有機鹵硅烷反應或格氏試劑或有機鋰硅膠與有機鹵硅烷反應或格氏試劑或有機鋰化物反應化物反應 SiOH Cl-Si-R2(或或R-Si-R2) Si-O-Si-R2 正相鍵合固定相正

8、相鍵合固定相 弱極性弱極性 正相弱極性鍵合固定相的官能團有二醇、醚基、正相弱極性鍵合固定相的官能團有二醇、醚基、三烷胺和硝基等三烷胺和硝基等, , 結構為結構為: : OH OH 二醇: (CH2)3 OCH2CHCH2) 醚基: (CH2)3 OCH2CHCH2 三烷胺: (CH2)3 N(CH3)2 中等極性中等極性鍵合的官能團有氰基等鍵合的官能團有氰基等, , 相也可以用于反相色譜相也可以用于反相色譜操作操作. . 其結構為其結構為: 氰基氰基: (CH2)n CN n=2或或3 強極性強極性鍵合的官能團有烷氨基、氨基和二氨基等鍵合的官能團有烷氨基、氨基和二氨基等, , 其結其結構為構為

9、: 氨基氨基: (CH2)n NH2 n=3或或4 二氨基二氨基: (CH2 )3 NH(CH2) 2NH2 反相鍵合固定相反相鍵合固定相 反相鍵合固定相所鍵合的烷基可以是長碳鏈反相鍵合固定相所鍵合的烷基可以是長碳鏈, , 也可以也可以是短碳鏈是短碳鏈. . 有甲基硅烷、己基硅烷、辛基硅烷、十六有甲基硅烷、己基硅烷、辛基硅烷、十六硅烷、十八硅烷、二十二硅烷等硅烷、十八硅烷、二十二硅烷等. . 其中以十八硅烷其中以十八硅烷 ( (簡稱簡稱ODS或或C18) 和辛硅烷和辛硅烷(C8)、丁基丁基（C4）等）等 影響鍵合固定相在色譜分離過程的行為影響鍵合固定相在色譜分離過程的行為硅膠表面表面覆蓋度、表

10、面鍵合相濃度硅膠表面表面覆蓋度、表面鍵合相濃度鍵合基團的鏈長（鍵合基團的鏈長（鏈越長極性越弱鏈越長極性越弱）載體的性質以及溫度等因素載體的性質以及溫度等因素在選擇固定相時，除了按照鍵合相性質選擇之外還要考在選擇固定相時，除了按照鍵合相性質選擇之外還要考慮被分離組分分子的大小選取恰當孔徑大小的固定相慮被分離組分分子的大小選取恰當孔徑大小的固定相載體。載體。反相鍵合色譜操作反相鍵合色譜操作 （弱）極性組分的分離（弱）極性組分的分離: :選用的流動相應與被分離組分有比較接近結構選用的流動相應與被分離組分有比較接近結構（在樣品濃度下可以互溶）（在樣品濃度下可以互溶）, ,并使使k k 有適當?shù)闹涤羞m當

11、的值. . 操作溫度操作溫度 pH pH值的控制與離子抑制技術值的控制與離子抑制技術 以硅膠為載體的化學鍵合相填料, 合適的pH使用范圍是27.5. 在過低或過高的pH值下使用將導致鍵合相的脫落或硅膠基體溶解.流動相中有機溶劑的比例流動相中有機溶劑的比例 由于以硅膠為載體的化學鍵合相填料有疏水性由于以硅膠為載體的化學鍵合相填料有疏水性, , 表面張力大表面張力大的水不易滲入到固定相的空隙之中的水不易滲入到固定相的空隙之中, , 而且而且, , 組分在疏水性表面組分在疏水性表面與水溶液之間的傳質和平衡過程慢柱效降低與水溶液之間的傳質和平衡過程慢柱效降低, , 從而造成色譜帶從而造成色譜帶展寬展寬

12、. . 為減小這種效應為減小這種效應, , 一般流動相中有機溶劑的比例不宜過一般流動相中有機溶劑的比例不宜過小小, , 以保證柱效和峰形以保證柱效和峰形. .流動相的離子強度流動相的離子強度 必要時可以在流動相中加入鹽類物質必要時可以在流動相中加入鹽類物質, , 溶液離子強度增加溶液離子強度增加, , 減輕了組分分子通過離子交換的途徑與殘留硅醇基的相互作用減輕了組分分子通過離子交換的途徑與殘留硅醇基的相互作用, , 減少拖尾減少拖尾. . 對復蓋量小的鍵合相更為有效對復蓋量小的鍵合相更為有效 . .所用的鹽類可以是所用的鹽類可以是無機鹽無機鹽( (例如例如, ,碳酸銨等碳酸銨等), ), 也可

13、以是有機胺也可以是有機胺( (四烷基銨鹽四烷基銨鹽, ,如四如四甲基硝酸銨等甲基硝酸銨等) )或各種有機陰離子或各種有機陰離子. . 加入的鹽的濃度約為千分加入的鹽的濃度約為千分之幾之幾.水的純度水的純度 水中的雜質和微生物會在柱頭積聚濃集水中的雜質和微生物會在柱頭積聚濃集, , 使柱效降低使柱效降低, , 當流當流動相合適時動相合適時, , 還有可能被淋洗出來從而影響組分的分離和檢還有可能被淋洗出來從而影響組分的分離和檢測測.表 6.4 正相色譜和反相色譜的比較正相色譜反相色譜固定相硅膠、氧化鋁吸附色譜固定相極性固定液分配固定相極性鍵合相色譜,如氰基、醚基鍵合相固定相非極性烷基鍵合相(包括不

14、同鏈長)、苯基鍵合相固定相弱極性鍵合相色譜,如氰基、醚基鍵合相固定相固定相較為穩(wěn)定,保持良好柱效流動相極性比固定相弱極性比固定相強(如, 醇-水或腈水體系等);流動相粘度大, 在相同的流動相流速下,柱壓降大; 但流動相磨擦熱效應與正相色譜相同保留值隨組分分子的極性增加而增大隨流動相的極性增加而減小隨組分分子的極性減小而增大隨流動相的極性增強而增大正 相 色 譜反 相 色 譜分 離 特 點和特 殊 技 術適 于 分 離 油 溶 性 非極 性 或 極 性 較 弱 的化 合 物特 別 適 用 于 分 離 極 性 或 極 性 較 強 的 化 合物 ;離 子 抑 制 技 術 和 離 子 對 色 譜 分

15、離 離 子 化合 物 和 可 離 子 化 的 化 合 物非 水 反 相 色 譜 :分 離 極 度 非 極 性 化 合 物 ;色 譜 柱 達 到 平 衡 較 快 (非 極 性 表 面 的 作用 力 弱 )可 以 直 接 注 射 水 溶 液 樣 品選 擇 適 當 的 流 動 相 分 離 強 極 性 化 合 物 ,出 峰 快 , 減 少 拖 尾 ;操 作 溫 度室 溫最 高 50 80 , 以 降 低 流 動 相 粘 度操 作 費 用取 決 于 有 機 溶 劑 品種 的 搭 配 和 消 耗加 水 可 以 改 變 流 動 的 性 質 ;經(jīng) 梯 度 淋 洗 后 更 容 易 再 生 ;一一 色譜系統(tǒng)色譜系

16、統(tǒng) 二二 色譜填充柱色譜填充柱第五章第五章 液相色譜法（液相色譜法（1 1）正相色譜和反相色譜正相色譜和反相色譜 三三 液相色譜分離原理液相色譜分離原理 液固色譜分離原理與色譜固定相液固色譜分離原理與色譜固定相 液液色譜和鍵合色譜液液色譜和鍵合色譜化學鍵合相的合成化學鍵合相的合成正相鍵合固定相正相鍵合固定相反相鍵合固定相反相鍵合固定相反相鍵合色譜操作反相鍵合色譜操作分離對象：（弱）極性組分的分離分離對象：（弱）極性組分的分離操作條件：溫度、操作條件：溫度、 pH值值 流動相組成及離子強度流動相組成及離子強度 水純度水純度 離子交換色譜離子交換色譜1. 1. 原理和分離對象原理和分離對象 陰離子

17、交換陰離子交換 R+YX R+XY 陽離子交換陽離子交換 RY+X+ RX+Y+)436(RRXYYXKI)446(YYRKXXRKkI離子交換色譜分配比離子交換色譜分配比 k k 與流動相中的反離子的濃度與流動相中的反離子的濃度成反比成反比: : k1/Y+流動相的pH值對離子交換色譜的分配比k也有影響。 離子交換色譜首先是用于離子化合物的分離離子交換色譜首先是用于離子化合物的分離( (如鹽類如鹽類),),但現(xiàn)在更多的是用于有機堿但現(xiàn)在更多的是用于有機堿(B)(B)和有和有機酸機酸(HA)(HA)的分離的分離. . 這是利用有機酸這是利用有機酸( (堿堿) )存在以存在以下平衡下平衡, ,

18、因而可以用離子交換色譜來分離因而可以用離子交換色譜來分離: : HA H+ A BH+ HB+ 糖類在水溶液中不會以離子方式存在糖類在水溶液中不會以離子方式存在. . 通過下通過下面反應面反應, , 形成硼酸鹽的配合物形成硼酸鹽的配合物, , 也可以用離子也可以用離子交換色譜來分離交換色譜來分離: 糖糖BO3 2 - 糖糖BO3 2 -2. 固定相, 離子交換劑 （1）離子交換劑(強酸型包括：磷酸纖維素(P)、甲基磺酸纖維素(SM)、乙基磺酸纖維素(SE)弱酸型包括：羧甲基纖維素(CM)等 ) （2）離子交換劑(強堿型包括：三乙基氨基乙基纖維素(TEAE)、弱堿型包括：二乙基氨基乙基纖維素(D

19、EAE)、氨基乙基纖維素(AE)3. 流動相的影響流動相的影響pH值的影響 弱酸和弱堿組分在流動相中的分布系數(shù)取決于流動相pH值例如樣品組分是堿例如樣品組分是堿.pH.pH值一定值一定, ,流動相中有以下平衡流動相中有以下平衡: : B H+ HB+ HB+ 與交換劑之間又存在以下平衡與交換劑之間又存在以下平衡: : HB+ R Y+ RHB+ Y+ 離子強度的影響離子強度的影響 流動相的離子強度增大流動相的離子強度增大, , 組分的保留值減小組分的保留值減小. 一般一般kk隨離子強度的倒數(shù)成正比隨離子強度的倒數(shù)成正比 增加緩沖溶液總濃度或在流動相中加入某種鹽, 流動相中陰陽離子的總數(shù)增加,

20、它們與組分分子對交換基( R或R+ )的競爭能力增強, 即組分分子的競爭能力減弱, 使組分的k減小, 保留值減小。平衡離子的影響平衡離子的影響 離子交換溶劑強度離子交換溶劑強度, , 直接與流動相中平衡離子的種類直接與流動相中平衡離子的種類有關有關. . 各種離子與離子交換樹脂上的基體離子的親和各種離子與離子交換樹脂上的基體離子的親和力不同力不同, , 與組分分子對基體離子競爭的能力也不同與組分分子對基體離子競爭的能力也不同, , 因而影響組分的保留值因而影響組分的保留值.流動相流速的影響流動相流速的影響 由于離子交換樹脂上的傳質速率很慢，與其他色譜法由于離子交換樹脂上的傳質速率很慢，與其他色譜法不同不同,離子交換色譜柱效對流速十分敏感。隨著流速增離子交換色譜柱效對流速十分敏感。隨著流速增加柱效迅速下降。所以在一般