實(shí)驗(yàn)十 植物DNA抽提

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)10、植物、植物DNA的抽提和酶切的抽提和酶切掌握植物總DNA的抽提方法和原理一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 植物的各個(gè)部位都可用作總DNA的抽提材料，但常用的材料為植物葉片和幼苗。為了獲得高純度的DNA，用作抽提材料的植物幼苗，最好先在黑暗的條件下放置幾天，以消除葉綠素的影響。 植物總DNA的抽提方法有多種，不同的植物都有最合適的抽提方法。但各種方法的基本原理都一樣，其原理是先用機(jī)械的方法使組織和細(xì)胞破碎，然后加入十二烷基肌酸鈉（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadeyltrimethyl ammomum bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（

2、sodium dodecyl sulfate，SDS）等離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使細(xì)胞膜和核膜破裂，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的表面活性劑解聚核中的核蛋白（并與蛋白質(zhì)形成混合物）；再加入酚和氯仿等表面活性劑，使蛋白變性；經(jīng)離心除去植物的組織和變性蛋白；上清液中加入無(wú)水乙醇或異丙醇使DNA沉淀；沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。植物植物DNA提取主要方法：提取主要方法：SDS法、法、CTAB法法CTAB：十六烷基三乙基溴化銨，是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與十六烷基三乙基溴化銨，是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7

3、mol/L）是可溶的，當(dāng)降低鹽濃度）是可溶的，當(dāng)降低鹽濃度到一定程度（到一定程度（ 0.3mol/L ）時(shí)，從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可以將）時(shí)，從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可以將CTAB與與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)分開(kāi)，然后再將核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)分開(kāi)，然后再將CTAB與核酸的復(fù)合與核酸的復(fù)合物溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀（物溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀（CTAB能溶于乙醇）。能溶于乙醇）。與與SDS法相比，最大的優(yōu)點(diǎn)就是能很好的去除糖類(lèi)雜質(zhì)。多糖類(lèi)雜質(zhì)的去法相比，最大的優(yōu)點(diǎn)就是能很好的去除糖類(lèi)雜質(zhì)。多糖類(lèi)雜質(zhì)的去除主要是通過(guò)高鹽緩沖液的選擇性沉淀。除主要是通過(guò)

4、高鹽緩沖液的選擇性沉淀。SDS法：法：十二烷基磺酸鈉，操作簡(jiǎn)單、溫和，也可提取到分子量較高的十二烷基磺酸鈉，操作簡(jiǎn)單、溫和，也可提取到分子量較高的DNA，但所得產(chǎn)物含糖類(lèi)雜質(zhì)較多，所提，但所得產(chǎn)物含糖類(lèi)雜質(zhì)較多，所提DNA也可直接用于也可直接用于Southern雜雜交，但內(nèi)切酶消化時(shí)需加大限制性?xún)?nèi)切酶用量，并適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。交，但內(nèi)切酶消化時(shí)需加大限制性?xún)?nèi)切酶用量，并適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。PVP：聚乙烯吡咯烷酮，可與多酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)合。聚乙烯吡咯烷酮，可與多酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)合。水稻基因組大小約水稻基因組大小約400Mb四、儀器設(shè)備四、儀器設(shè)備五、實(shí)驗(yàn)用具五、實(shí)驗(yàn)用具恒溫培養(yǎng)箱 高速臺(tái)式離心機(jī)（冷凍式或非冷

5、凍式） 旋渦振蕩器 電泳裝置2套 液氮罐冰盒 微量離心管 移液器 吸管頭若干1.5毫升離心管架1個(gè) 研缽三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻葉片六、試劑六、試劑無(wú)水乙醇, 70%乙醇 氯仿 瓊脂糖 異丙醇TBE電泳緩沖液 TE緩沖液（pH 8.0） 10 mg/ml的RNaseA溶液3 M 乙酸鈉（NaAc）SDS法DNA抽提緩沖液（配方如下）：水稻基因組水稻基因組DNA的微量抽提的微量抽提DNA細(xì)長(zhǎng)，因?yàn)榉蛛x純化過(guò)程不可避免有降解，無(wú)法分離純化出其細(xì)長(zhǎng)，因?yàn)榉蛛x純化過(guò)程不可避免有降解，無(wú)法分離純化出其完整分子，得到的只是完整分子，得到的只是DNA分子的片段。用于分子的片段。用于Sou

6、thern雜交的植物雜交的植物DNA樣品在長(zhǎng)度上應(yīng)不小于樣品在長(zhǎng)度上應(yīng)不小于50 kb，即瓊脂糖凝膠電泳中與，即瓊脂糖凝膠電泳中與 DNA遷遷移率一致（并非大小一致，而是普通瓊脂糖凝膠分辨率所限）。移率一致（并非大小一致，而是普通瓊脂糖凝膠分辨率所限）。為避免機(jī)械剪切為避免機(jī)械剪切DNA分子，提取分子，提取DNA時(shí)應(yīng)該把吸頭的尖端剪掉一部時(shí)應(yīng)該把吸頭的尖端剪掉一部分（剪刀用分（剪刀用70%乙醇清潔），而且吸取上清的時(shí)候動(dòng)作要輕緩。乙醇清潔），而且吸取上清的時(shí)候動(dòng)作要輕緩。1.將水稻葉片約0.10.2 g，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮，將葉片研磨成粉狀；將粉末倒入2ml離心管中。注意：動(dòng)作迅速，不

7、要讓粉末解注意：動(dòng)作迅速，不要讓粉末解凍。凍。2.加入0.8毫升在65水浴中預(yù)熱的抽提緩沖液，混勻，放入65水浴中保溫2030分鐘 (期間每隔5分鐘輕輕搖動(dòng)一次離心管)。3.加入0.8 ml氯仿:異戊醇:乙醇（76：4：20），混勻后，平放在振蕩器上搖動(dòng)10分鐘（振蕩頻率以抽提液與氯仿完全混合為度）。4.離心15分鐘（12000 rpm、20），將上清液吸入一個(gè)新的2 ml離心管（記錄體積）。5.加入1/10體積的3M NaAc和等體積的冷異丙醇，輕輕混勻，靜置5 min。6.12000 rpm離心5 min收集沉淀。棄上清，用0.5 ml 70%乙醇洗沉淀兩次，每次12000 rpm離心5

8、min。棄乙醇后短暫離心用移液器除去乙醇后于熱板上（45 ）干燥1 min。7.加入100 ul 1TE溶解沉淀，并與65下保溫10 min，期間混勻幾次。加5 l 10 mg/ml 的RNaseA，37度消化1小時(shí)，之后直接純化或于-20冰箱保存。 水稻基因組水稻基因組DNA的微量抽提的微量抽提-SDS法法七、實(shí)驗(yàn)步驟七、實(shí)驗(yàn)步驟1.合并所提DNA，調(diào)整體積到300ul，然后加入等體積的酚/氯仿，充分輕柔上下翻轉(zhuǎn)混勻10分鐘，之后于12000rpm離心10min。吸取上清到另一支1.5mL離心管，加入等體積氯仿抽提10分鐘，之后于12000rpm離心10min （4度） 。2.吸取上清到另一

9、支1.5mL離心管，再加入1/10體積的3M NaAc和2.5倍上清體積的預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后置于-20冰箱中15min，取出后12000rpm離心10min（4度）。3.去盡酒精，用500L 70乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心2min（4度） 。4.去盡酒精，風(fēng)干，溶解于20L-30uL 1TE（可先在熱板上預(yù)熱到65 ）中。5.電泳檢測(cè)，取1ul DNA稀釋10倍，之后取1ul 稀釋的DNA配制點(diǎn)樣體系：1L DNA8L dH2O1L 10loading buffer。用未酶切的 DNA作為DNA分子量標(biāo)記和定量marker。注：氯仿抽提時(shí)，要保證抽提液中有一定的鹽溶液，否則注：氯仿

10、抽提時(shí)，要保證抽提液中有一定的鹽溶液，否則DNA進(jìn)入沉淀。進(jìn)入沉淀。水稻基因組水稻基因組DNA 純化純化在氯仿中加入0.3%乙醇可以消除揮發(fā)在空氣中的毒性。氯仿毒性主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）本身是有毒的，其蒸汽揮發(fā)到空氣中造成污染；（2）在光照下會(huì)和氧氣緩慢反應(yīng)，產(chǎn)生毒性更大的氣體光氣。所以，氯仿在成品售出前，首先要用深色玻璃瓶封裝，防止產(chǎn)生光氣；其次要加入少量的乙醇，乙醇會(huì)和光氣反應(yīng)生成無(wú)毒的碳酸二乙酯。另外，乙醇等無(wú)毒物質(zhì)覆蓋在氯仿的液面上還能防止氯仿本身的揮發(fā)。氯仿氯仿水稻基因組水稻基因組DNA的酶切的酶切酶切體系：40-50ul （用1.5ml的離心管）10M-buffer：4ulHi

11、nd III: 2ul (15U/ul)水稻基因組DNA：5ug（同位素方法3ug即可）ddH2O：補(bǔ)平體積到40ul 酶切條件：37 過(guò)夜酶切（注：不同物種酶切時(shí)間不同，如小麥4個(gè)小時(shí)足夠了！)KanrLBRBpBR322 oripVS1 ori35st HPT P35SNos3pOxEcoRIEcoRIPubiScaIgtttggtgttacttctgcagggtaccggcgcgccaagcttactagtacgcgttatggatcctatcaPst KpnSpeHindMluBamH注： Pubi與克隆位點(diǎn)之間沒(méi)有起始密碼，因此正義表達(dá)的目的基因要保留起始密碼ATGcaga原Ubiquitin的起始密碼位置用于轉(zhuǎn)基因的植物雙元載體：用于轉(zhuǎn)基因的植物雙元載體：pOx思考題思考題1、簡(jiǎn)述SDS法抽提植物DNA的原理。抽提過(guò)程中