生化藥物生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)報(bào)告

1、報(bào)告1、生化藥物生產(chǎn)安全應(yīng)急預(yù)案一、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 （一）實(shí)驗(yàn)要求1、 實(shí)驗(yàn)前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、預(yù)期的結(jié)果，操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)。2、 實(shí)驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)肅認(rèn)真專心操作，注意觀察實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果；結(jié)果不良時(shí)，必須重做。3、 實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)及時(shí)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果如實(shí)記錄下來，并請老師當(dāng)場審核。4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析，按時(shí)將實(shí)驗(yàn)報(bào)告交老師審閱。 （二）儀器保管及清潔1、 常用儀器在首次實(shí)驗(yàn)時(shí)，按儀器清單進(jìn)行清點(diǎn)，并負(fù)責(zé)保管，若有缺損到實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室換領(lǐng)，實(shí)驗(yàn)中如有儀器破損必須登記，期末如數(shù)歸還。2、 實(shí)驗(yàn)后，必須把玻璃儀器洗凈放入柜內(nèi)，按次序放置好，以提高工作效率

2、并防止破損。3、 貴重儀器尤其要盡力愛護(hù)，非本次實(shí)驗(yàn)使用的儀器未經(jīng)老師允許不得亂動(dòng)；本次實(shí)驗(yàn)必須要用的儀器，在使用前要了解使用方法，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。4、 公用儀器如、分光光度計(jì)、電動(dòng)離心機(jī)等，每組同學(xué)使用時(shí)間不宜過長，以免妨礙其他同學(xué)使用。5、 玻璃儀器清洗、一般玻璃儀器都應(yīng)用洗衣粉或去污粉洗滌；鉻酸洗液勿用于普通玻璃儀器之洗滌，用過的鉻酸洗液須加以保存，直到變?yōu)榫G色方可棄之，其舍棄法與濃硫酸液相同；蒸餾水的使用，應(yīng)遵循少量多次原則。 （三）試劑使用規(guī)則1、 使用試劑前應(yīng)仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實(shí)驗(yàn)所需要。2、 取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，切勿蓋錯(cuò)；用好后放回原處，未用完的試劑

3、不得倒回瓶內(nèi)。3、 取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)先將標(biāo)準(zhǔn)液倒入干凈試管中，再用清潔吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)溶液。4、 使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，切勿倒置以免試劑流入橡皮帽內(nèi)。5、 使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒量?。蝗粲梦軙r(shí)要用吸球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 （四）安全注意事項(xiàng)1、 低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用時(shí)應(yīng)遠(yuǎn)離火源；若須加熱要用水浴加熱，不可直接在火上加熱。2、 凡屬發(fā)煙或產(chǎn)生有毒氣體的化學(xué)實(shí)驗(yàn)，均應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行，以免對人體造成危害。3、 若發(fā)生酸堿灼燒事故，先用大量自來水沖洗。酸灼傷者用飽和nahco3溶液中和，堿灼傷者用飽和h3bo3溶

4、液中和，氧化劑傷者用nas2o4處理。4、 若發(fā)生起火事件，根據(jù)發(fā)生起火性質(zhì)分別采用砂、水、co2或ccl4滅火器撲滅。5、 離開實(shí)驗(yàn)室前必須關(guān)好窗戶、切斷電源、水源，以確保安全。 （五）廢棄物處理1、 所有固體廢物如、用過的濾紙、碎屑沉淀物等必須棄于垃圾桶中。2、 濃酸必須棄于小缽中，用水沖淡，然后倒入水池中。3、 實(shí)驗(yàn)完成后之沉淀或混合物若含有可提取之貴重物品者，不可隨意舍棄，應(yīng)交教師保管。 （六）實(shí)驗(yàn)室清潔1、 實(shí)驗(yàn)室必須常保持清潔，不得隨地吐痰，亂丟紙屑。2、 實(shí)驗(yàn)后要清掃實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、地面，試劑瓶要擺放整齊。3、 下課時(shí)輪流由值日生打掃衛(wèi)生，經(jīng)教師檢查，方能離開實(shí)驗(yàn)室二、實(shí)驗(yàn)室常識(shí)1、挪

5、動(dòng)干凈玻璃儀器時(shí)，勿使手指接觸儀器內(nèi)壁。拿吸管時(shí)切勿用手觸及其尖端需放入液體中的部位。2、洗凈的儀器要放在架上或干凈紗布上晾干，不能用抹布擦拭，更不能用抹布擦拭儀器的內(nèi)壁。吸管、攪拌等用后要放在架上或底部墊有干凈紗布的燒杯內(nèi)，切勿亂放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，實(shí)驗(yàn)臺(tái)要保持清潔整齊。3、量瓶是量器，不要用作盛器。4、量瓶等帶有磨口玻璃塞的儀器塞子，不要蓋錯(cuò)。洗滌時(shí)塞子和儀器本身要放在一起，以免弄混。不用時(shí)要用紙條把塞子和瓶口隔開。抹過凡士林的磨口玻塞要用有機(jī)溶劑將凡士林洗凈后，再用紙條隔開放置。5、不要用濾紙稱量藥品，也不要用濾紙作記錄。6、不要用石蠟封閉精細(xì)藥品的瓶口，以免摻混。7、標(biāo)簽紙的大小應(yīng)與容器相稱

6、，貼在試劑瓶或燒杯的上2/3處，試管等則貼在上部。標(biāo)簽上應(yīng)寫明物質(zhì)的名稱、規(guī)格和濃度、配制的日期和配制人。8、標(biāo)準(zhǔn)試劑烘干后，應(yīng)以稱量瓶放在干燥器中。稱取后立即放回干燥器備用。9、取用試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液后，需立即將試劑瓶塞嚴(yán)，放回原處。取出的試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液如未用盡，切勿倒回瓶內(nèi)，以免摻混。取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)根據(jù)需要倒出一定量于干凈燒杯內(nèi)，再用移液管由燒杯中量取。不能用移液管直接由試劑瓶量取。10、凡是發(fā)生煙霧、有毒氣體和有臭味氣體的實(shí)驗(yàn)，均應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。櫥門應(yīng)關(guān)閉，非必要時(shí)不能打開。11、用動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，在殺死或解剖等操作中，必須按照規(guī)定方法進(jìn)行。不許戲弄?jiǎng)游铮^對不能用動(dòng)物、手術(shù)器械開玩笑。

7、12、在實(shí)驗(yàn)室工作時(shí)要緊張嚴(yán)肅。不許談天說笑，更不許大聲喧嘩或互相打鬧。實(shí)驗(yàn)室的藥品器材，未經(jīng)允許不得帶出實(shí)驗(yàn)室。13、在實(shí)驗(yàn)過程中，要將實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及時(shí)如實(shí)地記錄下來，數(shù)據(jù)要記在一定的記錄本中，不要隨便記在紙條上，以免丟失。需要拍照的及時(shí)拍照。記錄不能隨意涂改。14、要愛護(hù)儀器和節(jié)省藥品。貴重儀器在使用前應(yīng)熟知使用方法。使用時(shí)，要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。發(fā)生故障時(shí)，應(yīng)立即停止儀器的運(yùn)轉(zhuǎn)，告知管理人員。切勿擅自拆修。使用后應(yīng)按規(guī)定登記。三、實(shí)驗(yàn)室突發(fā)事故應(yīng)急處理預(yù)案（一）實(shí)驗(yàn)室火災(zāi)應(yīng)急處理預(yù)案：1、發(fā)現(xiàn)火情，現(xiàn)場工作人員立即采取措施處理，防止火勢蔓延并迅速報(bào)告；2、確定火災(zāi)發(fā)生的位置，判斷出火災(zāi)發(fā)生的

8、原因，如壓縮氣體、液化氣體、易燃液體、易燃物品、自燃物品等；3、明確火災(zāi)周圍環(huán)境，判斷出是否有重大危險(xiǎn)源分布及是否會(huì)帶來次生災(zāi)難發(fā)生；4、明確救災(zāi)的基本方法，并采取相應(yīng)措施，按照應(yīng)急處置程序采用適當(dāng)?shù)南榔鞑倪M(jìn)行撲救；包括木材、布料、紙張、橡膠以及塑料等的固體可燃材料的火災(zāi)，可采用水冷卻法，但對珍貴圖書、檔案應(yīng)使用二氧化碳、鹵代烷、干粉滅火劑滅火。易燃可燃液體、易燃?xì)怏w和油脂類等化學(xué)藥品火災(zāi)，使用大劑量泡沫滅火劑、干粉滅火劑將液體火災(zāi)撲滅。帶電電氣設(shè)備火災(zāi)，應(yīng)切斷電源后再滅火，因現(xiàn)場情況及其他原因，不能斷電，需要帶電滅火時(shí)，應(yīng)使用沙子或干粉滅火器，不能使用泡沫滅火器或水?？扇冀饘?，如鎂、鈉、鉀

9、及其合金等火災(zāi)，應(yīng)用特殊的滅火劑，如干砂或干粉滅火器等來滅火。5、依據(jù)可能發(fā)生的危險(xiǎn)化學(xué)品事故類別、危害程度級別，劃定危險(xiǎn)區(qū)，對事故現(xiàn)場周邊區(qū)域進(jìn)行隔離和疏導(dǎo)；6、視火情撥打“119”報(bào)警求救，并到明顯位置引導(dǎo)消防車。（二）實(shí)驗(yàn)室爆炸應(yīng)急處理預(yù)案：1、實(shí)驗(yàn)室爆炸發(fā)生時(shí)，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或安全員在其認(rèn)為安全的情況下必需及時(shí)切斷電源和管道閥門；2、所有人員應(yīng)聽從臨時(shí)召集人的安排，有組織的通過安全出口或用其他方法迅速撤離爆炸現(xiàn)場。3、應(yīng)急預(yù)案領(lǐng)導(dǎo)小組負(fù)責(zé)安排搶救工作和人員安置工作。（三）實(shí)驗(yàn)室中毒應(yīng)急處理預(yù)案：實(shí)驗(yàn)中若感覺咽喉灼痛、嘴唇脫色或發(fā)紺，胃部痙攣或惡心嘔吐等癥狀時(shí)，則可能是中毒所致。視中毒原因

10、施以下述急救后，立即送醫(yī)院治療，不得延誤。1、首先將中毒者轉(zhuǎn)移到安全地帶，解開領(lǐng)扣，使其呼吸通暢，讓中毒者呼吸到新鮮空氣；2、誤服毒物中毒者，須立即引吐、洗胃及導(dǎo)瀉，患者清醒而又合作，宜飲大量清水引吐，亦可用藥物引吐。對引吐效果不好或昏迷者，應(yīng)立即送醫(yī)院用胃管洗胃。孕婦應(yīng)慎用催吐救援。3、重金屬鹽中毒者，喝一杯含有幾克mgso4的水溶液，立即就醫(yī)。不要服催吐藥，以免引起危險(xiǎn)或使病情復(fù)雜化。砷和汞化物中毒者，必須緊急就醫(yī)。4、吸入刺激性氣體中毒者，應(yīng)立即將患者轉(zhuǎn)移離開中毒現(xiàn)場，給予2%5%碳酸氫鈉溶液霧化吸入、吸氧。氣管痙攣者應(yīng)酌情給解痙攣藥物霧化吸入。應(yīng)急人員一般應(yīng)配置過濾式防毒面罩、防毒服裝

11、、防毒手套、防毒靴等。（四）實(shí)驗(yàn)室觸電應(yīng)急處理預(yù)案：1、觸電急救的原則是在現(xiàn)場采取積極措施保護(hù)傷員生命。2、觸電急救，首先要使觸電者迅速脫離電源，越快越好，觸電者未脫離電源前，救護(hù)人員不準(zhǔn)用手直接觸及傷員。使傷者脫離電源方法：切斷電源開關(guān)；若電源開關(guān)較遠(yuǎn)，可用干燥的木橇，竹竿等挑開觸電者身上的電線或帶電設(shè)備；可用幾層干燥的衣服將手包住，或者站在干燥的木板上，拉觸電者的衣服，使其脫離電源；3、觸電者脫離電源后，應(yīng)視其神志是否清醒，神志清醒者，應(yīng)使其就地躺平，嚴(yán)密觀察，暫時(shí)不要站立或走動(dòng)；如神志不清，應(yīng)就地仰面躺平，且確保氣道通暢，并于5秒時(shí)間間隔呼叫傷員或輕拍其肩膀，以判定傷員是否意識(shí)喪失。禁止

12、搖動(dòng)傷員頭部呼叫傷員。4、搶救的傷員應(yīng)立即就地堅(jiān)持用人工肺復(fù)蘇法正確搶救，并設(shè)法聯(lián)系校醫(yī)務(wù)室接替救治。（五）實(shí)驗(yàn)室化學(xué)灼傷應(yīng)急處理預(yù)案：1、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及其它一些化學(xué)物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的刺激性和腐蝕作用，發(fā)生這些化學(xué)灼傷時(shí)，應(yīng)用大量流動(dòng)清水沖洗，再分別用低濃度的（2%5%）弱堿（強(qiáng)酸引起的）、弱酸（強(qiáng)堿引起的）進(jìn)行中和。處理后，再依據(jù)情況而定，作下一步處理。 2、濺入眼內(nèi)時(shí)，在現(xiàn)場立即就近用大量清水或生理鹽水徹底沖洗。每一實(shí)驗(yàn)室樓層內(nèi)備有專用洗眼水龍頭。沖洗時(shí)，眼睛置于水龍頭上方，水向上沖洗眼睛沖洗，時(shí)間應(yīng)不少于15分鐘，切不可因疼痛而緊閉眼睛。處理后，再送眼科醫(yī)院治療。報(bào)告2、動(dòng)物組織中核酸的提取

13、與鑒定實(shí)訓(xùn)名稱動(dòng)物組織核酸提取與鑒定實(shí)訓(xùn)目的學(xué)習(xí)和掌握核酸提取的工作原理和基本操作技術(shù)。實(shí)訓(xùn)原理核酸是生物體最重要的組成成分之一。動(dòng)物組織細(xì)胞中的核糖核酸（rna）與脫氧核糖核酸（ dna）大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白的形式存在。因此分離核酸時(shí)必須使核酸與蛋白質(zhì)分離，并除去蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)是將組織勻漿后加水飽和酚溶液，振蕩使蛋白質(zhì)變性，變性蛋白質(zhì)溶于酚相或兩界面處形成凝膠層。而dna或rna則溶于上層的水鹽溶液中。在離心后上層的水鹽溶液中加入乙醇，核酸不溶于乙醇而形成白色絮狀沉淀析出。dna與 rna均由單核苷酸組成，每個(gè)單核苷酸中含有磷酸、嘌呤與嘧啶、戊糖（核糖、脫氧核糖)。核酸用硫酸水解后，

14、即可游離出這三種物質(zhì)。用下述方法可分別鑒定出這三類物質(zhì)。（1）磷酸：用鉬酸銨與之作用可生成磷鉬酸，磷鉬酸可被氨基萘酚磺酸還原成藍(lán)色鉬藍(lán)（2）嘌呤堿：用硝酸銀與之反應(yīng)生成灰褐色的絮狀嘌呤銀化合物。（3）戊糖:a.核糖:用硫酸使之生成糠醛，糠醛與3，5二羥甲苯綜合成為一種綠色化合物b.脫氧核糖：在硫酸作用下，與二苯胺生成藍(lán)色化合物試劑介紹鉬酸銨試劑、氨基萘酚磺酸、3，5二羥甲苯溶液、二苯胺試劑、0.9%nacl、20三氯醋酸、水飽和酚、預(yù)冷的95乙醇、濃硫酸、5%硝酸銀、5%硫酸實(shí)訓(xùn)步驟實(shí)訓(xùn)步驟一：動(dòng)物組織中核酸的提取1. 勻漿制備：全班制備一份。取凍存兔肝20g置勻漿器中，加入0.9%nacl溶

15、液60ml制成勻漿。2. 提?。簩驖{取出分裝在四個(gè)100ml塑料離心管內(nèi)，分別加入1mol/l nacl溶液15ml，混勻，再加入水飽和酚溶液40ml，劇烈振蕩10min，然后4000rpm離心20min。將上清輕輕吸入一燒杯中，每2人一組取上清液4ml于小離心管中，加入等量的預(yù)冷的95%乙醇，即可見白色沉淀逐漸析出，靜置10min后，3500rpm離心10min，傾去上清，即得白色的核酸鈉沉淀。實(shí)訓(xùn)步驟二、核酸的水解在含有核酸鈉鹽的離心管內(nèi)加入5%硫酸4ml，用玻璃棒混勻，轉(zhuǎn)入小試管中，在沸水浴中加熱15min。實(shí)訓(xùn)步驟三、dna與rna成分鑒定（1）嘌呤堿的鑒定：試管號(hào)水解液5%硫酸濃氨

16、水5%硝酸銀1 220滴20滴數(shù)滴呈堿性數(shù)滴呈堿性10滴10滴加入硝酸銀后，觀察有什么變化？靜止15min后再比較兩管中沉淀顏色有何變化？（2）磷酸的鑒定管號(hào)水解液5%硫酸鉬酸銨試劑氨基萘酚磺酸1210滴10滴5滴5滴20滴20滴沸水浴中加熱數(shù)分鐘，觀察兩管顏色變化。（3）核糖的鑒定：管號(hào)水解液5%硫酸3，5二羥甲苯溶液124滴4滴6滴6滴沸水浴中加熱10min，比較兩管顏色變化。（4）脫氧核糖的鑒定管號(hào)水解液5%硫酸二苯胺試劑1220滴20滴30滴30滴沸水浴中20min觀察顏色變化思考題1、剪掉的豬肝置于什么溶液中？（0.14mol/l nacl溶液）2、95%乙醇的作用是什么？（沉淀，除

17、鹽）3、加異戊醇的作用？（消泡，有助于分層）4、常規(guī)的pr變性沉淀劑？（氯仿、重金屬、三氯醋酸、苯酚、sds）課后復(fù)習(xí)1生化分離，生化分離技術(shù)的基本步驟 生物分離與純化的目的是從微生物發(fā)酵液，酶反應(yīng)產(chǎn)物，動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)和生物體本身分離并純化對人類有用的，符合質(zhì)量要求的各種生物藥物和生物制品。來源：（1）動(dòng)物臟器 （2）血液，分泌物和其它代謝物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物特點(diǎn)：（1）目的產(chǎn)物濃度低，純化難度大（2）活性物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，操作過程容易失活（3）生物材料中生化組分?jǐn)?shù)量大，分離困難 （4）生物材料易變質(zhì)，保存困難（5）生物產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高基本步驟：原料的選取和預(yù)處理，分離提取，精

18、制和成品的制作2.細(xì)胞破碎常用的技術(shù)：（1）高壓勻漿法（2）高速珠磨法（3）超聲波法（4）化學(xué)法（5）酶解法（6）滲透壓沖擊法（7）凍結(jié)-融化法（8）干燥法常用的溶酶：溶菌酶、透明質(zhì)酸酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等。3. 生物分離技術(shù)：是指從動(dòng)植物與微生物的有機(jī)體或器官、生物工程產(chǎn)物（發(fā)酵液、培養(yǎng)液）及其生物化學(xué)產(chǎn)品中提取、分離、純化有用物質(zhì)的技術(shù)過程。4. 離心分離技術(shù)：是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。5. 常用的紫外線波長有兩種（ b ）a. 256nm和365nm b254nm和365nm c. 254nm和367nm d. 256n

19、m和367nm6. 下列細(xì)胞破碎的方法中，哪個(gè)方法屬于非機(jī)械破碎法( a )a.化學(xué)法 b. 高壓勻漿 c. 超聲波破碎 d.高速珠磨7. 常用離心設(shè)備可分為（離心沉降）和（離心過濾） 兩大類8. 生物分離的基本原理？主要是依據(jù)離心力、分子大?。êY分）、濃度差、壓力差、電荷效應(yīng)、吸附作用、靜電作用、親和作用、疏水作用、溶解度、平衡分離等原理對原料或產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化。不同的分離對象需要采用不同的分離方法才能有效地被分離。9. 生物分離技術(shù)的基本涵義及內(nèi)容？ 注：實(shí)訓(xùn)記錄圖片見附錄。報(bào)告3、sephadexg50分離核黃素與丙種球蛋白實(shí)訓(xùn)名稱丙種球蛋白與核黃素凝膠層析分離實(shí)訓(xùn)目的1.學(xué)習(xí)和掌握分

20、子篩凝膠層析法的工作原理和基本操作技術(shù)。2學(xué)會(huì)使用sephadexg50分離核黃素與丙種球蛋白。實(shí)訓(xùn)原理在一定的溫度下，同一化學(xué)物質(zhì)在不相混溶的兩種介匝間分布達(dá)平街時(shí)該物質(zhì)在這兩種介質(zhì)中的濃度比是一常數(shù)稱分配系數(shù)。不同化學(xué)物質(zhì)的分配系數(shù)不同。層析法即利用混合物中各組分的分配系數(shù)不同而崖其分離的方法。其兩種介質(zhì)，一為固定不動(dòng)，稱固定相，另一為可相對流動(dòng)，稱流動(dòng)相。 層析法已廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)領(lǐng)域中，無論是少量分析還是大量制備，都能體現(xiàn)出它的高效性，簡便性等特點(diǎn)。在實(shí)臉室中的常用層析法有：凝膠過濾，紙層析薄層層析，離子交換層析，親和層析，高效液相層析等。 以下介紹幾種常用的層析法凝膠過濾 凝膠過濾

21、的別名很多，如凝皎擴(kuò)散層析，分子篩層析，排阻層析等。這種技術(shù)具有操作簡便，回收率高(近100)，條件緩和等特點(diǎn)，但它的分離操作速度較慢。該法常用于蛋白質(zhì)，多糖，核酸的分離純化。 凝膠過濾的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)填料的柱中進(jìn)行的。柱的總體積為va，它包括填料的骨架體積vgm。，填料的孔體積vi(內(nèi)水體積)及填料顆粒間的體積vo(外水體積)。分布在填料的孔中的溶劑是固定相，分布的填料顆粒間的溶劑是流動(dòng)相。填料顆粒含有許多不同大小的孔如果待分離的物質(zhì)分子大小合適，則可以不同程度地向孔中擴(kuò)散，大分子物質(zhì)只能占有較少的大孔，小分子則能占有大孔及另外一些小孔。所以當(dāng)不同分子量物質(zhì)的混合物流經(jīng)凝膠柱時(shí)，較

22、小的分子在柱中停留的時(shí)間比大分于停留的時(shí)間長，于是混合物中各組分即按分于大小分開，最先流出的是最大的分子。示意圖如下所示， 用于生物材料分離的凝膠主要有交聯(lián)葡聚糖凝膠(商品名為sephadex)，聚丙烯酰胺凝膠(商品名為biogel)，瓊脂糖凝膠(商品名sepharose)等。如常用的交聯(lián)葡聚糖是將葡聚糖(dextran)懸浮于有機(jī)溶劑，加入交聯(lián)劑表氯醇交聯(lián)聚合而成多糖鏈的三維結(jié)構(gòu)，這種聚合物為白色珠狀微粒，是多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠的孔徑大小與交聯(lián)劑的量有關(guān)，交聯(lián)劑多則交聯(lián)度大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，孔徑小，反之交聯(lián)劑少則孔徑大。 將含有三種不同分子量物質(zhì)的混合樣品用某種規(guī)格的凝膠柱進(jìn)行分離。首先將樣品

23、小心自柱頂端加入，洗脫，以分步收集器收集洗脫液，測定每管物質(zhì)濃度，然后以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)即得如下的洗脫曲線：由圖可見最先流出的物質(zhì)是，a，它的分子量最大，大于該種凝膠的排阻限(a物質(zhì)分子的直徑大于凝膠的孔徑)，完全不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間隙流過，稱“全排阻”。其流經(jīng)體積最小，與外水體積vo相等。最后流出的物質(zhì)是c，它的分子量最小，小于該種凝膠的滲入限，其分子可以自由進(jìn)出凝膠顆粒，這叫“全滲入”。流經(jīng)體積是外水體積vo與內(nèi)水體積vi的和。而物質(zhì)b的分子量介于排阻限與滲入限之間，其分子能夠部分地進(jìn)入凝膠顆粒之中，不能全部地不受限制的通過，這叫做“部分排阻”或“部分滲入”。

24、它的流經(jīng)體積ve是全部外水體積加上內(nèi)水體積的一部分，即 ve=vo+kdvi式中kd稱作“排阻系數(shù)”或“分配系數(shù)”。它反映了物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度。kd=(ve-vo)vi當(dāng)kd=1時(shí)，ve=vo+vi為全滲入。當(dāng)kd=0時(shí)，ve=vo為全排阻。當(dāng)0kdt，則說明該物質(zhì)分子與凝膠有吸附作用。這三種物質(zhì)的分離過程可見示意圖如下： vi也可通過計(jì)算求出：vi=awra=凝膠千重wi=每克干凝膠吸水毫升數(shù)vt=vo+vi+vgvg=凝膠骨架體積vt=可通過測定層析柱內(nèi)徑及高度計(jì)算得出：vt=14d2h下表為交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類和規(guī)格：基本操作儀器介紹基本操作：裝柱、樣品處理、上樣、洗脫、分部收集

25、測定設(shè)備：層析柱（玻璃柱），鐵架臺(tái)實(shí)驗(yàn)步驟1取直徑081.2cm，長度為25cm的層析柱，在上口箍橡皮筋，出口處裝上乳膠管，柱內(nèi)加注蒸餾水23ml，排出乳膠管內(nèi)的氣泡，抬高乳膠管防止柱內(nèi)的蒸餾水排空。自頂部緩緩加入經(jīng)膨脹的葡聚糖g-50懸液。待底部凝膠沉積23cm時(shí)將乳膠管放低，仍繼續(xù)加入上述懸液至凝膠層積至18cm高度即可。操作過程中，應(yīng)防止氣泡與分層現(xiàn)象的發(fā)生。讓凝膠自然下沉，使表層平整。待凝膠柱層穩(wěn)定后，以洗脫液(蒸餾水)洗柱5分鐘，調(diào)節(jié)流速至4滴每分鐘。 2. 待蒸餾水流至柱面平時(shí)，(注意，不可使柱面干掉)，馬上沿層析柱內(nèi)壁小心加4滴樣品于柱床面，注意盡量不使床面攪動(dòng)，馬上加入12倍于

26、樣晶體積的蒸餾水，反復(fù)兩次后，可加大量蒸餾水連續(xù)洗脫，這樣可以使樣品稀釋最小。 3樣品一旦加入后馬上用量筒或刻度離心管收集流出液，柱床上不斷加蒸餾水，待紅色(血紅蛋白)流出一半時(shí)記錄毫升數(shù)，此為血紅蛋白ve也為vo。繼續(xù)收集流出液，待黃色(核黃素)流出一半時(shí)記錄體積，此為核黃素ve。 4測出柱床體積(vt)，外水體積(vo)內(nèi)水體積(vi)，及核黃素的洗脫體積(ve)。并計(jì)算出hb及魚精蛋的分配系數(shù)(kd)。 5用蒸餾水反復(fù)加在柱床上面，洗柱10分鐘然后將柱內(nèi)凝膠回收入凝膠瓶內(nèi)。注意事項(xiàng)1在收集過程中，要保持流出液的流速穩(wěn)定，洗脫速度控制在4滴/min。2加樣時(shí)，保持凝膠上平面不被攪動(dòng)。3液面

27、要始終高于凝膠上平面，否則會(huì)導(dǎo)致干柱4裝柱避免出現(xiàn)斷層、氣泡，思考題1、凝膠層析的基本原理2、裝柱不均勻或有氣泡、干裂,會(huì)造成什么后果,為什么?課后復(fù)習(xí)1層析分離：是一種物理的分離方法，利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同的程度分布在兩個(gè)相中。2 分配層析：是根據(jù)在一個(gè)有兩相同時(shí)存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。3凝膠色譜分離的依據(jù)是（ b ）。a、固定相對各物質(zhì)的吸附力不同 b、各物質(zhì)分子大小不同c、各物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配系數(shù)不同 d、各物質(zhì)與專一分子的親和力不同4如果要將復(fù)雜原料中分子量大于5000的物質(zhì)與5000分子量以下

28、的物質(zhì)分開選用（ d ）。a、sephadex g-200 b、sephadex g-150 c、sephadex g-100 d、sephadex g-505洗脫體積是（ c ）。a、凝膠顆粒之間空隙的總體積 b、溶質(zhì)進(jìn)入凝膠內(nèi)部的體積c、與該溶質(zhì)保留時(shí)間相對應(yīng)的流動(dòng)相體積 d、溶質(zhì)從柱中流出時(shí)所用的流動(dòng)相體積6分子篩層析指的是（ c ）a. 吸附層析 b分配層析 c. 凝膠過濾 d. 親和層析7那一種凝膠的孔徑最?。?a ）a. sephadex g-25 b sephadex g-50 c. sephadex g-100 d. sephadex g-2008在凝膠過濾（分離范圍是5000

29、400000）中，下列哪種蛋白質(zhì)最先被洗脫下來（ b ）a細(xì)胞色素c（13370）b肌球蛋白（400000）c過氧化氫酶（247500）d血清清蛋白（68500）e肌紅蛋白（16900）9在生物制劑制備中，常用的緩沖系統(tǒng)有磷酸鹽緩沖液；碳酸鹽緩沖液；鹽酸鹽緩沖液；醋酸鹽緩沖液等。（ ）10層析分離是一種化學(xué)的分離方法。（ ）11蛋白質(zhì)分離常用的色譜法有（凝膠色譜法） ，（多糖基離子交換色譜法），（高效液相色譜法）和（親和色譜法） 。12試述凝膠色譜的原理？答：將混合原料加在柱上并用流動(dòng)相洗脫，則無法進(jìn)入孔隙內(nèi)部的大分子直接被洗脫下來，小分子因?yàn)榭梢赃M(jìn)入孔隙內(nèi)部而受到很大的阻滯，最晚被洗脫下來，

30、而中等大小的分子，雖然可以進(jìn)入孔隙內(nèi)部但并不深入，受到的阻滯作用不強(qiáng)，因而在兩者之間被洗脫下來。13簡述凝膠層析有哪些用途？作為分析工具；作為脫鹽工具生物大分子的濃縮除熱原物質(zhì)生物大分子的分離純化；分子量的測定14試述柱層析的基本操作過程。答：1、裝柱：干法裝柱 濕法裝柱( 注意：濕法裝柱中柱內(nèi)預(yù)留一部分水，防止氣泡的產(chǎn)生，裝柱過程要連貫。平衡。)2、加樣：干法加樣濕法加樣(注意：加樣過程中，要防止產(chǎn)生飛濺，量要適中。)3、洗脫：以設(shè)定好的流速加入洗脫劑，可以是單一溶劑，也可以梯度洗脫。（ 注意：不使柱表面的溶液流干，柱上端保留一層溶液。）4、收集：每隔10ml收集一試管，使用層析的手段或紫外

31、檢測器進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測，合并具有相同物質(zhì)的流份。注：實(shí)訓(xùn)記錄圖片見附錄。報(bào)告4、聚丙烯酰胺凝膠電泳制備丙球蛋白實(shí)訓(xùn)名稱聚丙烯酰胺凝膠電泳制備丙球蛋白實(shí)訓(xùn)目的1.學(xué)習(xí)和掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的工作原理和基本操作技術(shù)。2學(xué)會(huì)使用聚丙烯酰胺凝膠電泳制備丙球蛋白。實(shí)訓(xùn)原理聚丙烯酰胺的特性1凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；2化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；3對ph和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無吸附和電滲作用；4樣品用量少，靈敏度可達(dá)10-6g;5凝膠孔徑可調(diào)節(jié)；6分辨率高。電泳法的定義及作用原理1 定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽離子或陰離子，在外加電場中以不同的遷移速度向電極移動(dòng)，而達(dá)到分離目的的分析

32、方法,我們稱之為電泳法。2 作用原理：聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。實(shí)訓(xùn)儀器試劑配置儀器：1.電泳儀 2. 電泳槽 3. 注射器 4. 長針頭 5. 吸管 6. 培養(yǎng)皿試劑：1. 三羥甲基氨基甲烷（簡稱tris） 2. 貯備液的配制：按下表配制a、b、c、d、e、f各貯備液，然后冷藏于4條件下，以防變質(zhì)。 3. 染色液： 0.05%氨基黑10b溶于7%醋酸溶液，或者用靈敏度高5倍考馬斯亮藍(lán)r250溶液染色。 4. 脫色液：7%醋酸溶液。 5. 電極

33、緩沖液（ph8.3甘氨酸-tris緩沖液）：甘氨酸28.8g，tris0.6g加水定容至1000ml. 6. 示蹤劑：0.01%溴酚藍(lán)溶液。實(shí)訓(xùn)步驟1.制膠：取一支長10cm左右的玻璃管，在一端套上乳膠帽。 1）7%聚丙烯酰胺凝膠，將試劑按a:c:h2o:f=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一燒杯中.用滴管將分離膠加入玻璃管至3/4高度，表面再加水覆蓋，在烘箱中2535下聚合，當(dāng)有界面出現(xiàn)時(shí)，吸取分離膠表面的水分。 2）2.5%聚丙烯酰胺凝膠：按b:d:e:f=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于燒杯中，用滴管加到分離膠上面。 加入1cm高左右，加入一層薄水。烘箱，待第二次出現(xiàn)

34、界面，除去表面水分。 2.安裝膠管：把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔時(shí)用力不要過猛，以防使膠條受損），將膠管安裝在電泳儀上。 注意垂直，并要緊密，防止緩沖液從上槽漏下。 先向各膠管中加滿電極緩沖液，不要有氣泡留存，在向下槽注入緩沖液，然后將膠管下降至下槽緩沖液內(nèi)。3.加樣 ：0.5ml新鮮血清，用5ml 20%蔗糖溴酚藍(lán)溶液稀釋 。用微量注射器或移液槍向膠管內(nèi)加 20ul 樣品液，注意微量注射器或移液槍頭要插入膠管內(nèi)加液。4.電泳：上槽連接負(fù)極，下槽連接正極，然后通電，先每管電流 3ma 電泳，當(dāng)示蹤劑進(jìn)入分離膠時(shí)，電流增至每管 5ma 。 當(dāng)示蹤劑移至膠管下端 1cm 處時(shí)，關(guān)閉電源，取出膠管。

35、電泳大約 2-3 小時(shí)。5剝膠：取一只帶長針頭的注射器，灌滿水，將針頭從濃縮膠的一端小心的管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動(dòng)膠管，并同時(shí)推動(dòng)注射器，在針頭向前推動(dòng)時(shí)，注入蒸餾水，使膠條隨水的壓力及潤滑作用從玻璃管中脫離。6.染色及洗脫：a.將取下的膠條放入 12.5% 三氯醋酸中固定10min，用 1% 考馬斯亮藍(lán)水溶液染色 15min，7% 醋酸過夜保存。 b.將取下的膠條放入 7% 三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10b 染色15min，7%醋酸浸泡過夜。 注:染液回收7.觀察繪圖 ：將脫色膠條取出放于濾紙上，觀察分離色帶，將結(jié)果繪于實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上。注意事項(xiàng)1凝膠柱面應(yīng)平整，操作過程切勿產(chǎn)生氣泡，否則電

36、泳區(qū)帶不整齊。2電泳中電流應(yīng)保持穩(wěn)定，避免電流強(qiáng)度過高，而產(chǎn)生大量的熱使分離失敗。3電泳開始，樣品應(yīng)于5min10min內(nèi)進(jìn)入凝膠柱內(nèi)為佳。4所有玻璃管和綠套頭，在剝膠完畢后回收。所有乳膠帽，在膠凝固后都回收。5藥品大部分有毒，應(yīng)注意防護(hù)。思考題1、 溴酚藍(lán)的作用？（示蹤劑）2、 樣品中加入4%蔗糖的作用？（防止對流，蔗糖密度比較大，可以自然沉降）注：實(shí)訓(xùn)記錄圖片見附錄。報(bào)告5、超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)名稱超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)目的學(xué)習(xí)和掌握sod的生產(chǎn)的工作原理和基本操作技術(shù)。實(shí)訓(xùn)原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)，作為一種專一清除生物體內(nèi)超

37、氧陰離子自由基(o2-)的酶，催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，減少超氧陰離子自由基對生物體的毒害。sod的分類：1 銅和鋅型，稱為、-，是最常見的一種，動(dòng)物sod呈藍(lán)綠色，植物sod呈白色，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。2 錳，稱為-，呈粉紅色，主要存在于原核細(xì)胞體、真核細(xì)胞的細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)3 鐵，稱為-，呈黃褐色，主要存在于原核細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)原理（沉淀法)超氧化物歧化酶（sod）是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化氧負(fù)離子（o2-）進(jìn)行岐化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫：2o2- + h2 = o2 + h2o2 。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的sod，組織或細(xì)