菌種鑒定工作是各類微生物學(xué)實驗室都經(jīng)常遇到的基礎(chǔ)性工作

1、 通常把鑒定微生物的技術(shù)分成四個不同水平：通常把鑒定微生物的技術(shù)分成四個不同水平：細胞的形態(tài)和習(xí)性水平，例如用經(jīng)典的研究方法，觀細胞的形態(tài)和習(xí)性水平，例如用經(jīng)典的研究方法，觀察細胞的形態(tài)特征、運動性、酶反應(yīng)、營養(yǎng)要求和生察細胞的形態(tài)特征、運動性、酶反應(yīng)、營養(yǎng)要求和生長條件等。長條件等。細胞組分水平，包括細胞組成成分例如細胞組分水平，包括細胞組成成分例如細胞壁成分，細胞氨基酸庫，脂類，醌類，光合色素細胞壁成分，細胞氨基酸庫，脂類，醌類，光合色素等的分析，所用的技術(shù)除常規(guī)實驗室技術(shù)外，還使用等的分析，所用的技術(shù)除常規(guī)實驗室技術(shù)外，還使用紅外光譜、氣相色譜和質(zhì)譜分析等新技術(shù)。紅外光譜、氣相色譜和質(zhì)譜

2、分析等新技術(shù)。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)水平，包括氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學(xué)反應(yīng)水平，包括氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學(xué)反應(yīng)等若干現(xiàn)代技術(shù)。等若干現(xiàn)代技術(shù)。基因或基因或dna水平，包括核酸分子水平，包括核酸分子雜交（雜交（dna與與dna或或dna與與rna），），gcmol%值值的測定，遺傳信息的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)，的測定，遺傳信息的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)，16s rrna（核糖（核糖體體rna）寡核苷酸組分分析，以及）寡核苷酸組分分析，以及dna或或rna的核的核苷酸順序分析等。苷酸順序分析等。 在微生物分類學(xué)發(fā)展的早期，主要的在微生物分類學(xué)發(fā)展的早期，主要的分類鑒定指標(biāo)尚停留在細胞的形態(tài)和習(xí)性分類鑒定指標(biāo)尚停留在

3、細胞的形態(tài)和習(xí)性水平上，這類方法可稱作經(jīng)典的分類鑒定水平上，這類方法可稱作經(jīng)典的分類鑒定方法；從本世紀(jì)方法；從本世紀(jì)60年代起，后三個水平年代起，后三個水平的分類鑒定的理論和技術(shù)即化學(xué)分類學(xué)開的分類鑒定的理論和技術(shù)即化學(xué)分類學(xué)開始發(fā)展，度為探索微生物的自然分類系統(tǒng)始發(fā)展，度為探索微生物的自然分類系統(tǒng)打下了堅實的基礎(chǔ)，這些方法再加上數(shù)值打下了堅實的基礎(chǔ)，這些方法再加上數(shù)值分類法，可稱為現(xiàn)代的分類鑒定方法。分類法，可稱為現(xiàn)代的分類鑒定方法。一、經(jīng)典分類鑒定方法一、經(jīng)典分類鑒定方法 所謂經(jīng)典的分類鑒定方法，是相對所謂經(jīng)典的分類鑒定方法，是相對于現(xiàn)代的分類鑒定方法而言的，通常于現(xiàn)代的分類鑒定方法而言的

4、，通常指長期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的指長期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的一些形態(tài)、生理、生化、生態(tài)、生活一些形態(tài)、生理、生化、生態(tài)、生活史和血清學(xué)反應(yīng)等指標(biāo)史和血清學(xué)反應(yīng)等指標(biāo). 群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等v 形態(tài)形態(tài) 個體：細胞形態(tài)，染色反應(yīng)，各種特殊構(gòu)造等個體：細胞形態(tài)，染色反應(yīng)，各種特殊構(gòu)造等v 營養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長因子等營養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長因子等v 生理、生化反應(yīng)生理、生化反應(yīng) 酶；產(chǎn)酶種類和反應(yīng)物性等酶；產(chǎn)酶種類和反應(yīng)物性等v 代謝產(chǎn)物：種類，產(chǎn)量，顯色反應(yīng)等代謝產(chǎn)物：種類，產(chǎn)量，顯色反應(yīng)

5、等v經(jīng)典指標(biāo)經(jīng)典指標(biāo) 生態(tài)特性：生長溫度，對氧的需要，宿主種類等生態(tài)特性：生長溫度，對氧的需要，宿主種類等v 生活史特點生活史特點v 血清學(xué)反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng)v 噬菌體的敏感性噬菌體的敏感性v 其它其它 經(jīng)典分類法 經(jīng)典分類法是一百多年來進行微生物分類的傳統(tǒng)方法。其特點是人為地選擇幾種形態(tài)生理生化特征進行分類，并在分類中將表型特征分為主、次。一般在科以上分類單位以形態(tài)特征、科以下分類單位以形態(tài)結(jié)合生理生化特征加以區(qū)分。 va. 能在 60 o c 以上生長 vb. 細胞大，寬度 1.31.8mm 1. 熱微菌屬 ( thermomicrobium ) vb. 細胞小，寬度 0.40.8mm vc.

6、 能以葡萄糖為碳源生長 vd. 能在 ph4.5 生長 2. 熱酸菌屬 ( acidothermus ) vdd. 不能在 ph4.5 生長 3. 棲熱菌屬 ( thermus ) vcc. 不能以葡萄糖為唯一碳源 4. 棲熱嗜油菌屬 ( 棲熱嗜獅菌屬 thermoleophilum ) vaa. 不能在 60 o c 以上生長 1. dna的堿基組成的堿基組成(g+cmol%)v每一個微生物種的 dna 中 gc mol% 的數(shù)值是恒定的，不會隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等的變化而變化，而且在同一個屬不同種之間， dna 中 gcmol% 的數(shù)值不會差異太大，可以某個數(shù)值為中心成簇分布，顯示同屬微

7、生物種的 gc mol% 范圍。 dna 中 gc mol% 分析主要用于區(qū)分細菌的屬和種，因為細菌 dna 中 gc 含量的變化范圍一般在 25 75 ；而放線菌 dna 中的 gc 比例范圍非常窄 (37 51%) 。一般認為任何兩種微生物在 gc 含量上的差別超過了 10 ，這兩種微生物就肯定不是同一個種。因此可利用 g+c mol 來鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠近程度。值得注意的是，親緣關(guān)系相近的菌，其 g+c mol 含量相同或者近似，但 g+c mol 相同或近似的細菌，其親緣關(guān)系并不一定相似，這是因為這一數(shù)據(jù)還不能反映出堿基對的排列序列，而且如放線菌的 dna 的 gc

8、mol% 在 37 51 之間，企圖在這么小的范圍內(nèi)區(qū)分放線菌的幾十個屬顯然是不現(xiàn)實的。要比較兩種細菌的 dna 堿基對排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗。 1. dna的堿基組成的堿基組成(g+cmol%)v1）每個生物種都有特定的）每個生物種都有特定的gc%范圍，因此后者可以作為分范圍，因此后者可以作為分類鑒定的指標(biāo)。細菌的類鑒定的指標(biāo)。細菌的gc%范圍為范圍為25-75%，變化范圍最大，變化范圍最大，因此更適合于細菌的分類鑒定。因此更適合于細菌的分類鑒定。v2）gc%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌作出鑒定，測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌作出鑒定，并可檢驗表型

9、特征分類的合理性，從分子水平上判斷物種的并可檢驗表型特征分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。親緣關(guān)系。v3）使用原則：）使用原則：vg+c含量的比較主要用于分類鑒定中的否定每一種生物都有含量的比較主要用于分類鑒定中的否定每一種生物都有一定的堿基組成，親緣關(guān)系近的生物，它們應(yīng)該具有相似的一定的堿基組成，親緣關(guān)系近的生物，它們應(yīng)該具有相似的g+c含量，若不同生物之間含量，若不同生物之間g+c含量差別大表明它們關(guān)系遠。含量差別大表明它們關(guān)系遠。但具有相似但具有相似g+c含量的生物并不一定表明它們之間具有近的含量的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系。親緣關(guān)系。1. dna的堿基組成的堿

10、基組成(g+cmol%)v同一個種內(nèi)的不同菌株同一個種內(nèi)的不同菌株g+c含量差別應(yīng)在含量差別應(yīng)在45%以下；同屬以下；同屬不同種的差別應(yīng)低于不同種的差別應(yīng)低于1015%。所以。所以g+c含量已經(jīng)作為建立含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項基本特征，它對于種、屬甚至科新的微生物分類單元的一項基本特征，它對于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。的分類鑒定有重要意義。v若二個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其若二個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其g+c含量的差別大于含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，大于，則肯定不是同一個種，大于15%則肯定不是同一個屬。則肯定不是同

11、一個屬。v在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，g+c含量是一項重要的，必不可少的鑒定指標(biāo)。其分類學(xué)意含量是一項重要的，必不可少的鑒定指標(biāo)。其分類學(xué)意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些g+c含量差別大的種類排除出某一分類單元。含量差別大的種類排除出某一分類單元。2.核酸的堿基組成和分子雜交：核酸的堿基組成和分子雜交：v與形態(tài)及生理生化特性的比較不同，對與形態(tài)及生理生化特性的比較不同，對dna的堿基組成的比較和進行核酸分子雜交是直的堿基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較

12、不同微生物之間基因組的差異，因此接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結(jié)果更加可信。結(jié)果更加可信。dna-dna 雜交雜交 vdna 雜交法的基本原理是用 dna 解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的 dna 在體外加熱解鏈，并在合適的條件下，使互補的堿基重新配對結(jié)合成雙鏈 dna ，然后根據(jù)能生成雙鏈的情況，檢測雜合百分數(shù)。如果兩條單鏈 dna 的堿基順序全部相同，則它們能生成完整的雙鏈，即雜合率為 100% 。如果兩條單鏈 dna 的堿基序列只有部分相同，則它們能生成的“雙鏈”僅含有局部單鏈，其雜合率小于 100% 。由此；雜合率越高，表示兩個 dna 之間堿基序列的相似性越高，它

13、們之間的親緣關(guān)系也就越近。如兩株大腸埃希氏菌的 dna 雜合率可高達 100 ，而大腸埃希氏菌與沙門氏菌的 dna 雜合率較低，約有 70 。 g+cmol 的測定和 dna 雜交實驗為細菌種和屬的分類研究開辟了新的途徑，解決了以表觀特征為依據(jù)所無法解決的一些疑難問題，但對于許多屬以上分類單元間的親緣關(guān)系及細菌的進化問題仍不能解決。 dna rrna 雜交雜交 v目前研究 rna 堿基序列的方法有兩種。一是 dna 與 rrna 雜交，二是 16s rrna 寡核苷酸的序列分析。 dna 與 rrna 雜交的基本原理、實驗方法同 dna 雜交一樣，不同的是 是 dna 雜交中同位素標(biāo)記的部分是

14、 dna ，而 dna 與 rrna 雜交中同位素標(biāo)記的部分是 rrna 。 dna 雜交結(jié)果用同源性百分數(shù)表示，而 dna 與 rrna 雜交結(jié)果用 tm(e) 和 rna 結(jié)合數(shù)表示。 tm(e) 值是 dna 與 rrna 雜交物解鏈一半時所需要的溫度。 rna 結(jié)合數(shù)是 100 m gdna 所結(jié)合的 rrna 的 m g 數(shù)。根據(jù)這個參數(shù)可以作出 rna 相似性圖。在 rrna 相似性圖上，關(guān)系較近的菌就集中到一起。關(guān)系較遠的菌在圖上占據(jù)不同的位置。用 rrna 同性試驗和 16srrna 寡核苷酸編目的相似性比較 rrna 順反子的實驗數(shù)據(jù)可得到屬以上細菌分類單元的較一致的系統(tǒng)發(fā)育

15、概念，并導(dǎo)致了古細菌的建立。 3.建立建立16 s r rna系統(tǒng)發(fā)育樹系統(tǒng)發(fā)育樹va）使生物進化的研究范圍真正覆蓋所有生物類群；）使生物進化的研究范圍真正覆蓋所有生物類群；v傳統(tǒng)的生物進化研究，主要基于復(fù)雜的形態(tài)學(xué)和化石記載，因此多限于傳統(tǒng)的生物進化研究，主要基于復(fù)雜的形態(tài)學(xué)和化石記載，因此多限于研究后生生物（研究后生生物（metazoa），而后者僅占整個生物進化歷程的），而后者僅占整個生物進化歷程的1/5vb）提出了一種全新的正確衡量生物間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的方法；）提出了一種全新的正確衡量生物間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的方法；vc）對探索生命起源及原始生命的發(fā)育進程提供了線索和理論依據(jù)；）對探索生命起源及

16、原始生命的發(fā)育進程提供了線索和理論依據(jù)；vd）突破了細菌分類僅靠形態(tài)學(xué)和生理生化特性的限制，建立了全新的）突破了細菌分類僅靠形態(tài)學(xué)和生理生化特性的限制，建立了全新的微生物分類、鑒定理論；微生物分類、鑒定理論；ve）為微生物生物多樣性和微生物生態(tài)學(xué)研究建立了全新的研究理論和）為微生物生物多樣性和微生物生態(tài)學(xué)研究建立了全新的研究理論和研究方法，特別是不經(jīng)培養(yǎng)直接對生態(tài)環(huán)境中的微生物進行研究。研究方法，特別是不經(jīng)培養(yǎng)直接對生態(tài)環(huán)境中的微生物進行研究。3、 16s rrna(16s rdna) 寡核苷酸寡核苷酸的序列分析的序列分析 v首先， 16s rrna 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是

17、 18s rrna ）中。 rrna 參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時間鐘。其次，在 16s rrna 分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。第三， 16s rrna 的相對分子量大小適中，約 1 540 個核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作為測量各類生物進化和親緣關(guān)系的良好工具。 分離菌株 16s rrna 基因v。從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細胞 , 加入 100l 無菌重蒸 h 2 o 中 , 旋渦混勻后 , 沸水浴 2min,

18、 12 000r min -1 離心 5min, 上清液中即含 16s rrna 基因，可直接用于 pcr 擴增。分離菌株 16s rrna 基因的 pcr 擴增和序列測定的一般步驟為： 16s rrna 基因的 pcr 引物： 5-agagt ttgat cctgg ctcag-3 ； 5-aagga ggtga tccag ccgca-3 。擴增反應(yīng)體積 50 m l ，反應(yīng)條件為 95 預(yù)變性 5min ， 94 變性 1min ， 55 退火 1min ， 72 延伸 2min ，共進行 29 個循環(huán)， pcr 反應(yīng)在 ptc-200 型熱循環(huán)儀上進行。取 5 m l 反應(yīng)液在 10g

19、 l -1 的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。 pcr 產(chǎn)物測序可由專門技術(shù)公司完成。 比對分析v測序得到 分離菌株 16s rdna 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用寫字板或 editsequence 軟件打開，將所得序列通過 blast 程序與 genbank 中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析 ( /blast ) ，具體步驟如下：點擊網(wǎng)站中 nucleotide blast 下 nucleotide-nucleotide blast blastn 選項，將測序所得序列粘貼在“ search ”網(wǎng)頁空白處，或輸入測序結(jié)果所在文件夾

20、目錄，點擊核酸比對選項，即“ blast ”，然后點擊“ format ”，計算機自動開始搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫中序列并進行序列比較，根據(jù)同源性高低列出相近序列及其所屬種或?qū)?，以及菌株相關(guān)信息，從而初步判斷 16s rdna 鑒定結(jié)果。 比對分析v遺傳距離矩陣與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，可采用 dnastar 軟件包中的 megalign 程序計算樣本間的遺傳距離。由 genbank 中得到相關(guān)菌株的序列，與本研究分離菌株所測得序列一起輸入 clustalx1.8 程序進行 dna 同源序列排列，并經(jīng)人工仔細核查。在此基礎(chǔ)上，序列輸入 phylip3.6 軟件包，以簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用 kimura 2

21、-parameter 法，系統(tǒng)樹各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法（ bootstrap ） 500 次重復(fù)檢測， dna 序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦于相同的加權(quán)值。（二）細胞化學(xué)成分的鑒定（二）細胞化學(xué)成分的鑒定v除上述核酸成分外的其它化學(xué)成分的測除上述核酸成分外的其它化學(xué)成分的測定，是微生物化學(xué)分類法的重要內(nèi)容，定，是微生物化學(xué)分類法的重要內(nèi)容，主要包括：主要包括：1.細胞壁的化學(xué)成分。細胞壁的化學(xué)成分。2.全細全細胞水解液的糖型。胞水解液的糖型。3.磷酸類脂成分的分磷酸類脂成分的分析。析。4.枝菌酸的分析。枝菌酸的分析。5. 醌類的分析。醌類的分析。6.氣相色譜技術(shù)的應(yīng)用。氣相色譜技術(shù)的應(yīng)用。（二）

22、細胞化學(xué)成分的鑒定（二）細胞化學(xué)成分的鑒定v微生物分類中，根據(jù)微生物細胞的特征性化學(xué)組分對微生物進行分類的方法稱化學(xué)分類法 (chemotaxonomy) 。在近二十多年中，采用化學(xué)和物理技術(shù)采研究細菌細胞的化學(xué)組成，已獲得很有價值的分類和鑒定資料，各種化學(xué)組分在原核微生物分類中的意義見表 細菌的化學(xué)組分分析及其在分類水平上的應(yīng)用 細胞成份 分析內(nèi)容 在分類水平上的作用 細胞壁 肽聚糖結(jié)構(gòu) 種和屬 多糖 胞壁酸 膜 脂肪酸 種和屬 極性類脂 霉菌酸 類異戊二烯苯醌 蛋白質(zhì) 氨基酸序列分析 屬和屬以上單位 血清學(xué)比較 電泳圖 酶譜 代謝產(chǎn)物 脂肪酸 種和屬 全細胞成分分析 熱解氣液色譜分析 種和

23、亞種 熱解 質(zhì)譜分析 細胞化學(xué)成分鑒定的意義細胞化學(xué)成分鑒定的意義v隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細胞化學(xué)組分分析用于微生物分類日趨顯示出重要性。細胞壁的氨基酸種類和數(shù)量現(xiàn)己被接受為細菌屬的水平的重要分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。在放線菌分類中，細胞壁成分和細胞特征性糖的分析作為分屬的依據(jù)，已被廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)是區(qū)別細菌還是古菌的標(biāo)準(zhǔn)之一，細菌具有?；?( 脂鍵 ) ，而古菌具有醚鍵脂，因此醚鍵脂的存在可用以區(qū)分古菌。霉菌酸的分析測定己成為諾卡氏菌形放線菌分類鑒定中的常規(guī)方法之一。鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇桿菌等細胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有無可作為此類細菌的一個重要標(biāo)志。此外某些細菌原生質(zhì)膜中的異戊間二烯醌，細胞色素，以及紅外光譜等分析對于細菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價值。 （三）數(shù)值分類法（三）數(shù)值分類法v數(shù)值分類法亦稱統(tǒng)計分類法，是在約數(shù)值分類法亦稱統(tǒng)計分類法，是在約200年年前與林奈同代人前與林奈同代人m.adanson (1727 1806，法國植物學(xué)家法國植物學(xué)家)發(fā)展的分類原理基礎(chǔ)上借助于發(fā)展的分類原理基礎(chǔ)上借助于現(xiàn)代的電子計算機技術(shù)而發(fā)展起來的。數(shù)值現(xiàn)代的電子計算機技術(shù)而發(fā)展起來的。數(shù)值分類的基本步驟為：（分類的基本步驟為：（1）計算兩菌株間的相）計算兩菌株間的相似系數(shù)；（似系數(shù)；（2）列出相似度矩陣；（）列出相似度矩陣；（3）將矩）將矩陣圖轉(zhuǎn)換成樹