T∕CSCB 0005-2021 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

1、ICS 07.080 CCS A 40T/CSCB 00052021人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞Human induced pluripotent stem cell2021-01-09 發(fā)布2021-04-09 實(shí)施中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)發(fā)布T/CSCB 00052021本文件按照GB/T 1.12020(標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定 起草。本文件由中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)干細(xì)胞生物學(xué)分會(huì)提出。本文件由中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位：安徽中盛溯源生物科技有限公司、國(guó)家干細(xì)胞資源庫(kù)、中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞與再生 醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究院、北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院、中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所、國(guó)家干

2、細(xì)胞資源庫(kù)創(chuàng)新聯(lián)盟、 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、北京工商大學(xué)。本文件主要起草人:俞君英、趙同標(biāo)、馬愛進(jìn)、張穎、張可華、程臨釗、鄧宏魁、康九紅、金子兵、潘光錦、 郝捷、張勇、傅博強(qiáng)、胡士軍、那潔、劉妍、曹佳妮、王磊、祝煥新。IT/CSCB 00052021人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞1范圍本文件規(guī)定了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的技術(shù)要求、檢測(cè)方法、使用說明、標(biāo)簽、包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和廢棄物 處理要求。本文件適用于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的生產(chǎn)和檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文 件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單

3、)適用于 本文件。GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法WS 213 丙型肝炎診斷WS 273 梅毒診斷WS 293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)WS 299乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)T/CSCB 0001 干細(xì)胞通用要求T/CSCB 0002 人胚干細(xì)胞中華人民共和國(guó)藥典全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 human induced pluripotent stem cell由人體細(xì)胞經(jīng)重編程而獲得的具有自我更新能力和向三胚層細(xì)胞分化潛能的一種干細(xì)胞。3.2重編程 reprogramming通過外源基因表達(dá)、化合物誘導(dǎo)、表觀遺傳修飾等途徑來

4、獲得人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的過程。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA 脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)HBV 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)HCMV人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus)HCV 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)HEBV 人類皰疹病毒(Human Epstein-Barr Virus)hiPSC 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced Pluripotent Stem Cell)HIV 人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)HTLV人類嗜 T 細(xì)胞病毒(H

5、uman T-lymphotropic Virus)PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)STR 短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeat)TP梅毒螺旋體(Treponema Pallidum)5技術(shù)要求5.1原材料和輔料5.1.1 應(yīng)符合 T/CSCB 0001 要求。5.1.2應(yīng)建立供者細(xì)胞采集的供者評(píng)估與篩選標(biāo)準(zhǔn)、采集方法、運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)和交接標(biāo)準(zhǔn)，保證供者和細(xì)胞 的安全。5.1.3 供者應(yīng)篩查 HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV 和 TP，并記錄結(jié)果。5.2關(guān)鍵質(zhì)量屬性5.2.1細(xì)胞形態(tài)應(yīng)呈克隆團(tuán)生長(zhǎng)、克隆邊緣清晰、核質(zhì)比高

6、、形態(tài)均一，克隆內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞之間接觸緊密。5.2.2染色體核型正常核型應(yīng)為46，XY或46，XX。5.2.3細(xì)胞存活率未凍存細(xì)胞存活率90%，凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率60%。5.2.4細(xì)胞標(biāo)志蛋白細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA3、SSEA4、TRA-l-60和TRA-1-81中的任意兩個(gè)陽性率70.0%；細(xì)胞內(nèi) 部標(biāo)志物OCT4陽性率70.0%、NANOG陽性率70.0%。5.2.5 畸胎瘤形成應(yīng)具備在體內(nèi)形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤的能力。5.2.6 微生物真菌、細(xì)菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP應(yīng)為陰性。5.3過程控制5.3.1細(xì)胞鑒別細(xì)胞產(chǎn)品STR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與供者細(xì)

7、胞保持一致。5.3.2重編程方法應(yīng)記錄重編程方法。5.3.3外源重編程基因應(yīng)檢測(cè)并記錄外源重編程基因的基因組整合及表達(dá)情況。注：hiPSC若作為功能細(xì)胞制劑原料，其外源重編程基因檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。6 檢驗(yàn)方法6.1細(xì)胞形態(tài)體外二維培養(yǎng)條件下，使用倒置相差顯微觀察。6.2染色體核型按照中華人民共和國(guó)藥典中“生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”項(xiàng)檢測(cè)。 6.3細(xì)胞存活率按照附錄A的方法檢測(cè)。6.4細(xì)胞標(biāo)志蛋白按照附錄B的方法檢測(cè)。6.5外源重編程基因按照附錄C的方法檢測(cè)。6.6 畸胎瘤形成按照附錄D的方法檢測(cè)。6.7微生物6.7.1真菌按照中華人民共和國(guó)藥典中“1101無菌檢查法”項(xiàng)檢測(cè)

8、。6.7.2 細(xì)菌按照中華人民共和國(guó)藥典中“1101無菌檢查法”項(xiàng)檢測(cè)。6.7.3支原體按照中華人民共和國(guó)藥典中“3301支原體檢查法”項(xiàng)檢測(cè)。6.7.4 HIV按照WS 293核酸法檢驗(yàn)。6.7.5 HBV按照WS 299核酸法檢測(cè)。6.7.6 HCV按照WS 213核酸法檢測(cè)。6.7.7 HTLV按照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程核酸法檢驗(yàn)。6.7.8 EBV按照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程核酸法檢驗(yàn)。6.7.9 HCMV按照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程核酸法檢驗(yàn)。6.7.10 TP按照WS 273核酸法檢測(cè)。6.7.11外源病毒因子檢測(cè)按照中華人民共和國(guó)藥典中“3302外源病毒因子檢查法”項(xiàng)檢測(cè)。7 檢驗(yàn)規(guī)則7.

9、1抽樣方法和數(shù)量.2A在一個(gè)生產(chǎn)周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一代次、同一方法制備出來的產(chǎn)品為一批。 在同一批的產(chǎn)品中隨機(jī)抽取3個(gè)最小包裝單元。出廠檢驗(yàn)7.2.1每批產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，并附檢驗(yàn)報(bào)告。7.2.2出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)包括5.2規(guī)定的所有項(xiàng)目。7.3 復(fù)核檢驗(yàn)根據(jù)需要，應(yīng)由專業(yè)細(xì)胞檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)/實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)。7.4 判定規(guī)則7.4.1出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合5.2規(guī)定，判為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合 格品。7.4.2復(fù)核檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合5.2規(guī)定，判為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合 格品。8使用說明應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：a）細(xì)胞名稱；b）細(xì)胞代次；c

10、）細(xì)胞數(shù)量；d）重編程方法；e）外源重編程基因殘留檢測(cè)結(jié)果;f）生產(chǎn)日期；g）生產(chǎn)批號(hào)；h）生產(chǎn)組織；i）儲(chǔ)存條件；j）運(yùn)輸條件；k）使用方法；l）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)；m）生產(chǎn)地址；n）聯(lián)系方式：o）郵政編碼；P）注意事項(xiàng)。注：根據(jù)用戶需求，可標(biāo)注內(nèi)毒素含量。9 標(biāo)簽應(yīng)至少包括以下內(nèi)容a)細(xì)胞名稱；b)細(xì)胞代次；c)細(xì)胞數(shù)量；d)生產(chǎn)批號(hào)；e)生產(chǎn)組織；f)生產(chǎn)日期。10包裝、儲(chǔ)存及運(yùn)輸10.1 包裝應(yīng)選擇對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無影響的材料和容器。10.2儲(chǔ)存10.2.1 應(yīng)符合 T/CSCB 0001 和 T/CSCB 0002 要求。10.2.2 應(yīng)在低于一 130 C環(huán)境下儲(chǔ)存。10.3

11、運(yùn)輸10.3.1 應(yīng)符合 T/CSCB 0001 和 T/CSCB 0002 要求。10.3.2凍存的細(xì)胞應(yīng)在干冰或低于一 130 C條件下運(yùn)輸，非凍存細(xì)胞建議在2 C8 0下運(yùn)輸。 11廢棄物處理人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的生產(chǎn)和檢測(cè)過程中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照T/CSCB 0001中的規(guī)定處理。附錄 A(規(guī)范性)細(xì)胞存活率細(xì)胞計(jì)數(shù)法A.1儀器和設(shè)備A. 1.1顯微鏡。A. 1.2 血球計(jì)數(shù)板。A. 2試劑除特別說明外，所用試劑均為分析純，檢測(cè)用水均為去離子水。A. 2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2臺(tái)盼藍(lán)染液:使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(A.2.1)稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。A.3檢測(cè)步驟A.3

12、.1細(xì)胞懸液制備根據(jù)檢測(cè)需求，收集待檢測(cè)細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(A.2.1)配制細(xì)胞懸液。A.3.2 細(xì)胞染色按1 : 1的體積比將臺(tái)盼藍(lán)染液(A.2.2)與細(xì)胞懸液(A.3.1)混合均勻。A.3.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)將蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)板(A.1.2)計(jì)數(shù)槽上，取10 ML混合液(A.3.2)滴在一側(cè)計(jì)數(shù)室的蓋玻片邊 緣，另取10 ML混合液，滴在另一側(cè)計(jì)數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間，靜置 30 s，將計(jì)數(shù)板置顯微鏡(A.1.1)下對(duì)被染色的細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照步驟A.3.2A.3.3再重復(fù)一次。A.3.4細(xì)胞存活率計(jì)算A.4計(jì)算與分析細(xì)胞存活率計(jì)算公式見式(A.1):

13、X = (M-S)/MX 100%( A.1 )式中：X細(xì)胞存活率；M細(xì)胞總數(shù)；S染色的細(xì)胞數(shù)。計(jì)算兩次計(jì)數(shù)活細(xì)胞比率結(jié)果的平均值，記為細(xì)胞平均存活率。A. 5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。附錄B(規(guī)范性)細(xì)胞標(biāo)志蛋白細(xì)胞流式分析B.1儀器和設(shè)備B.1.1流式細(xì)胞儀。B.1.2水平離心機(jī)。B. 1.3 電子天平。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。B.2.1氯化鈉(NaCl)：分析純。B.2.2 氯化鉀(KC1)：分析純。B.2.3 無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：分析純。B.2.4

14、無水磷酸二氫鉀(KH2PO4)：分析純。B.2.5 多聚甲醛(PFA):純度95%。B.2.6氫氧化鈉(NaOH):分析純。B.2.7牛血清白蛋白(BSA)：純度98%。B.2.8 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。B.2.9抗體。B. 2.10使用電子天平(B.1.3)稱量按照相應(yīng)要求配制流式檢測(cè)所需的液體：洗滌液、固定液、封閉通透 液、抗體稀釋液。B. 3樣品制備和保存B.3.1洗滌液和固定后的樣品于2 C8 C保存。B. 3.2固定液放人分裝容器中，密封并標(biāo)記，按照相關(guān)試劑使用說明保存。B. 3.3相關(guān)抗體按說明書保存。B.4檢測(cè)步驟B.4.1樣品準(zhǔn)備和固定收集單細(xì)胞，使用

15、水平離心機(jī)(B.1.2)250g，離心3 min。棄上清，加適量固定液冰上放置10 min， 然后使用水平離心機(jī)(B.1.2)取適量洗滌液洗滌3次5次，每次3 min5 min。B. 4.2 封閉和通透用封閉通透液重懸細(xì)胞并把細(xì)胞分成兩等份，分別作為實(shí)驗(yàn)組和同型對(duì)照抗體組，冰上孵育 20 min，然后用洗滌液清洗一遍。B. 4.3抗體孵育按照抗體說明書進(jìn)行稀釋使用。B.4.4 過濾上機(jī)用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過40濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀(B.1.1)應(yīng)用手冊(cè)上機(jī)檢測(cè)。B.4.5 圈門設(shè)定原則首先根據(jù)顆粒度和透光性設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)同型對(duì)照 抗體組

16、熒光強(qiáng)度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細(xì)胞群2,排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。同型對(duì) 照抗體作為陰性對(duì)照。B.5結(jié)果分析得到的檢測(cè)結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。11附錄C(規(guī)范性)外源重編程基因定量PCR法C.1儀器和設(shè)備C.1.1定量PCR擴(kuò)增儀。C.2試劑C. 2.1商品化定量PCR擴(kuò)增試劑盒。C.2.2 商品化基因組DNA提取試劑盒。C. 2.3目標(biāo)基因PCR引物。C.3檢測(cè)步驟C. 3.1提取樣品基因組DNA。按照試劑盒說明書進(jìn)行。C. 3.2使用DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品使用定量PCR擴(kuò)增儀(C.1.1)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，建立目標(biāo)基因檢測(cè)標(biāo) 準(zhǔn)曲線。按照試劑盒說明書進(jìn)行。C.

17、3.3使用樣品基因組DNA使用定量PCR擴(kuò)增儀(C.1.1)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)目標(biāo)基因濃度。 按照試劑盒說明書進(jìn)行。C. 3.4參照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定目標(biāo)基因濃度。附錄D(規(guī)范性)分化潛能檢測(cè)畸胎瘤形成法D.1儀器和設(shè)備D. 1.1血球計(jì)數(shù)板。D. 1.2顯微鏡。D.1.3水平離心機(jī)。D. 1.4 電子天平。D. 1.5包埋機(jī)。D. 1.6切片機(jī)。D. 1.7展片機(jī)。D.1.8載玻片。D.1.9 蓋玻片。D.1.10 烘箱。D.1.11通風(fēng)櫥。D. 2試劑D.2.1本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。D.2.2磷酸鹽緩沖液。D.2.3消化酶。D.

18、2.44%臺(tái)盼藍(lán)染液。D.2.5 無水乙醇(C2H5OH)：分析純。D.2.6二甲苯(C8H1o)：分析純。D.2.7石蠟(熔點(diǎn)60 C)。D.2.84%多聚甲醛。D.2.9蘇木素染液。D.2.10 伊紅染液。D.2.11中性樹膠。D.3檢測(cè)步驟D.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備D.3.1.1細(xì)胞消化離心收集細(xì)胞于離心管中，用生理鹽水輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。D.3.1.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測(cè)定，計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。D.3.2 細(xì)胞移植用注射器將1X1O61X1O7個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射到6周齡8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，T/CSCB 00052021或肌肉，或睪丸白膜下的生精小管周隙，或腎被膜下等部位。D.3.3畸胎瘤收樣及處理D.3.3.1 收樣人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射約6周10周后（確?；チ霾怀^荷載小鼠體重的15%），對(duì)小鼠實(shí)施安 樂死。剝離受體小鼠上的畸胎瘤并進(jìn)行切割（體積不大于5 mmX5 mmX2 mm），將畸胎瘤組織塊用 4%多聚甲醛進(jìn)行4 C過夜固定。D.3.3.2 石蠟切片及HE染色對(duì)上述固定好的樣本進(jìn)行HE染色，鏡下觀察并拍照。D.4結(jié)果分析觀察到來源于3個(gè)胚層的組織，包括內(nèi)胚層