對(duì)川楝內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定

1、對(duì)川楝內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定川楝 Melia toosendan Sieb. et Zucc. 是楝科（Meliacease）楝屬M(fèi)elia Linn. 的落葉喬木，主要分布于四川、貴州、云南，主要有效成分為川楝素（toosendanin，C3OH38O11），有驅(qū)蟲、抗癌、抗毒素等作用。川楝雖然分布廣泛，但川楝素的產(chǎn)量卻較低，而藥用植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的天然活性物質(zhì)，如苦楝素、鬼臼毒素類似物。聚酮類化合物（polyketide，PK）與非核糖多肽（nonribosonmal peptide，NRP）是 2 類具有代表性的天然產(chǎn)物，可用作抗生素、抗真菌劑、抗癌藥物、免疫制劑、抗病

2、毒藥物等。催化這些天然產(chǎn)物合成途徑的酶稱為聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS ）和非核糖體多肽合成酶（ nonribosonmalpeptidesynthetase，NRPS）。已有研究發(fā)現(xiàn)，禾本科植物內(nèi)生真菌中存在 NRPS，番荔枝 Annonasquamosa L. 內(nèi)生真菌中存在 PKS。但是目前對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌 PKS 和 NRPS 的研究相對(duì)較少。傳統(tǒng)真菌的鑒定以形態(tài)、生化等表型特征為基礎(chǔ)，過程復(fù)雜，同時(shí)不產(chǎn)孢菌株用此方法鑒定較為困難。而分子生物學(xué)的發(fā)展為真菌的鑒定提供了更全面、科學(xué)的依據(jù)。ITS 序列在核苷酸序列上的高度變異性和長度上的保守型，可以獲得足夠

3、的信息來反映真菌種水平間的差異，目前已應(yīng)用于藥用植物內(nèi)生真菌的鑒定。本研究對(duì)川楝內(nèi)生真菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，通過 PCR 擴(kuò)增其 ITS 序列、PKS 和 NRPS 基因，進(jìn)行BLAST 比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，以期了解川楝內(nèi)生真菌的遺傳多樣性，為川楝內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用提供依據(jù)，同時(shí)豐富 PKS 和 NRPS 基因數(shù)據(jù)庫。1、 材料采集四川省雅安市、攀枝花市、宜賓市、廣元市、成都市、樂山市、西昌市、綿陽市、達(dá)州市 9個(gè)地點(diǎn)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)胡超講師鑒定為川楝 Meliatoosendan Sieb. et Zucc. 的根、莖、葉、皮、果，從中共分離得到了 126 株內(nèi)生真菌，經(jīng)去重和限制性片段長

4、度多態(tài)性（ restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP）分析后選取 39 株多樣性明顯的菌株作為本研究的目標(biāo)菌株。2、 方法2.1 內(nèi)生真菌表型鑒定用 PDA 培養(yǎng)基對(duì) 39 株菌株進(jìn)行插片培養(yǎng)，觀察菌落特征和顯微形態(tài)特征，參照魏景超=的方法將其鑒定到屬。2.2 內(nèi)生真菌總 DNA 的提取采用改良的 CTAB 法提取川楝內(nèi)生真菌的DNA，用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的質(zhì)量和大小，置于?20 保存?zhèn)溆谩?.3 ITS-PCR 擴(kuò)增ITS-PCR 擴(kuò)增所用引物為 ITS1（5’-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3&rsq

5、uo;）和 ITS4（5’-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3’）由上海生工合成。ITS-PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系（30 μL）：2×PCRMix 15 μL，ITS1（10 pmol）1 μL，ITS4（10 pmol）1 μL，DNA 1 μL，無菌重蒸水補(bǔ)足至 30 μL。反應(yīng)程序：94 預(yù)變性 5 min，94 變性 1 min，55 退火 1 min，72 延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)，72 延伸 10 min，產(chǎn)物于 4 恒溫保存。用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的大小。2.4 PKS 基因的擴(kuò)增P

6、KS 基因擴(kuò)增所用引物為 KAF（5’-GARKSICAYGGIACIGGIAC-3’）、KAR1（5’-C-CAYTGIGCICCRTGICCIGARAA-3’ ） 和 KAR2（5’-CCAYTGIGCICCYTGICCIGTRAA-3’）由上海生工合成。PKS 擴(kuò)增的反應(yīng)體系（30 μL）：2×PCR Mix 15μL，KAF（10 pmol）1 μL，KAR1 或 KAR2（10 pmol）1 μL，DNA 2 μL，無菌重蒸水補(bǔ)足至 30 μL。反應(yīng)程序：94 預(yù)變

7、性 5 min，94 變性 1 min，60 退火 1 min，72 延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)，72 延伸 10 min，產(chǎn)物于 4 恒溫保存。用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的大小。2.5 NRPS 基因的擴(kuò)增NRPS 基因擴(kuò)增所用引物為 AUG003（ 5’-CCGGCACCACCGGNAARCCHAA-3’ ） 和AUG007（5’-CCGGACCATGTCGCCNGTBYKRT-A-3’）由上海生工合成。NRPS 擴(kuò)增的反應(yīng)體系（30 μL）：2×PCR Mix 15μL，AUG003（10 pmol）1 &

8、mu;L，AUG007（10 pmol）1 μL，DNA 2 μL，無菌重蒸水補(bǔ)足至 30 μL。反應(yīng)程序：94 預(yù)變性 4 min，94 變性 30 s，60 退火 1 min，72 延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)，72 延伸10 min，產(chǎn)物于 4 恒溫保存。用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的大小。2.6 測序及序列分析將 ITS 的產(chǎn)物和得到的 PKS、NRPS 基因片段直接送華大基因科技有限公司測序。將所得序列在 GenBank 中進(jìn)行BLAST同源性檢索，將獲得的同源序列和測定序列用 Clustal X 進(jìn)行分析，采用 MEGA5.0 軟件包中的 Kimura-2-

9、Parameter Distance 模型進(jìn)行多序列匹配，用鄰接法（Neighbor-joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000 次檢測各分支的置信值。將所測的序列提交到 GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)。3、 結(jié)果與分析3.1 川楝內(nèi)生真菌的鑒定本實(shí)驗(yàn)共分離得到 126 株內(nèi)生真菌，經(jīng)初步去重和限制性片段多態(tài)性分析后選擇 39 株為代表菌株進(jìn)行進(jìn)一步分析，見表 1。經(jīng)過表型鑒定（部分菌株的表型見圖 1），能夠鑒定到屬的內(nèi)生真菌菌株為 31 株，分屬于 17 個(gè)屬。部分菌株由于未產(chǎn)孢而沒有鑒定到屬。它們分別為青霉屬 Penicillium Lk.ex Frise、

10、木霉屬 Trichoderma Pers. ex FR.、曲霉屬Aspergillus Micheli ex Fr.、交鏈孢屬 Alternaria Neesex Wallr.、黑蔥花霉屬 Periconia Tode ex Schw.、附球菌屬 Epicoccum Lk. ex Wallr.、鐮孢霉屬 FusariumLk. ex Fr.、枝頂孢霉屬 Acremonium Lk. ex Fr.、多節(jié)孢屬 Nodulisporium Press、肉座菌屬 Hypocrea Fr.、毛殼菌屬 Chaetomium Kunze et Schmidt、脈紋孢菌屬 Neurospora Shear e

11、t Dodge 、 擬 莖 點(diǎn) 霉 屬Phomopsis Sacc.、芽枝霉屬 Cladosporium Link exFr.、節(jié)孢霉屬 Arthrinium Kunze、莖點(diǎn)菌屬 PhomaSacc. 和短梗蠕孢霉屬 Trichocladium Harz。3.2 川楝內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析川楝內(nèi)生真菌菌株 DNA 用引物 ITS1 和ITS4 擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物，大小在 500600 bp（圖 2）。通過用 BLAST 在 Genbank 數(shù)據(jù)庫序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，川楝內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)具有非常豐富的資源多樣性。在本研究中，序列相似性最低的為 SCAU-F-210 ， 與 相 似 性 最

12、高 的 Periconiamacrospinosa 相 似 性 僅 為 86% ； 產(chǎn) 孢（SCAU-F-182）與 Botryotinia fuckeliana 相似性最高，為 100%。系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 3）顯示，川楝內(nèi)生真菌分屬于短梗蠕孢霉屬、微殼色單隔孢屬 MicrodiplodiaAll.、青霉屬、交鏈孢屬、脈紋孢菌屬、附球霉屬、新叢赤殼科屬 Neonectria Wollenw.、曲霉屬、芽枝霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬、木霉屬、莖點(diǎn)霉屬、Neofusicoccumparvum Crous、黑蔥花霉屬、鐮孢霉屬、毛霉屬 MucorMicheli ex Fries、節(jié)孢霉屬、毛殼菌屬、皺赤殼屬Ru

13、gonectria P. Chaverri et Samuels、多節(jié)孢屬、肉座菌屬、鹿角菌屬 Xylaria Hill ex Grev.、葡萄孢盤菌屬 Botryotinia Whetzel、枝頂孢霉屬和炭墊屬Nemania S. F. Gray 25 個(gè)屬。所得 39 個(gè)序列中有 7個(gè)序列歸屬于曲霉屬（17.9%），6 個(gè)歸屬于青霉屬（15.4%），為川楝內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬。3.3 PKS 基因的分析部分菌株的 PKS 基因擴(kuò)增電泳圖見圖 4，由圖可見產(chǎn)物條帶在 600 bp 左右。共得到 12 個(gè) PKS 基因片段，占總量的 30.8%。將測序得到的 PKS 基因片段用 BLAST 比對(duì)，

14、結(jié)果見表 2。本研究得到的 PKS 片段與 GenBank 中已知 PKS 序列的相似度較高，從 99%100%。本研究中得到的 PKS 基因均為 I 型的 PKS。PKS 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 5）顯示，它們分屬于曲霉屬、交鏈孢屬、鐮孢霉屬、葡孢盤菌屬，其中有 7 個(gè)為曲霉屬。3.4 NRPS 基因的分析菌株的 NRPS 基因擴(kuò)增電泳圖見圖 6，由圖可見產(chǎn)物條帶在 700 bp 左右。本研究共得到了 6 個(gè)NRPS 基因片段，占總量的 15.4%。將測序得到的NRPS 基因片段用 BLAST 比對(duì)，結(jié)果見表 3。本研究得到的 NRPS 片段與 GenBank 中已知 NRPS 序列的相似度很

15、高，從 99%100%。得到的 6 個(gè) NRPS 基因的相似序列都為Penicillium sp.，因此 NRPS 的系統(tǒng)發(fā)育樹省略。4、 討論研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物具有非常豐富的內(nèi)生真菌資源。而楝科植物內(nèi)生真菌的研究主要集中在苦楝M. azedarach L. 和印楝 Azadirachta indica A. Juss上，本研究彌補(bǔ)了對(duì)川楝內(nèi)生真菌研究的不足。Geris 等從巴西苦楝分離出 55 株內(nèi)生真菌，分屬于 8 個(gè)屬，青霉屬和曲霉屬是最多的。陳遠(yuǎn)友等從安徽農(nóng)大校園等地苦楝分離出了 290 株，分屬于11 個(gè)屬，其中匐柄霉屬 Stemphylium Wallr.、交鏈孢屬、刺盤孢屬 Co

16、lletotrichum Corda 和擬莖點(diǎn)霉屬是優(yōu)勢屬。邵士成等從云南印楝分離出 372 株，分屬于 50 個(gè)屬，分布廣泛的是刺盤孢屬、交鏈孢屬、鹿角菌屬。Verma 等從印度印楝中分離出了 233株，分屬于 18 個(gè)屬，擬莖點(diǎn)霉屬、枝孢霉屬、擬盤多毛孢屬 Pestalotiopsis Steys. 為優(yōu)勢屬。本研究對(duì)川楝內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，川楝內(nèi)生真菌分屬于 25 個(gè)屬，青霉屬、曲霉屬為優(yōu)勢屬，可能植物種類和地理位置對(duì)內(nèi)生真菌的資源多樣性、優(yōu)勢種群有很大的影響。其他研究人員對(duì)川楝和印楝內(nèi)生真菌的研究大多采取形態(tài)學(xué)鑒定的方法，而本研究采取形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合

17、的方法，彌補(bǔ)了不產(chǎn)孢菌株鑒定的不足，使川楝內(nèi)生真菌的資源多樣性較為完整，同時(shí)也證明了 ITS 結(jié)果的可靠性。但是，由于數(shù)據(jù)庫還不夠完善，有的菌株并沒有鑒定到種。川楝內(nèi)生真菌在資源的多樣性上為尋找產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的菌株奠定了基礎(chǔ)。研究人員已經(jīng)從印楝和苦楝的內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)了多種生物活性物質(zhì)。Geris 等從苦楝內(nèi)生真菌青霉屬分離得到了有抑菌活性的 3 個(gè)化合物。Campos 等從苦楝內(nèi)生真菌 Aspergillus aculeatusIizuka 中首次分離到 2 個(gè)聚酮類化合物。Yang 等從苦楝內(nèi)生真菌 Fusarium sp. LN-10 發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了有較強(qiáng)的海蝦致死活性的化合物。本

18、研究從川楝內(nèi)生真菌中篩選出了 12 株含 PKS 基因的菌株和 6 株含 NRPS 基因的菌株，這些菌株隸屬于青霉屬、曲霉屬、葡孢盤菌屬、交鏈孢屬、鐮孢霉屬。本研究從 6 株青霉屬菌株中篩選出了 NRPS 基因，7株曲霉屬菌株中篩選出了 PKS 基因，表明川楝的內(nèi)生真菌還是有發(fā)掘潛力的，其中青霉屬和曲霉屬值得深入研究。參考文獻(xiàn)：1 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì). 中華本草 M.上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1998.2 張建樓, 鐘秀會(huì). 川楝素的藥理作用研究概況 J. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2007(5): 65-67.3 Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol a