畢業(yè)論文終稿

1、2012屆本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）放線菌的分類方法姓 名: _ _商玉龍_系 別:_ 生命科學(xué)學(xué)院_專 業(yè)：_ 生物工程_學(xué) 號(hào)：_ 080913021_ _指導(dǎo)教師：_ 宋兆齊_ _2012年5 月9日目 錄摘要11 放線菌的分類研究意義與方法21.1放線菌22放線菌的分類方法的發(fā)展歷程與意義32.1形態(tài)學(xué)與培養(yǎng)特征上的分類與鑒定32.2數(shù)值分類方法32.3化學(xué)分類33 放線菌的分子生物學(xué)分類的發(fā)展情況43.1.dna堿基組成分析：43.2.dna-dna同源性分析：43.3.dna-rrna同源性分析：53.4.核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析：53.5.16s rrna基因序列分析：53.7.pcr-r

2、flp分析：53.8.rep-pcr指紋分析技術(shù)：63.9.rapd分析：63.10.aflp指紋分析技術(shù)：64放線菌的分類在未來(lái)發(fā)展的方向及意義6參考文獻(xiàn)7致謝8放線菌的分類方法商玉龍 指導(dǎo)教師：宋兆齊(商丘師范學(xué)院生命科學(xué)系，河南 商丘 476000)摘 要：放線菌是原核生物的一個(gè)類群，相關(guān)分類學(xué)經(jīng)歷了早期的形態(tài)學(xué)上的經(jīng)典分類（主要從其形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行分類），數(shù)值分類（運(yùn)用計(jì)算科學(xué)與技術(shù)對(duì)放線菌進(jìn)行描述分類），化學(xué)分類（運(yùn)用化學(xué)分析的方法對(duì)放線菌的細(xì)胞壁和組成成分進(jìn)行分析歸類），直至今天的分子分類。通過(guò)對(duì)放線菌的分類進(jìn)而建成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，更加方便了放線菌的研究與應(yīng)用。由于科學(xué)進(jìn)步的發(fā)展放線菌在

3、分子分類中又有了不同的研究方法，由（g+c）mol%的差別而分析的物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近形成的dna堿基組成分析發(fā)展到在dna雜交中的dna序列互補(bǔ)程度來(lái)推斷它們的的dna-dna同源性分析，從核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)上的分析到rna的二級(jí)結(jié)構(gòu)上的分析等方法。由于pcr技術(shù)的發(fā)展限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和對(duì)dna片段上的基因分析技術(shù)使放線菌的分類更加簡(jiǎn)易與精確，從而發(fā)展出了rep-pcr指紋分析技術(shù)，隨機(jī)擴(kuò)增的多行性dna分析，擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析等方法。每種方法都有著不同的優(yōu)缺點(diǎn)，科技也在不停地進(jìn)步所以放線菌的分類方法的研究還在繼續(xù)的發(fā)展中。關(guān)鍵詞：放線菌;分類方法;原核生物;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)class

4、ification of actinomycetes on the molecular levelshang yulong supervisor: song zhaoqi(department of life science, shangqiu normal university, shangqiu 476000, china)abstract: actinomycetes is a group of prokaryotes, related taxonomy experienced the earlier classic classification of taxonomic morphol

5、ogy(mainly from its shape and structure to classify), numerical classification (using the computer science and technology to describe the classification), chemical classification (using chemical analysis method to cell wall and components were analyzed classified), until todays molecular taxonomy th

6、rough to the classification of the system were built and evolutionary tree, more convenient actinomyces due to the scientific research and application of the development of the progress in molecular classification and were a different research methods, from (g + c) mol % difference and analysis of t

7、he species of genetic relationship of the formation of the near and far dna base composition analysis to the dna sequence in dna hybrid complementary degree to infer the their dna-dna,from the primary structure of nucleic acids on the analysis to the secondary structure of rna analysis method of pcr

8、 because development restriction enzymes cut fragment length polymorphism analysis of dna fragments and the gene analysis technology makes the classification more simple and were accurate, which developed the rep-pcr fingerprint analysis technology, and the random amplified line sexual dna analysis,

9、 amplification sex fragment length polymorphism analysis methods .each method has its different advantages and disadvantages, and science and technology are constantly progressing so the research of actinomyces classification method is developing constantly.key words: actinomycetes; sorting techniqu

10、e; prokaryotes; phylogenetic tree 隨著科技的發(fā)展放線菌分類學(xué)已從形態(tài)學(xué)與生化層面發(fā)展到了分子水平，在人們的研究中起著重要的作用。分子生物學(xué)的分類在現(xiàn)今正在蓬勃的發(fā)展，由于科技的發(fā)展、生物技術(shù)的日趨完善，對(duì)放線菌的分類研究方法更加的成熟，分類方法的研究也趨于不同。1 放線菌的分類研究意義與方法1.1放線菌放線菌（actinomycete）是原核生物的一個(gè)類群。大多數(shù)有發(fā)達(dá)的分枝菌絲。菌絲纖細(xì)，寬度近于桿狀細(xì)菌。可分為：營(yíng)養(yǎng)菌絲，又稱基質(zhì)菌絲，主要功能是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有的可產(chǎn)生不同的色素，是菌種鑒定的重要依據(jù)；氣生菌絲，疊生于營(yíng)養(yǎng)菌絲上，又稱二級(jí)菌絲。自從waks

11、man和vmezwa揭示放線菌用途的多樣性以后，人們對(duì)放線菌的用途給予了更多的關(guān)注，在越來(lái)越多的科技人員的研究攻關(guān)下越來(lái)越多的放線菌被人們所發(fā)現(xiàn)。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約70%是各種放線菌所產(chǎn)生1-3。一些種類的放線菌還能產(chǎn)生各種酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、和纖維素酶等）、維生素（b12）和有機(jī)酸等。弗蘭克菌屬（frankia）為非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的內(nèi)共生菌。此外，放線菌還可用于甾體轉(zhuǎn)化、烴類發(fā)酵、石油脫蠟和污水處理等方面。少數(shù)放線菌也會(huì)對(duì)人類構(gòu)成危害，引起人和動(dòng)植物病害。因此，放線菌與人類關(guān)系密切，通過(guò)研究把放線菌合理的運(yùn)用于人類科學(xué)的發(fā)展，對(duì)人們

12、的健康生活改善疾病治療特別是對(duì)腫瘤的抑制的研究現(xiàn)在有了新的發(fā)展，在農(nóng)業(yè)上對(duì)農(nóng)作物的病蟲害的治療也有著不可替代的作用。并且有些放線菌代謝產(chǎn)物可以用于發(fā)酵、食品等很多行業(yè)，所以放線菌的研究對(duì)人們來(lái)說(shuō)是有著重大意義的，其中放線菌的分類鑒定對(duì)放線菌研究與運(yùn)用上有著很大的意義。早期的研究方法以依形態(tài)為主，根據(jù)其形態(tài)和形狀的不同進(jìn)行分類隨后隨著科學(xué)的發(fā)展化學(xué)的分類方法走進(jìn)人們的視線。在80年代stackebrandt與woese4構(gòu)建了放線菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)開(kāi)始，使放線菌的分類學(xué)進(jìn)入分子分類時(shí)代。現(xiàn)如今分子分類隨著科技的發(fā)展開(kāi)始了多相分類系統(tǒng)。隨著科技的發(fā)展放線菌基于形態(tài)學(xué)與生化方面的分類已經(jīng)不能滿足于人們對(duì)

13、科研的需求。人們需要更加精確的分類研究方式，而分子生物學(xué)的分類方式更能滿足需求，在人們的研究中起著重要的作用。分子生物學(xué)的分類在現(xiàn)今正在蓬勃的發(fā)展。在國(guó)內(nèi)外的放線菌研究中，不斷發(fā)現(xiàn)新的種類，所以放線菌的分子分類也在不斷的研究中，另外我國(guó)在微生物的研究中還有許多不足，在分類上還沒(méi)有在國(guó)際上提出相應(yīng)的新理論，由于放線菌的種類是未知的所以相應(yīng)的分類方法也需要進(jìn)行總結(jié)創(chuàng)新。2放線菌的分類方法的發(fā)展歷程與意義從cohn發(fā)現(xiàn)放線菌至今已有100多年了，harz最早的描述了放線菌但首次稱為放線菌卻在waksman等在1916年提出的，最后又在1961年waksman5發(fā)表了放線菌的屬和分類鑒定和描述這本書才

14、標(biāo)志著放線菌的分類學(xué)的形成。傳統(tǒng)分類也稱描述分類，主要以形態(tài)與培養(yǎng)特征及理化特征等為指征，對(duì)微生物分類單位進(jìn)行的描述分類：2.1形態(tài)學(xué)與培養(yǎng)特征上的分類與鑒定主要有基內(nèi)菌絲的顏色與形狀是否斷裂形成橫隔和是否產(chǎn)生色素等。氣生菌絲的顏色和孢子絲的鏈的形狀位置顏色和長(zhǎng)短。產(chǎn)生的孢子方式以及孢子的形狀數(shù)目大小結(jié)構(gòu)特征等也為其經(jīng)典分類的指標(biāo)。2.2數(shù)值分類方法數(shù)值方法6的分類是在二十世紀(jì)中期應(yīng)用計(jì)算數(shù)學(xué)的原理來(lái)進(jìn)行對(duì)微生物的分類的，它是集體性的分類，分類后可以用于菌種的鑒定，該方法可以對(duì)眾多菌株進(jìn)行大型表行數(shù)據(jù)的比較分析，可以運(yùn)用計(jì)算機(jī)和數(shù)學(xué)方法進(jìn)行處理，而使結(jié)果在分類學(xué)和分類單元的建立上都是客觀明確的

15、可重復(fù)的，其不足是性狀比較多費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定差異無(wú)法進(jìn)行交流比較，但是由于其能提供具體的表型性狀鑒定特征，所以在放線菌的分類上有著廣泛的應(yīng)用。2.3化學(xué)分類化學(xué)分類是利用化學(xué)方法對(duì)放線菌的化學(xué)成分以及部分組成等進(jìn)行分析進(jìn)而形成分類。化學(xué)分類是在1956年被cummins和harris7最早指出的，直到1971年lechevalier8夫婦發(fā)表了主要依據(jù)化學(xué)指標(biāo)的分類系統(tǒng)使放線菌的分類進(jìn)入化學(xué)分類階段并被廣大學(xué)者認(rèn)可?；瘜W(xué)分類主要依據(jù)細(xì)胞壁和全細(xì)胞的化學(xué)分析：細(xì)胞壁的組成成份：主要由中性多糖、肽聚糖和磷壁酸交聯(lián)形成枝菌酸分類：枝菌酸的存在與否和分子特性是諾卡氏菌類放線菌的分類不

16、可少的指標(biāo)根據(jù)碳原子數(shù)分為四類約含三十個(gè)的棒狀桿菌；約四十個(gè)的紅球菌枝菌酸；約六十個(gè)的諾卡氏枝菌酸；約八十個(gè)的分枝桿菌酸。磷酸類脂分類：磷酸類脂是組成細(xì)胞膜的成分，屬于極性脂，具有分類學(xué)意義的磷酸類脂有四種分別為磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甲基乙醇胺具有很重要的鑒別依據(jù)。醌分類：醌在細(xì)菌的細(xì)胞膜上有泛醌和甲基萘醌。在革蘭氏陽(yáng)性的放線菌中只含有甲基萘醌，甲基萘醌的多烯側(cè)鏈的長(zhǎng)度和3位碳原子上多烯側(cè)鏈的氫飽和度用于放線菌的分類鑒定具有很大的作用，分析醌的方法主要有高壓液相色譜法和薄板層析法等。全細(xì)胞蛋白sds-page分析：sds-page是通過(guò)分析蛋白圖譜在高度標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)下來(lái)進(jìn)

17、行分群和比較大量的相近菌株的方法。此外還有核糖體蛋白雙向凝膠電泳分析和脂肪酸分類法等。為放線菌的分類提供了重要條件。3 放線菌的分子生物學(xué)分類的發(fā)展情況現(xiàn)今分類學(xué)隨著科學(xué)的進(jìn)步發(fā)展和分子生物學(xué)、細(xì)胞工程、基因工程遺傳學(xué)等相結(jié)合并根據(jù)現(xiàn)在的生物信息學(xué)使放線菌的分類進(jìn)入了新的一頁(yè)即放線菌的分子生物學(xué)分類。放線菌的生物學(xué)分子分類的標(biāo)志是1981年的stackebrandt9和woese10根據(jù)16s rrna的相似性、dna-rrna和dna-dna雜交的結(jié)果描繪了放線菌和其他生物之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。隨著生物學(xué)的發(fā)展放線菌在分子生物學(xué)中的分類起著越來(lái)越重要的作用。3.1.dna堿基組成分析：由于每一種

18、生物的dna中含有特定的（g+c）mol%，（g+c）mol%的差別與生物之間的物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近有很大的聯(lián)系差別愈小親緣關(guān)系愈近，而且（g+c）mol%不受環(huán)境與年齡的限制，現(xiàn)在許多微生物的（g+c）mol%已經(jīng)被測(cè)定原核生物分為高（g+c）mol%群和低（g+c）mol%群。由于放線菌的種類太多而放線菌的（g+c）mol%變化量的范圍較為狹窄所以以（g+c）mol%為精確地分類方法是不可能的，它只可以作為分析不確定的分類單元但是（g+c）mol%作為分類指標(biāo)中有著非常重要的作用。放線菌的（g+c）mol%測(cè)定所用的方法主要為熱變性法、高效液相層析法和浮力密度法11等。3.2.dna-dna

19、同源性分析：生物的遺傳物質(zhì)是dna或rna，dna攜帶有大量的信息，但是對(duì)大量的dna進(jìn)行全序列分析要求非常高但現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)現(xiàn)我們也可以從dna在dna雜交中的dna序列互補(bǔ)程度來(lái)推斷它們的同源性。從二十世紀(jì)六十年代doty等建立測(cè)定核苷酸序列的相似性技術(shù)，隨后的schildkraut最先用雜交法測(cè)定了不同細(xì)菌dna間堿基序列的相似性，后成為了微生物分類鑒定的一種重要的方法成為了新建菌種的重要依據(jù)。dna雜交的原理為雙鏈dna經(jīng)過(guò)熱變性形成單鏈dna然后經(jīng)過(guò)低溫(低于tm25)，處理互補(bǔ)的dna就會(huì)復(fù)性成為雙鏈的dna而非互補(bǔ)的鏈仍舊為單鏈，而不是所有的單鏈dna能全部互補(bǔ)成為雙鏈。進(jìn)行dna-

20、dna雜交的方法主要有液相雜交（液相復(fù)性速率雜交12、s1核酸酶法等）和固相雜交13(光敏生物素標(biāo)記法、地高辛標(biāo)記法等)。3.3.dna-rrna同源性分析：由于rrna存在于原核的生物細(xì)胞，其中作為蛋白質(zhì)的合成場(chǎng)所功能穩(wěn)定并且由于rrna有高度的保守區(qū)和可變區(qū)組成分子序列隨著進(jìn)化變化緩慢。這表明rrna在分類上比dna-dna同源性分析具有一定的優(yōu)勢(shì)。dna-dna雜交是在種與亞種之間的區(qū)別分類鑒定而dna-rrna可以反映出屬與屬以上的分類信息。3.4.核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析：在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，由于16s rrna具有保守性在進(jìn)化中不容易變化，并且它的長(zhǎng)度約為1540bp，結(jié)構(gòu)長(zhǎng)短適中易于

21、檢測(cè)和分析所以成為了鑒定放線菌屬種的分子基礎(chǔ)。16-23s的進(jìn)化速率比16s大10倍，雖然其序列容易被檢測(cè)14但是由于其不同拷貝連中的大小不易區(qū)分所以需要采取方法進(jìn)行鑒別。3.5.16s rrna基因序列分析：16s rrna是生物合成蛋白質(zhì)的關(guān)鍵裝置是最古老的分子之一，因其分子大小約1.5kb便于擴(kuò)增和測(cè)序也保留了大量的信息，所以16s rrna目前被認(rèn)定為研究分子遺傳學(xué)與細(xì)菌之間親緣關(guān)系的最好材料。16s rrna的基因序列分為恒定區(qū)和可變區(qū)，其中的恒定區(qū)序列基本保守結(jié)合pcr技術(shù)可將16s rrna序列擴(kuò)增出來(lái)再利用可變區(qū)序列的差異對(duì)放線菌進(jìn)行分類鑒定。具體的步驟是先提取dna，利用16

22、s rrna通用引物pcr擴(kuò)增出16s rrna，取出一半進(jìn)行跑膠測(cè)試純度與大小一般1500bp為目的基因然后把將目的基因連接到t載體上,應(yīng)該注意記得所用t載體的分子量大小，一般3000bp左右。連接后將整個(gè)連接體導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞，養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞16或18小時(shí)，提取其質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒拿出一部分跑膠。酶切所提取的質(zhì)粒，以得到目的基因。然后開(kāi)始凝膠電泳得到16s rrna進(jìn)行序列分析對(duì)比建立系統(tǒng)樹(shù)對(duì)比其同源性進(jìn)行分析3.6.rna的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析:rna的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型比一級(jí)結(jié)構(gòu)更具有保守性和分類特征，所以現(xiàn)今16s rrna的二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被用于放線菌的分類學(xué)中，進(jìn)行屬種甚至更高級(jí)別的分類研究

23、15-17但由于科技的發(fā)展還沒(méi)有成熟rna的二級(jí)結(jié)構(gòu)還沒(méi)有被研究清楚所以還沒(méi)有被研究人員普遍認(rèn)可。3.7.pcr-rflp分析：rflp即限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。由于在生物進(jìn)化中限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，使同種生物的不同個(gè)體的dna分子的酶切產(chǎn)生不同的酶切片段在電泳時(shí)呈現(xiàn)不同的條帶，一般適用于2-3種菌的比較，但由于限制性內(nèi)切核酸酶的消化作用，使條帶在背景下難以辨清，隨著科技的發(fā)展把relp技術(shù)與pcr技術(shù)結(jié)合起來(lái)對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行rflp分析后，可彌補(bǔ)單純的rflp分析時(shí)的結(jié)果不清楚的缺陷。3.8.rep-pcr指紋分析技術(shù)：rep-pcr指紋分析技術(shù)又稱重復(fù)片段pcr基因指紋

24、分析技術(shù)，它是根據(jù)放線菌的染色體上的高度保守重復(fù)的基因片段的互補(bǔ)引物，然后進(jìn)行pcr電泳分析后對(duì)放線菌進(jìn)行種以下的分類，這種方法在鑒定時(shí)方便快捷所以用于放線菌的有關(guān)屬的分類上有恨重要的意義18。3.9.rapd分析：rapd分析即隨機(jī)擴(kuò)增的多行性dna分析，是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物（用單個(gè)隨機(jī)掛核苷酸序列引物對(duì)dna進(jìn)行擴(kuò)增）長(zhǎng)度的多態(tài)性分析的方法該法，可用于對(duì)種以下水平的分類研究。具有簡(jiǎn)單方便可直接有rapd所提供的基因組進(jìn)行分析但條件嚴(yán)格,任何一個(gè)堿基的改變都可能導(dǎo)致圖譜變化19。3.10.aflp指紋分析技術(shù)：aflp是指擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，采用一對(duì)限制性內(nèi)切酶消化dna并以產(chǎn)物為模板添加選擇

25、性引物得到上述圖譜20這種技術(shù)已經(jīng)被證明在病原菌的鑒定分類上有作用21。這種方法適用范圍廣分辨率和穩(wěn)定率都非常高，但操作復(fù)雜由于基因組上酶切位點(diǎn)的變化，使其在相關(guān)領(lǐng)域上的應(yīng)用不是十分廣泛。4放線菌的分類在未來(lái)發(fā)展的方向及意義放線菌自發(fā)現(xiàn)已來(lái)在人們的生活中起著越來(lái)越重要的作用，特別是抗生素的生產(chǎn)上，但是由于科技的發(fā)展人們研究放線菌的時(shí)間不是很長(zhǎng)，對(duì)于其分類研究上由經(jīng)典分類，數(shù)值分類直到現(xiàn)今的分子分類研究才經(jīng)過(guò)一百多年的時(shí)間，但人們對(duì)其的研究非常努力隨著科技的發(fā)展，放線菌的分類隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高而提高，在國(guó)際上大量的菌種保藏中心被建立最出色的是德國(guó)的國(guó)家菌種保藏中心(dsmz)，中國(guó)也建有云南

26、大學(xué)微生物研究所放線菌實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)科學(xué)院微生物研究實(shí)驗(yàn)室。但是科技在發(fā)展越來(lái)越多的放線菌的新種被發(fā)現(xiàn)新的分類單位也在變化而舊的分類系統(tǒng)由于不精確需要改進(jìn)更新。隨著pcr技術(shù)、電泳技術(shù)、圖譜分析技術(shù)、dna探針技術(shù)、分離技術(shù)等的發(fā)展。放線菌的分類學(xué)可以與它們相結(jié)合探索出新的分類技術(shù)方法。隨著科研的不斷深，大規(guī)模的測(cè)序技術(shù)的發(fā)展入放線菌的分類從多相分類學(xué)發(fā)展到了基因組系統(tǒng)學(xué)。而genomic encyclopedia of bacteria and archaea（geba）計(jì)劃的出現(xiàn)標(biāo)志著分類學(xué)跨入了基因組學(xué)研究時(shí)代?；蚪M學(xué)的研究是選取具有特殊系統(tǒng)發(fā)育地位的放線菌進(jìn)行全基因組測(cè)序而分析方法有序

27、列分析和全基因組特性分析法。全基因組特性的分析法在放線菌中的應(yīng)用主要有基因順序、基因內(nèi)容和核酸短串來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)?；蚪M系統(tǒng)發(fā)育學(xué)是分類學(xué)在基因時(shí)代與基因組學(xué)的完好組合借助這種方法使人們對(duì)放線菌的分類和各個(gè)單元之間的進(jìn)化關(guān)系更加明確，屬內(nèi)分枝關(guān)系更加精確。全基因組序列學(xué)的研究在未來(lái)放線菌分類的研究中如同人類的基因組計(jì)劃有著很重要的意義。參考文獻(xiàn)1錢存柔,黃儀秀,林稚蘭,等.微生物的分離與純化技術(shù)m.北京:北京大學(xué)出版社,1999.68-69.2徐成勇,袁野.選擇性分離放線菌j.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào):食品與生物技術(shù),1999,18(2):45-49.3安德榮,史遂校,等.土壤放線菌分離中抑制劑的應(yīng)

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