發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸關(guān)鍵技術(shù)研究

1、 科技成果鑒定材料發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸關(guān)鍵技術(shù)研究技術(shù)資料匯編 湖北世力達(dá)生物科技有限公司二00九年五月28 鑒 定 資 料 目 錄一、鑒定大綱1二、研究工作報(bào)告2三、技術(shù)研究報(bào)告3四、經(jīng)濟(jì)效益分析報(bào)告26五、檢驗(yàn)報(bào)告書28六、應(yīng)用證明29 鑒 定 大 綱一、 定本大綱的依據(jù)“發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸關(guān)鍵技術(shù)研究”是由湖北工業(yè)大學(xué)和湖北世力達(dá)生物科技有限公司共同完成的科研項(xiàng)目。經(jīng)項(xiàng)目組全體成員的共同努力，已圓滿完成了各項(xiàng)研究任務(wù)，并實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品的生產(chǎn)，具備鑒定條件，特?cái)M訂本鑒定大綱。二、結(jié)題的目的和內(nèi)容 (一)、審查本項(xiàng)目組提供的鑒定技術(shù)資料是否齊全、規(guī)范；（二）、審查該項(xiàng)目研究達(dá)到的水

2、平；（三）、審查所研制樣品的質(zhì)量；（四）、審查該項(xiàng)技術(shù)的推廣應(yīng)用價(jià)值和前景；三、鑒定形式、方法 申請(qǐng)由湖北省科技廳組織鑒定，邀請(qǐng)有關(guān)單位的專家組成鑒定委員會(huì)，鑒定委員會(huì)委員審閱課題組的技術(shù)資料。在此基礎(chǔ)上鑒定委員會(huì)委員對(duì)該研究作出綜合評(píng)價(jià)和結(jié)論，寫出鑒定意見。四、鑒定技術(shù)資料1、鑒定大綱2、研究工作報(bào)告3、研究技術(shù)報(bào)告4、經(jīng)濟(jì)效益分析報(bào)告5、檢驗(yàn)報(bào)告書6、應(yīng)用證明研 究 工 作 報(bào) 告“發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸關(guān)鍵技術(shù)研究”是由湖北工業(yè)大學(xué)和湖北世力達(dá)生物科技有限公司共同完成的科研項(xiàng)目。經(jīng)項(xiàng)目組全體成員的共同努力，已圓滿完成了各項(xiàng)研究任務(wù)，并實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品的生產(chǎn)。一、準(zhǔn)備試驗(yàn)階段（2008.12

3、008.2）（一）、查閱了國(guó)內(nèi)外大量有關(guān)文獻(xiàn)資料（二）、對(duì)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的研究現(xiàn)狀及前景進(jìn)行了調(diào)研（三）、準(zhǔn)備研究所需的藥品及儀器設(shè)備二、試驗(yàn)階段（2008.22009.2）（一）、完成了出發(fā)菌株假絲酵母和啤酒酵母的理化誘變及原生質(zhì)體融合；（二）、原生質(zhì)體融合后的假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的發(fā)酵條件研究；（三）、原生質(zhì)體融合后的假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化；（四）、長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的提取和分離純化；三、產(chǎn)品試制和生產(chǎn)階段（2009.22009.5）（一）、完成了長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的發(fā)酵工藝放大；（二）、完成了長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的的工業(yè)化試生產(chǎn)。四、研究結(jié)果解決了產(chǎn)

4、業(yè)化生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸發(fā)酵的關(guān)鍵技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品的生產(chǎn)。將生產(chǎn)的產(chǎn)品送到農(nóng)業(yè)部食品監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（武漢）檢測(cè)，其不飽和脂肪酸的含量為 %，產(chǎn)品分散均勻，穩(wěn)定性好。五、鑒定準(zhǔn)備工作（2009.62009.7）1、完成本鑒定所需全部技術(shù)資料的撰寫、打印工作。2、將樣品送有關(guān)部門檢測(cè)。3、向省科技廳遞交“科學(xué)技術(shù)成果鑒定申請(qǐng)書”。研究技術(shù)報(bào)告一、研究的目的、意義及國(guó)內(nèi)外概況多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)又叫多烯酸,是指含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上非共軛順式雙鍵,碳鏈長(zhǎng)度為1622個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸,雙鍵愈多,不飽和程度愈高。主要包括n-3和n-6兩

5、大類。N-3脂肪酸有：-亞麻酸(-linolenic acid，AIA)、二十二碳六烯酸(docosahexanenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eieosapentaenoie acid，EPA)。n-6脂肪酸有：亞油酸(1inoleie acid，LA)、-亞麻酸(-linolenic acid，GLA)、二高亞麻酸(dihonolinolenic acid，DHGLA)和花生四烯酸(araehidonie acid，AA)。多不飽和脂肪酸具有多種生理功能，不僅是生物膜的重要組成成分，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞構(gòu)型、動(dòng)態(tài)平衡、相轉(zhuǎn)變及細(xì)胞膜的滲透性等，同時(shí)也可以轉(zhuǎn)化為某些生物活性物質(zhì)的前體，

6、并調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)，預(yù)防一些疾病的發(fā)生。PUFAs特別是亞麻酸和花生四烯酸是人體的必需脂肪酸，有著多種生理功能。具體來說，亞麻酸作為前列腺素的前體物質(zhì)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化，降低血脂膽固醇濃度，降血壓、抑制血小板凝集，增強(qiáng)免疫功能，保濕護(hù)膚等作用?；ㄉ南┧崾侨梭w中含量最高，分布最廣的一種多不飽和脂肪酸（PUFA），尤其是在腦和神經(jīng)組織中AA含量一般占總PUFAS的4050，在神經(jīng)末梢甚至高達(dá)70，具有保護(hù)皮膚，降低膽固醇，抑制血小板聚集，提高免疫力，促進(jìn)胎兒發(fā)育等功能。多不飽和脂肪酸,目前已越來越引起人們的重視。傳統(tǒng)從動(dòng)植物中提取PUFA已不能滿足市場(chǎng)的需求，微生物發(fā)酵生產(chǎn)PUFA因有不受原料

7、、氣候、產(chǎn)地的限制，易產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此有著廣闊的市場(chǎng)前景，此方面的研究正方興未艾幾乎所有微生物(細(xì)菌、酵母、霉菌、藻類等)都能產(chǎn)生油脂和不飽和脂肪酸，但細(xì)菌油脂含量較低，目前研究較多的是酵母和霉菌。常用于產(chǎn)油的酵母有假絲酵母、粘紅酵母、斯達(dá)氏油脂酵母，產(chǎn)油油脂酵母等。酵母中最豐富的脂肪酸是油酸，其次是亞油酸，不飽和脂肪酸含量較霉菌低。而霉菌富含各種多不飽和脂肪酸，常用于研究的有深黃被孢霉(Mortierella isabellina)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、

8、土曲霉(Aspergillus terreus)、雅致枝霉(Thamnidium elegans)、三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)等霉菌，特別是被孢霉屬，主要用于研究生產(chǎn)GLA和AA。國(guó)內(nèi)外都對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸及影響其合成的因素做了各方面的研究，如碳氮源、C/N、pH值，溫度、添加植物油等等?？偟脕碚f，葡萄糖、低溫、高C/N利于不飽和脂肪酸的合成。國(guó)外方面，Seraphim Papanikolaou用深黃被孢霉高碳氮比培養(yǎng)，得到菌體細(xì)胞量達(dá)35.9g/l ,油脂占細(xì)胞干重的50-55% ,GLA含量占菌體總脂肪酸量的3.5 1.0%,即GLA 產(chǎn)率為0.801

9、g/l。D.Somasheka等對(duì)Mucor rouxii 和 Mucor sp.1b進(jìn)行研究結(jié)果顯示這兩種菌主要產(chǎn)棕櫚油，油酸和十八烷酸。對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)KNO3有利于脂質(zhì)的合成，以葡萄糖為碳源時(shí)GLA產(chǎn)量最高，而乳糖不利于細(xì)胞生長(zhǎng)及油脂的合成。Elena Conti等對(duì)毛霉菌目在谷物固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)-亞麻酸做了研究。結(jié)果顯示Cunninghamella elegans CCF 1318在大麥上生長(zhǎng)-亞麻酸產(chǎn)量最高。每克干基質(zhì)可生產(chǎn)-亞麻酸14.2 mg，占總不飽和脂肪酸的15.6%。Sandra D.Dyal等對(duì)Mortierella ramanniana var. Ramanniana生產(chǎn)

10、-亞麻酸的最優(yōu)條件做了較詳細(xì)研究。細(xì)胞量可達(dá)29g/l,在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下，油脂產(chǎn)量達(dá)細(xì)胞干重的54.2%，其中不飽和脂肪酸在總油脂比例達(dá)84.3%，-亞麻酸在總油脂中的含量為13.3%。V.K.Eroshin等研究了Mortierella alpina LPM 301中花生四烯酸(ARA)的生產(chǎn)條件。在以KNO3為氮源時(shí)，ARA在總脂含量達(dá)60.4%，占細(xì)胞干重的18.8%，每升發(fā)酵液可獲取ARA 4.5g。國(guó)內(nèi)方面，李忠玲等以少根根霉(Rhizopus arrhizus)R0為出發(fā)菌株,利用紫外誘變的方法,利用紫外誘變結(jié)合失水蘋果酰肼篩選的方法,選育出突變株R4,搖瓶培養(yǎng)菌體的生物量為28

11、.84g/l，油脂含量35.55%,其中GLA占油脂的12.5%,比原始菌株油脂含量提高了93.94%,GLA 提高了276.5%。經(jīng)傳代培養(yǎng)證明,選到的突變株產(chǎn)- 亞麻酸性能穩(wěn)定。劉陽等采用紫外線和硫酸二乙酯對(duì)深黃被孢霉As3 ,3410和雅致小克銀漢霉As3,2717進(jìn)行誘變,篩選出一株高產(chǎn)- 亞麻酸的突變株H3,3410-5。突變株H3,3410-5每升發(fā)酵液中干菌體得率為24.3g,油脂含量為10.1g,- 亞麻酸的含量占總脂的9.43%。汪晨輝等以卷枝毛霉( Mucor circinelloides)3.2208為出發(fā)菌株,進(jìn)行紫外誘變,用蘇丹黑染色法和紅四氮唑(TTC) 酶活測(cè)定法

12、初篩,搖瓶復(fù)篩,獲得1株高產(chǎn)GLA的誘變株M3。通過紫外線誘變育種及初篩和復(fù)篩,獲得1株GLA產(chǎn)率比出發(fā)菌株顯著提高的突變株M3,其菌體細(xì)胞收率為15.20g/l， 油脂含量為20.10%,油脂產(chǎn)率為3.65g/l,GLA含量占菌體總脂肪酸量的17.28%,GLA 產(chǎn)率為630.72mg/l,分別是出發(fā)菌株的1.50、1.51、2.74、2.04 和5.61倍。朱國(guó)勝等利用紫外線復(fù)合氯化鋰誘變高山被孢霉SM96，篩選出一株高產(chǎn)-亞麻酸的菌株TM11,產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了近3倍。對(duì)影響其多不飽和脂肪酸產(chǎn)生的因子Mg2+，VB6, 營(yíng)養(yǎng)鹽溶液，磷源，碳源，氮源酵母膏進(jìn)行了正交試驗(yàn)，選出TM11在最

13、佳的培養(yǎng)基中生物量達(dá)18.0213g/l，總脂產(chǎn)量達(dá)10.8128g/l，GLA含量668mg/l。禹慧明等以從土壤中篩選得到的被孢霉菌為出發(fā)菌,用紫外線誘變處理,篩選-亞麻酸高產(chǎn)變異株,用搖瓶發(fā)酵選出其最佳培養(yǎng)基配方。原出發(fā)菌株細(xì)胞干重25.0g/l,油脂含量9.5g/l,-亞麻酸含量5.0%。選出的高產(chǎn)菌株在最佳條件下發(fā)酵,細(xì)胞干重50.2g/l,油脂含量21.8g/l,-亞麻酸含量8.5%。所得高產(chǎn)菌株具遺傳穩(wěn)定性。L.J.Yu等研究了谷氨酸對(duì)Mortierella alpina 生產(chǎn)花生四烯酸的影響。發(fā)現(xiàn)谷氨酸有利于細(xì)胞生長(zhǎng)并能促進(jìn)花生四烯酸的合成，當(dāng)谷氨酸添加量為0.8g/l時(shí)，花生

14、四烯酸的產(chǎn)量達(dá)到最高(1.41g/l)。Hung-Der Jang等從11株菌種篩出了不飽和脂肪酸高產(chǎn)菌株M.alpina ATCC 32222并研究了其生產(chǎn)不飽和脂肪酸的最佳條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫有利于不飽和脂肪酸的合成，最佳 C/N 比范圍在5.1-9.0之間。在12時(shí)，細(xì)胞量為6.2g/l,每消耗1g碳總不飽和脂肪酸產(chǎn)量為218.4mg，其中亞麻酸21.4mg，-亞麻酸25.6mg,花生四烯酸110.3mg。脂肪酸傳統(tǒng)的提取分離方法主要有：壓榨分離法、有機(jī)溶劑分離法、精餾分離法及尿素包合分離等化學(xué)方法。傳統(tǒng)工藝相對(duì)原理簡(jiǎn)單，操作方便，成本經(jīng)濟(jì)，但由于脂肪酸的熱敏性，及其將作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、食品

15、添加劑及保健食品等的特定要求，傳統(tǒng)的分離方法存在一定的局限。較新的分離技術(shù)有超臨界萃取法和色譜分離技術(shù)。王淑云等基于-絡(luò)合吸附分離原理研究了由液體石蠟和油酸組成的飽和不飽和混合脂肪酸分離技術(shù)。以羥基磷酸鈣(HAP)作為吸附劑載體，以AgNO3作為活性組分，用浸漬法將AgNO3擔(dān)載于羥基磷酸鈣(HAP)上制得絡(luò)合吸附劑。用氣相色譜、傅立葉紅外光譜對(duì)不同載銀量的吸附劑以及不同吸附劑用量的吸附分離效果進(jìn)行了檢測(cè)。對(duì)其吸附分離脂肪酸的效果進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)：羥基磷酸鈣作為載體，最佳煅燒溫度為800，AgNO3為活性組分，在油酸與液體石蠟質(zhì)量配比為14，反應(yīng)溫度為50，吸附劑加入量為2.5g時(shí)，混合脂肪酸的

16、分離效果達(dá)到95%以上。發(fā)酵生產(chǎn)不飽和脂肪酸存在的主要問題是,發(fā)酵生產(chǎn)難以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn),在搖瓶中優(yōu)化的最佳條件和得到的最大產(chǎn)量在發(fā)酵罐中難以重現(xiàn)，如L.J.Yu等在搖瓶中得到的花生四烯酸的產(chǎn)量達(dá)到1.41g/l，但同樣的條件在10L的發(fā)酵罐中產(chǎn)量只有0.93g/l。更方便經(jīng)濟(jì)高效的提取方法也有待進(jìn)一步的深入研究。另外，研究工作不應(yīng)僅局限于已知菌種，應(yīng)從自然界篩出更多優(yōu)良菌株，這樣常用的初始菌株的篩選方法-蘇丹染色法就略顯麻煩和主觀，更快速準(zhǔn)確的篩選方法也有待進(jìn)一步研究。本研究采用理化誘變和原生質(zhì)體融合等方法進(jìn)一步提高假絲酵母的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)量；優(yōu)化假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的條

17、件及培養(yǎng)基組成；探討長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的提取工藝條件，為長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。二、主要研究?jī)?nèi)容一）、高產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸菌種的選育(一)、原生質(zhì)體融合選育菌株1、材料與方法1.1材料：1.1.1菌株選用本課題組篩選的對(duì)氟康唑（Fluconazole）具有抗性的啤酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）BFG0712和對(duì)制菌霉素（Nyafungini）具有抗性的假絲酵母（Candida tropicalis）JFG0756。1.1.2試液（1） 高滲緩沖液（ST）：10mmol/L、pH7.4Tris-HCl，0.5mol/L蔗糖，10mmol/LMgCl2

18、。（2）PEG：PEG6000：30%，蔗糖：5%，CaCl2（無水）：0.47%，10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）。（3）0.1mol/L EDTA1.1.3培養(yǎng)基（1）BFG0712培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基:PYG液體培養(yǎng)基（KH2PO4:0.2%，MgSO47H2O：0.1，（NH4）2SO4：0.1，葡萄糖：1，蛋白胨：0.35，酵母膏：0.3，調(diào)pH5.5）滅菌后，加入0.5g/ml的Fluconazole。固體培養(yǎng)基：PYG液體培養(yǎng)基加瓊脂2%，加入0.5g/ml的Fluconazole。（2）JHG9923培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：PYG液體培養(yǎng)基滅菌后，加入25單位/ml的N

19、ysfungini。固體培養(yǎng)基：PYG液體培養(yǎng)基加瓊脂2%，加入25單位/ml的Nysfungini。（3）融合子再生培養(yǎng)基：用高滲緩沖液（ST）配制PYG固體培養(yǎng)基，加入0.5g/ml的Fluconazole及25單位/ml的Nysfungini。1.2方法1.2.1 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的含量測(cè)定1）、脂肪碘價(jià)的測(cè)定 碘價(jià)指 100 克脂肪所吸收的碘的克數(shù)。碘價(jià)的高低表示脂肪酸不飽和度的大小，脂肪分子中的不飽和脂?；–H=CH）能吸收碘，主要化學(xué)反應(yīng)如下：I2 + Br22IBr（Hanus reagent，溶劑為冰醋酸）KI +CH3COOHHI+CH3COOKI2 +2 Na2S2O4

20、2NaI+Na2S4O6 用移液管準(zhǔn)確移取一定體積的脂肪貯存液于碘瓶中，并用氮?dú)獯蹈芍梁阒?，稱重（脂肪重量約 0.1g），加入 10ml 氯仿作溶劑使脂肪溶解，加入 Hanus試劑 10ml，塞好碘瓶，輕搖，混勻，放在暗處30分鐘，另一碘瓶放入同樣的試劑，不加脂肪作為空白對(duì)照。 30 分鐘后，靠碘瓶口邊緣緩緩加入 10mlKI 和 50mlH2O，混勻，用0.1mol/L Na2S2O4 滴定，當(dāng)瓶?jī)?nèi)液體呈淡黃色時(shí)，加入 1淀粉液數(shù)滴，滴定至藍(lán)色恰恰消失為止，記錄所用 Na2S2O4溶液的量，用同樣方法滴定空白瓶。 計(jì)算碘價(jià)B：滴定空白瓶所消耗的 Na2S2O4 溶液毫升數(shù)S：滴定樣品所消耗的

21、Na2S2O4 溶液毫升數(shù)C：標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O4 溶液的濃度2）、脂肪皂化價(jià)的測(cè)定 脂肪與堿的水解作用稱皂化作用。皂化 1g 油脂所需要的 KOH 的毫克數(shù)就是該油脂的皂化價(jià)。主要反應(yīng)方程式為：COOH + KOH COOK + H2O 用移液管準(zhǔn)確移取一定體積的脂肪貯存液于 150ml 燒瓶中，并用氮?dú)獯蹈芍梁阒兀Q重（脂肪重量約 0.1g），加入 0.1mol/L KOH 乙醇溶液 10ml。 燒瓶上裝上冷凝管，置于水浴鍋上，不斷搖動(dòng)，約 60 分鐘，直至瓶?jī)?nèi)的脂肪完全皂化為止（此時(shí)，瓶?jī)?nèi)液體澄清并無油珠出現(xiàn)） 冷卻完畢，加入 35 滴酚酞指示劑，以 0.05mol/L HCl 溶液滴定剩

22、余的堿，記錄 HCl 溶液的用量。同時(shí)作一個(gè)空白實(shí)驗(yàn)，記錄 HCl 溶液的用量 計(jì)算皂化價(jià)A：空白實(shí)驗(yàn)所消耗的 HCl 溶液的毫升數(shù)B：脂肪實(shí)驗(yàn)所消耗的 HCl 溶液的毫升數(shù)C：標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液的濃度3）、脂肪酸價(jià)的測(cè)定酸價(jià)指中和 1g 脂肪的游離脂肪酸所需要的 KOH 的毫克數(shù)，酸價(jià)表示脂肪酸的酸敗程度。其反應(yīng)方程式為：RCOOH + KOH RCOOK + H2O 用移液管準(zhǔn)確移取一定體積的脂肪貯存液于 100ml 三角燒瓶中，并用氮?dú)獯蹈芍梁阒?，稱重（脂肪重量約 0.1g）。 在三角燒瓶中加入混合液 20ml（混合液配方：95乙醇乙醚1:1，加入酚酞指示劑數(shù)滴，用 0.01mol/L

23、KOH 中和至紅色，振蕩）。振蕩數(shù)分鐘（或在 40水浴中溶化）至透明，紅色消失。加入酚酞指示劑1-2 滴，用 0.1mol/L KOH 標(biāo)準(zhǔn)液滴定至淡紅色，一分鐘不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄 0.01mol/L KOH 溶液的用量。 計(jì)算酸價(jià)C：標(biāo)準(zhǔn) KOH 溶液的濃度；V：樣品消耗 KOH 溶液的毫升數(shù)；1.2.2 BFG0712及JFG0756對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的確定分別將保藏的BFG0712及JFG0756接種到各自的固體培養(yǎng)基斜面上活化兩次，再接到各自的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，每隔2h測(cè)一次OD600nm，以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)，作出生長(zhǎng)曲線，確定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。1.2.3 BFG0

24、712及JFG0756原生質(zhì)體的制備將BFG0712及JFG0756兩菌株分別接入含各自液體培養(yǎng)基50ml的500ml三角瓶中，于28，100r/min搖床上分別培養(yǎng)20h和12h，取此培養(yǎng)液各5ml，300r/min離心收獲細(xì)胞，并用EDTA洗滌兩次，用酶液懸浮細(xì)胞，使為107/ml左右。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)細(xì)胞數(shù)，其值為每毫升ABFG0712和AJFG0756個(gè)細(xì)胞，于28下酶解破壁40min、60min、90min，取每個(gè)破壁時(shí)間下的液體1ml，稀釋100倍，再計(jì)數(shù)，算出稀釋前溶液中細(xì)胞數(shù)分別為1ml BBFG0712和BJFG0756，原生質(zhì)體數(shù)分別為1ml ABFG0712 -BBFG07

25、12和1ml AJFG0756BJFG0756，由此確定原生質(zhì)體的制備率。1.2.4 原生質(zhì)體融合及融合子的再生將制取的兩親株原生質(zhì)體于1000r/min離心3min去沉淀，取上清液于3000r/min，離心10min收獲原生質(zhì)體，用ST溶液洗滌兩次，用ST溶液1ml懸浮原生質(zhì)體，取兩菌株原生質(zhì)體液各0.5ml混合，于3000r/min，離心10min，去盡上清，加ST溶液0.1ml懸浮原生質(zhì)體，再加PEG溶液3.9ml，輕輕吹吸23次，于28放置35min后，于1500r/min離心去上清，用ST溶液稀釋后涂布埋入融合子再生培養(yǎng)基中，于28培養(yǎng)5天，挑出在培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌體，于融合子再生培養(yǎng)

26、基中分離純化3次，挑取菌體接種于融合子再生培養(yǎng)基的斜面試管中保藏備用。2 結(jié)果與分析2.1 BFG0712及JFG0756對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以O(shè)D600nm為縱坐標(biāo)，時(shí)間t為橫坐標(biāo)，BFG0712及JFG0756的生長(zhǎng)曲線見圖1。00.20.40.60.811.21.41.61.822.22.42.62.833.23.40481216202428t(h)BFG0712生長(zhǎng)曲線JFG0756生長(zhǎng)曲線OD600nm圖1 BFG0712及JFG0756生長(zhǎng)曲線由圖1可知，根據(jù)兩菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，選用培養(yǎng)20h和12h的兩菌種的細(xì)胞作為原生質(zhì)體制備細(xì)胞。2.2 BFG0712及JFG0756原生質(zhì)制備條件及制

27、備率根據(jù)試驗(yàn)方法，其試驗(yàn)結(jié)果見表1 從表1可知，菌種酶解破壁的最佳時(shí)間都為60min，此時(shí)，BFG0712 的原生質(zhì)體制備率為76.3%，JFG0756的原生質(zhì)體制備率為81.26%。表1 原生質(zhì)體制備結(jié)果表菌株酶解時(shí)間/min原生質(zhì)體制備率/%4042.256076.379077.214053.346081.269081.742.3 原生質(zhì)體融合及融合子的再生通過原生質(zhì)體融合及融合子的再生，并采用初篩和復(fù)篩的方法，挑選了16株菌株，對(duì)這些菌株進(jìn)行三次分離、純化，確定了9株菌株其編號(hào)和長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量見表2。表2 各菌株還原型谷胱苷肽（長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸）含量表菌株長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（g

28、/100ml）Bfg200710.22Bfg200720.03Bfg200730.68Bfg200740.15Bfg200750.37Bfg20076Bfg20077Bfg200781.020.591.06Bfg200790.75表2 結(jié)果顯示，這9株菌株中Bfg20076和Bfg20078兩株的搖瓶長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量較高，其中Bfg20078菌株的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量最高，為1.06g/100ml。3、小結(jié)3.1 出發(fā)菌株BFG0712的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為4-20h，JFG0756的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為4-12h。3.2 BFG0712 和JFG0756酶解破壁的最佳時(shí)間為60min，此時(shí)BFG07

29、12的原生質(zhì)體制備率為76.37%，JFG0756的原生質(zhì)體制備率為81.26%。3.3 通過原生質(zhì)體融合選育出了菌株Bfg20078，其搖瓶長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量為1.06g/100ml。(二) 理化誘變選育1、材料與方法1.1材料1.1.1 菌株本實(shí)驗(yàn)室通過原生質(zhì)體融合選育出了菌株Bfg200781.1.2 藥品 氯化鋅（ZnCl2）, 亞硝基胍，失水蘋果酰肼，氟康唑（Fluconazole），制菌霉素（Nysfungini）1.1.3 培養(yǎng)基 （1）斜面培養(yǎng)基：KH2PO4:0.2%，MgSO47H2O：0.1，（NH4）2SO4：0.1，葡萄糖：1，蛋白胨：0.35，酵母膏：0.3，瓊

30、脂2%，調(diào)pH5.5，滅菌后加入0.5g/ml的Fluconazole和25單位/ml的Nysfungini （2）液體培養(yǎng)基：KH2PO4:0.2%，MgSO47H2O：0.1，（NH4）2SO4：0.1，葡萄糖：1，蛋白胨：0.35，酵母膏：0.3，調(diào)pH5.5，滅菌后加入0.5g/ml的Fluconazole和25單位/ml的Nysfungini （3）氯化鋅平板培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基+4000mgL ZnCl2，pH自然，滅菌20min （4）失水蘋果酰肼平板培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基+600mgL失水蘋果酰肼，pH自然，滅菌20min1.2 方法1.2.1細(xì)胞懸液的制備：用無菌生理鹽水對(duì)培養(yǎng)至對(duì)

31、數(shù)生長(zhǎng)期的具有氟康唑和制菌霉素雙重抗性的細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使細(xì)胞濃度為1056 個(gè)/mL。1.2.2 UV誘變：取5mL細(xì)胞懸液于直徑9cm平皿中,置30w紫外燈管下,距離約25cm,照射一定時(shí)間后,在紅外燈下適當(dāng)稀釋倍數(shù),取0.1mL涂平板28避光培養(yǎng),計(jì)平板菌落數(shù)。1.2.3 亞硝基胍誘變用分析天平稱一定質(zhì)量的亞硝基胍，加入0.1mol/LpH6.0磷酸緩沖液,于暗處振蕩溶解,稀釋不同梯度濃度，吸取不同濃度溶液1 mL,加入到1mL細(xì)胞懸液中，振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以適當(dāng)稀釋分離培養(yǎng)，在28培養(yǎng)3天后記數(shù)存活單菌落數(shù)目。計(jì)算各因素對(duì)細(xì)胞的致死率，以80%90%的致

32、死率為誘變劑量。1.2.4 篩選平板中ZnCl2濃度的選擇 ZnCl2 是多種脫氫酶、脫羧酶和肽酶的輔因子，是酵母生長(zhǎng)所需的微量元素。在低濃度時(shí)有促進(jìn)酵母生長(zhǎng)的作用，但高濃度的ZnCl2 對(duì)酵母有殺菌和抑菌作用。因此，實(shí)驗(yàn)過程中要考察ZnCl2濃度。1.2.5 誘變處理及菌株挑選程序 出發(fā)株株紫外線照射ZnCl2平板挑選菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸較高菌株亞硝基胍誘變失水蘋果酰肼平板挑選菌株搖瓶發(fā)酵長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸高產(chǎn)菌。2 結(jié)果與分析2.1 篩選平板中ZnCl2濃度的選擇圖2 ZnCl2濃度與致死率的關(guān)系ZnCl2濃度與致死率的關(guān)系如圖2所示， 由圖2可見，培養(yǎng)基中ZnC12的濃度與實(shí)

33、驗(yàn)菌株的致死率之間存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著ZnCl2濃度的提高，致死率逐漸提高。本文選取致死率為89.75的ZnC12濃度400mgL作為選擇性平板所用劑量。2.2 紫外線照射時(shí)間的確定 圖3 紫外線照射時(shí)間對(duì)細(xì)胞致死率的影響如圖3所示,隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞死亡率上升, 一般選擇致死率在80%左右的誘變時(shí)間作為照射時(shí)間。本研究選擇的最適時(shí)間為4min。2.3 ZnCl2平板篩選紫外誘變的菌株將紫外線誘變的細(xì)胞懸液涂布于ZnCl2平板培養(yǎng)基上，在28培養(yǎng)48h，挑出生長(zhǎng)出來的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，共得到6株菌，編號(hào)分別為UVGcg-1，UVGcg-2，UVGcg-3，UVGcg-4，

34、UVGcg-5，UVGcg-6。將這六株菌進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的含量，其結(jié)果見表3。表3 紫外線誘變所得六株菌搖瓶試驗(yàn)結(jié)果菌 株UVGcg-1UVGcg-2UVGcg-3UVGcg-4UVGcg-5UVGcg-6長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量（g/100ml）0.721.081.291.121.071.22從表3可知，通過紫外誘變和ZnCl2平板篩選，所得六株菌中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)量最高的為UVGcg-3，其產(chǎn)量為1.29g/100ml。2.4 亞硝基胍(NTG)誘變致死率如圖4所示,在30min內(nèi)隨著亞硝基胍濃度增大,細(xì)胞死亡率上升，選擇致死率在80%左右的濃度作為亞硝基胍的誘變濃

35、度，在誘變時(shí)間為30min試驗(yàn)中亞硝基胍采用1.5mg/mL。圖4 亞硝基胍（NTG）的誘變濃度對(duì)細(xì)胞致死率的影響2.5 失水蘋果酰肼平板篩選亞硝基胍（NTG）誘變的菌株將亞硝基胍（NTG）誘變的細(xì)胞懸液涂布于失水蘋果酰肼平板培養(yǎng)基上，在28培養(yǎng)48h，挑出生長(zhǎng)出來的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，共得到5株菌，編號(hào)分別為NTGGcg-1，NTGGcg-2，NTGGcg-3，NTGGcg-4，NTGGcg-5。將這五株菌進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的含量，其結(jié)果見表4。表4 亞硝基胍(NTG)誘變所得五株菌搖瓶試驗(yàn)結(jié)果菌 株NTGGcg-1NTGGcg-2NTGGcg-3NTGGcg-4NTG

36、Gcg-5長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量（g/100ml）1.881.221.570.631.24從表4可以看出，亞硝基胍(NTG)誘變所得五株菌株中有三株產(chǎn)生了正突變，兩株發(fā)生了負(fù)突變，其中菌株NTGGcg-1的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)率最高，其產(chǎn)率為1.88g/100ml，比UVGcg-3提高了45.7%。2.6 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 將NTGGcg-1傳代7次，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，其長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的產(chǎn)率非常穩(wěn)定，說明該菌株有很好的遺傳穩(wěn)定性。3、小結(jié)3.1 通過紫外誘變和ZnCl2平板篩選，得到一株編號(hào)為UVGcg-3的菌株，其產(chǎn)量為1.29g/100ml。3.2 再通過亞硝基胍(NTG)誘變和失水蘋果

37、酰肼平板篩選，得到一株編號(hào)為NTGGcg-1的菌株，其產(chǎn)率為1.88g/100ml，比UVGcg-3提高了45.7%。3.3 NTGGcg-1有很好的遺傳穩(wěn)定性。二）、發(fā)酵工藝條件及代謝調(diào)控的研究1、材料與方法1.1材料1.1.1菌株： 本實(shí)驗(yàn)室通過原生質(zhì)體融合和理化誘變得到的菌株NTGGcg-11.1.2 藥品 葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO47H2O、（NH4）2SO4、檸檬酸鈉、尿素、瓊脂等。1.1.3 培養(yǎng)基（1）斜面培養(yǎng)基(PDA)(g/L) 土豆200，葡萄糖30，瓊脂20，pH自然（2）液體種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖60，尿素3，(NH4)2S04 2，酵母膏1

38、，KH2PO4 5，MgSO47H2O 1，pH 6（3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖120，尿素5，(NH4)2S04 2，KH2PO4 3，MgSO47H2O 0.5，檸檬酸鈉1.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.3，pH 5.5 1.2方法1.2.1 培養(yǎng)條件斜面種子活化24小時(shí)后接入到種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)28小時(shí)后再按8%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度28 ，搖床轉(zhuǎn)速200rpm.1.2.2長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量的測(cè)定：同前。1.2.3 最適碳源的確定 碳源是構(gòu)成細(xì)胞和長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的碳架及能量來源，針對(duì)菌株NTGGcg-1的生長(zhǎng)特征以及長(zhǎng)鏈

39、多不飽和脂肪酸生物合成的要求，選用不同的碳源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵液中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的含量，確定該菌株發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的最適碳源。1.2.4 最適氮源及氮源組合的確定選用不同的有機(jī)和無機(jī)氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵液中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的含量，確定該菌株發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的最適氮源氮源組合。1.2.5 KH2PO4和MgSO4對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響 K+ 、Mg2+是細(xì)胞中許多酶的激活劑，直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及其代謝。在一定濃度范圍內(nèi)考察KH2PO4和MgSO4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成的影響1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化采用正交試

40、驗(yàn)，正交試驗(yàn)選用四因素四水平L16（44）的正交表，見表5表5 正交試驗(yàn)表水平因 素A水解糖用量（g/L）B硫酸銨（g/L）/尿素（g/L）CKH2PO4用量（g/L）DMgSO4用量（g/L）1406/220.12507/32.50.23608/430.34709/53.50.42 結(jié)果與分析2.1 碳源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、大米淀粉水解糖五種碳源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響，每種糖的用量為60g/L，其結(jié)果見表6表6 碳源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響碳 源葡萄糖蔗糖麥芽糖果糖大米淀粉水解糖長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量（%）1.351.481

41、.411.521.73 從表6可知，各種碳源都可用于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)，其中以大米淀粉水解糖的產(chǎn)率最高，果糖次之，因此，選擇大米淀粉水解糖作為本試驗(yàn)的碳源。2.2氮源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響2.2.1 單一氮源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響考察了牛肉膏、蛋白胨和酵母粉三種有機(jī)氮源以及硫酸銨、尿素、氯化銨和硝酸鈉四種無機(jī)氮源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響，有機(jī)氮源的加量為0.5%，無機(jī)氮源的加量均為0.8%，其結(jié)果見表7表7 氮源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響氮源有機(jī)氮源無機(jī)氮源牛肉膏蛋白胨酵母粉硫酸銨尿素氯化銨硝酸鈉長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量（%）1.321.461.

42、501.671.550.760.55從表7可知，無機(jī)氮源中以硫酸銨對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的影響最大，其次是尿素，氯化銨和硝酸鈉不適合于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成；有機(jī)氮源中，三種物質(zhì)對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成都有一定的影響，但沒有無機(jī)氮源中硫酸銨和尿素的影響大。2.2.2 氮源組合對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響根據(jù)表7的結(jié)果，以硫酸銨作為主要氮源，分別與牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、尿素組合，硫酸銨的加量為0.8%，其它四種組分加量為0.5%，考察四種組合的氮源對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響，其結(jié)果見表8表8 氮源組合對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響氮源組合硫酸銨/牛肉膏硫酸銨/蛋白胨

43、硫酸銨/酵母粉硫酸銨/尿素長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量%1.641.571.661.82從表8可知，硫酸銨/尿素組合對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響最大，硫酸銨與其它有機(jī)氮源的組合對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成也有較大的影響，考慮到有機(jī)氮源的成本比尿素高，且有機(jī)氮源存在于發(fā)酵液中不利于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的分離與純化，因此，發(fā)酵液中氮源的組合選用硫酸銨/尿素組合。2.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化按照正交試驗(yàn)方案，進(jìn)行長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸發(fā)酵試驗(yàn)，其結(jié)果見表9由表9可知，發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化組合因素影響順序?yàn)椋篈C=DB，最佳表觀組合為：A2C4D1B3，極差分析最佳組合為：A2C4D3B4，最佳表觀組合與

44、極差分析最佳組合在KH2PO4和MgSO4的用量上存在著一定的差異。選用這兩種組合進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為：表觀組合A2C4D1B3搖瓶長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量的平均值為2.08%，極差分析組合A2C4D3B4搖瓶長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量的平均值為1.82%，因此，選擇組合A2C4D1B3，即大米淀粉水解糖用量為50g/L，硫酸銨/尿素用量為8g/L /4g/L，KH2PO4用量為3.5 g/L，MgSO4用量為0.1 g/L。表9 發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果因素試驗(yàn)號(hào)ABCD長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量（%）1406/220.11.192407/32.50.20.793408/430.31.

45、504409/53.50.41.575506/22.50.31.986507/320.41.287508/43.50.12.088509/530.21.719606/230.41.3310607/33.50.31.5111608/420.21.6712609/52.50.11.5013706/23.50.21.5614707/330.11.5815708/42.50.41.1016709/520.31.451.261.501.401.641.761.341.391.431.601.591.531.661.421.611.531.32R0.50.270.340.343、小結(jié)3.1 各種碳源都可用

46、于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)，其中以大米淀粉水解糖的產(chǎn)率最高，果糖次之，因此，選擇大米淀粉水解糖作為本試驗(yàn)的碳源；3.2 無機(jī)氮源中以硫酸銨對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的影響最大，其次是尿素，氯化銨和硝酸鈉不適合于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成；有機(jī)氮源中，三種物質(zhì)對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成都有一定的影響，但沒有無機(jī)氮源中硫酸銨和尿素的影響大；硫酸銨/尿素組合對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的影響最大，硫酸銨與其它有機(jī)氮源的組合對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成也有較大的影響，考慮到有機(jī)氮源的成本比尿素高，且有機(jī)氮源存在于發(fā)酵液中不利于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的分離與純化，因此，發(fā)酵液中氮源的組合選用硫酸銨/尿素

47、組合3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：大米淀粉水解糖用量為50g/L，硫酸銨/尿素用量為8g/L /4g/L，KH2PO4用量為3.5 g/L，MgSO4用量為0.1 g/L，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量的平均值為2.08%。三）、產(chǎn)品分離與純化1、工藝流程發(fā)酵液離心收集菌體真空脫水索氏提取菌體油脂真空脫水乙酯化鹽水洗滌離心尿素包合冷卻結(jié)晶過濾酸化水洗分離脫水高含量不飽和脂肪酸成品2.工藝條件2.1 原、輔料及化學(xué)試劑丙酮，乙醚、乙酸乙酯、氯仿、氫氧化鈉、鹽酸等。2.2 儀器設(shè)備高速組織搗碎機(jī)，PHS-29A型酸度計(jì)，恒溫電熱水浴鍋等。2.3 最佳工藝條件及溶劑的確定本試驗(yàn)選用的三組溶劑分別是：丙酮乙醚、乙

48、酸乙酯、氯仿，其試驗(yàn)過程為： 各試驗(yàn)瓶中裝入2g經(jīng)干燥的菌體，根據(jù)正交試驗(yàn)表確定各因素的值，各試驗(yàn)瓶在其相應(yīng)條件下作索氏提取試驗(yàn)，按照上述方法測(cè)定多不飽和脂肪酸的含量，并計(jì)算提取率。2.4 正交試驗(yàn)表 本試驗(yàn)所用三組溶劑采用同一正交試驗(yàn)表，其具體內(nèi)容見表10。表10 L9(3)正交試驗(yàn)表因 素 水平溶劑量(A)溫度(B)pH值(C)1302542603563904582.5 以氯仿為溶劑提取多不飽和脂肪酸正交試驗(yàn)以氯仿為溶劑，按正交表作試驗(yàn)，以提取率為考核指標(biāo)，其結(jié)果見表11。表11 氯仿為溶劑的正交試驗(yàn)結(jié)果表 因素 水平試驗(yàn)號(hào) 溶劑量(A)溫度(B)pH值(C)提取率%13025429.00

49、23035676.503304582.1046025824.0056035424.506604567.0079025636.5089035847.0099045437.2035.9029.8030.2018.5049.3040.0040.2015.4024.40R21.7033.9015.60 由表11可知，利用氯仿作為溶劑提取多不飽和脂肪酸時(shí)，因素影響順序?yàn)锽AC，最佳表現(xiàn)組合為：B2A1C2，極差分析最佳組合為B2A3C2,考慮到提取成本，選用B2A1C2即溫度為35、pH值為6.0、溶劑用量為30時(shí)效果最好，其提取率為76.50%，且溫度對(duì)提取效果的影響最大，pH值對(duì)提取效果的影響最小。

50、2.6 以乙酸乙酯作為溶劑提取多不飽和脂肪酸的正交試驗(yàn)結(jié)果以乙酸乙酯作溶劑，按正交表做試驗(yàn)，以提取率為考核指標(biāo)，其試驗(yàn)結(jié)果見表12。由表12可知，利用乙酸乙酯作溶劑提取番茄紅色素時(shí)，因素影響順序?yàn)椋篊AB，最佳表現(xiàn)組合為C2A1B2，極差分析最佳組合為C2A3B2，考慮到提取成本，選用C2A1B2 ，即溫度為35、PH值為6、溶劑用量為30時(shí)效果最好，其提取率為75.40，且pH對(duì)提取效果影響最大，溫度對(duì)提取效果的影響最小。表12 乙酸乙酯為溶劑的正交試驗(yàn)結(jié)果表 因素 水平試驗(yàn)號(hào) 溶劑量(A)溫度(B)pH值(C)提取率%13025423.5023035675.403304581.504602

51、5816.7056035440.5066045662.2079025675.0089035812.0099045447.50.33.5038.4037.2039.8042.6070.9044.8037.1010.10R11.305.560.802.7 以丙酮乙醚作為溶劑提取多不飽和脂肪酸正交試驗(yàn)結(jié)果以丙酮乙醚作為溶劑，按正交表作試驗(yàn)，以提取率為考核指標(biāo)，其試驗(yàn)結(jié)果見表13。表13 丙酮乙醚為溶劑的正交試驗(yàn)結(jié)果表因素 水平 試驗(yàn)號(hào) 溶劑量(A)溫度(B)pH值(C)提取率%13025439.1023035682.8033045817.4046025823.5056035458.806604565

52、.0079025689.3089035871.4099045451.1046.4050.6049.7029.1071.0059.0070.6024.5037.40R41.5046.5021.60由表13可知，利用丙酮乙醚作為溶劑提多不飽和脂肪酸時(shí)，因素影響順序?yàn)锽AC，最佳表現(xiàn)組合為B1A3C2，極差分析最佳組合為B2A3C2，由于25更接近于自然溫度，考慮到生產(chǎn)方便，選用B1A3C2，即溫度為25、pH值為6、溶劑用量為90時(shí)效果最好，其提取率為89.3%，且溫度對(duì)提取效果的影響最大，pH值對(duì)提取效果的影響最小。綜合以上三組溶劑提取多不飽和脂肪酸的結(jié)果可知，以丙酮乙醚作溶劑提取多不飽和脂肪酸效果最好；影響提取效果的因素中，溫度對(duì)多不飽和脂肪酸提取效果的影響最大，pH值對(duì)提取效果的影響最小。2.8 尿素包合提取多不飽和脂肪酸尿素中加入無水乙醇，加熱回流，