法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作課件

1、法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作1 法醫(yī)病理學(xué)法醫(yī)病理學(xué) 組織切片制作組織切片制作 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作2 HE染色切片染色切片 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作3 一、目的要求一、目的要求 掌握取材、固定、水洗、脫水、透明、浸掌握取材、固定、水洗、脫水、透明、浸 蠟與包埋，切片制作。蠟與包埋，切片制作。 （一）取材（一）取材 1.1.取材快，新鮮，防止組織腐敗。取材快，新鮮，防止組織腐敗。 2.2.取材刀鋒利，垂直地切取，嚴(yán)禁擠壓或用鉗鑷取材刀鋒利，垂直地切取，嚴(yán)禁擠壓或用鉗鑷 鉗夾，以免使組織或細(xì)胞變形造成人為的破壞。鉗夾，以免使組織或細(xì)胞變形造成人為的破壞。 3.3.取材大小，取材大小，lcmlcm3cm

2、3cm1cm1cm2cm2cm0.3cm0.3cm 0.5cm0.5cm。材料過(guò)大在短時(shí)間內(nèi)不易固定透，影響。材料過(guò)大在短時(shí)間內(nèi)不易固定透，影響 效果。效果。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作4 （二）方法：（二）方法： 1. 1. 實(shí)質(zhì)器官實(shí)質(zhì)器官 心臟：心臟：心房、瓣膜、心室?？煞謩e取病變部位帶正常心房、瓣膜、心室。可分別取病變部位帶正常 組織?？蓡为?dú)取心室肌，乳頭肌，組織?？蓡为?dú)取心室肌，乳頭肌，3 35 5塊。塊。 肺臟：肺臟：左右兩肺（五個(gè)肺葉）；可根據(jù)病變需要決定左右兩肺（五個(gè)肺葉）；可根據(jù)病變需要決定 取材塊數(shù)，特殊情況下為區(qū)別在不同肺葉上取材，取材塊數(shù)，特殊情況下為區(qū)別在不同肺葉上取材，

3、 可用形狀做標(biāo)志在記錄時(shí)記清楚，可用形狀做標(biāo)志在記錄時(shí)記清楚，5 57 7塊。塊。 腎臟：腎臟：取材包括被膜、皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂，應(yīng)區(qū)別左取材包括被膜、皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂，應(yīng)區(qū)別左 右腎，右腎，2 24 4塊。塊。 胰腺：胰腺：取胰體部，必要時(shí)加取胰頭、胰尾，取胰體部，必要時(shí)加取胰頭、胰尾，2 2塊。塊。 肝臟：肝臟：取長(zhǎng)方形或三角形，取長(zhǎng)方形或三角形，2 23 3塊。塊。 脾臟：脾臟：取材帶被膜，取材帶被膜，2 23 3塊。塊。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作5 腦：腦：全腦（橋腦、延腦、小腦）、脊髓頸全腦（橋腦、延腦、小腦）、脊髓頸 段及脈絡(luò)叢，十一塊，或根據(jù)具體情況決定：段及脈絡(luò)叢，十一塊，或根據(jù)具

4、體情況決定： 額極；額極；前后中央回；前后中央回；海馬；海馬；內(nèi)囊；內(nèi)囊； 丘腦；丘腦；枕葉；枕葉；脈絡(luò)叢；脈絡(luò)叢；橋腦；橋腦；延延 髓；髓；中腦；中腦； 小腦。取材時(shí)要帶上軟腦小腦。取材時(shí)要帶上軟腦 膜、腦室膜或軟脊膜因此刀要鋒利。需要時(shí)膜、腦室膜或軟脊膜因此刀要鋒利。需要時(shí) 取脊髓。取脊髓。 垂體：垂體：前、中、后葉和垂體柄，從前向后前、中、后葉和垂體柄，從前向后 橫切。橫切。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作6 2 2管腔臟器：管腔臟器： 取材時(shí)注意方向，取管腔臟器的全層構(gòu)造。取材時(shí)注意方向，取管腔臟器的全層構(gòu)造。 大腸、小腸：大腸、小腸：應(yīng)考慮環(huán)行皺襞，沿腸管的長(zhǎng)軸取應(yīng)考慮環(huán)行皺襞，沿腸管的長(zhǎng)軸

5、取 （縱切）。（縱切）。 食管、氣管：食管、氣管：橫切面為宜。橫切面為宜。 胃：胃：常規(guī)取胃底。常規(guī)取胃底。 取材后應(yīng)將被膜面鋪在濾紙上，然后入固定液取材后應(yīng)將被膜面鋪在濾紙上，然后入固定液 內(nèi)，防止或減少組織受壓變形與收縮。內(nèi)，防止或減少組織受壓變形與收縮。 有病變的部位，應(yīng)附帶周圍正常組織取材。有病變的部位，應(yīng)附帶周圍正常組織取材。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作7 二、固定二、固定 （一）意義：（一）意義：是做好切片的重要步驟之一，如果是做好切片的重要步驟之一，如果 首次組織固定不良，再重新固定效果不佳。首次組織固定不良，再重新固定效果不佳。 檢材固定的關(guān)鍵：取材后盡可能地及時(shí)地將檢材固定的關(guān)鍵

6、：取材后盡可能地及時(shí)地將 所取的材料進(jìn)行固定，以防止其所取的材料進(jìn)行固定，以防止其“死后死后”變化的變化的 進(jìn)展，盡力使組織接近于生前狀態(tài)。為了防止組進(jìn)展，盡力使組織接近于生前狀態(tài)。為了防止組 織結(jié)構(gòu)及成份的破壞和溶解消失，需要使其轉(zhuǎn)變織結(jié)構(gòu)及成份的破壞和溶解消失，需要使其轉(zhuǎn)變 為不溶性物質(zhì)，有利于組織結(jié)構(gòu)保存為不溶性物質(zhì)，有利于組織結(jié)構(gòu)保存-固定的基固定的基 本意義。本意義。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作8 固定的目的：固定的目的： 1. 1. 阻止死后變化，防止組織的自溶與腐敗。阻止死后變化，防止組織的自溶與腐敗。 2 2保存組織的結(jié)構(gòu)及成份。保存組織的結(jié)構(gòu)及成份。 3 3媒染作用，使不同的組織

7、成份對(duì)染料有不同媒染作用，使不同的組織成份對(duì)染料有不同 親和力，使細(xì)胞各部易于受色。親和力，使細(xì)胞各部易于受色。 4 4能使組織硬化，為制作薄切片奠定基礎(chǔ)。能使組織硬化，為制作薄切片奠定基礎(chǔ)。 注意：注意：材料塊不能過(guò)大，固定器皿不易過(guò)小，固材料塊不能過(guò)大，固定器皿不易過(guò)小，固 定液量不易過(guò)少，應(yīng)是固定材料體積的定液量不易過(guò)少，應(yīng)是固定材料體積的2020 一一3030倍。倍。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作9 （二）固定液：（二）固定液： 根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同種類固定液，如糖原檢查：不含水的固根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同種類固定液，如糖原檢查：不含水的固 定液；電鏡檢查：鋨酸固定液等；定液；電鏡檢查：

8、鋨酸固定液等；HEHE染色：甲醛。染色：甲醛。 固定液：固定液：用以固定組織的藥劑。用以固定組織的藥劑。 固定液分類固定液分類：?jiǎn)渭児潭ㄒ?，由一種藥劑組成；混合固定液（或復(fù)合），：?jiǎn)渭児潭ㄒ?，由一種藥劑組成；混合固定液（或復(fù)合）， 由二種以上的藥劑組成。由二種以上的藥劑組成。 1 1選擇固定液的標(biāo)準(zhǔn)：選擇固定液的標(biāo)準(zhǔn)： 具有強(qiáng)的穿透力，固定均勻，能迅速滲透到組織內(nèi)部使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)的穿透力，固定均勻，能迅速滲透到組織內(nèi)部使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu) 保持生活狀態(tài)。保持生活狀態(tài)。 不使組織過(guò)度收縮與膨脹而變形。不使組織過(guò)度收縮與膨脹而變形。 能迅速使組織中的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等物質(zhì)凝固成為不溶性物質(zhì)。能迅速

9、使組織中的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等物質(zhì)凝固成為不溶性物質(zhì)。 使組織達(dá)到一定的硬度便于切片制作。使組織達(dá)到一定的硬度便于切片制作。 價(jià)格便宜，易價(jià)格便宜，易購(gòu)購(gòu)買，配制方便。買，配制方便。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作10 2單純固定液?jiǎn)渭児潭ㄒ?乙醇（酒精）、甲醛（福爾馬林）、重鉻酸鉀、苦味酸、鋨酸、丙酮、乙醇（酒精）、甲醛（福爾馬林）、重鉻酸鉀、苦味酸、鋨酸、丙酮、 冰醋酸冰醋酸 （1 1）乙醇（酒精）（）乙醇（酒精）（alcoholalcohol） 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 價(jià)格低，易購(gòu)買，易溶于水，使用方便，價(jià)格低，易購(gòu)買，易溶于水，使用方便，9595濃度，無(wú)水乙醇濃度，無(wú)水乙醇100100； 市售有兩種：市售

10、有兩種：100%100%；95%95%； 能硬化組織起固定作用；能硬化組織起固定作用； 也是一種最常用的脫水劑。也是一種最常用的脫水劑。 固定用濃度在固定用濃度在70708080，酒精濃度愈大組織收縮愈嚴(yán)重，濃度過(guò)低起，酒精濃度愈大組織收縮愈嚴(yán)重，濃度過(guò)低起 不到固定作用。不到固定作用。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 穿透力小，由于被固定的組織表面硬化，固定液不容易滲透到組織中去，穿透力小，由于被固定的組織表面硬化，固定液不容易滲透到組織中去， 所以用乙醇固定的組織材料要小。所以用乙醇固定的組織材料要小。 使組織嚴(yán)重收縮。使組織嚴(yán)重收縮。 由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白的沉淀物易溶于水，使由于酒

11、精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白的沉淀物易溶于水，使 細(xì)胞核核色不佳。細(xì)胞核核色不佳。 溶解脂肪、血紅蛋白和多種色素，脂肪染色必須制作冰凍切片。溶解脂肪、血紅蛋白和多種色素，脂肪染色必須制作冰凍切片。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作11 2 2甲醛：（福爾馬林）（甲醛：（福爾馬林）（formalinformalin） 最常用的固定液最常用的固定液，一種還原劑，無(wú)色透明極易揮發(fā)有強(qiáng)，一種還原劑，無(wú)色透明極易揮發(fā)有強(qiáng) 烈刺激性氣味的液體，不能與氧化劑混使用?？蓱?yīng)用于組織烈刺激性氣味的液體，不能與氧化劑混使用?？蓱?yīng)用于組織 學(xué)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等染色，最好用時(shí)現(xiàn)配。學(xué)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等染

12、色，最好用時(shí)現(xiàn)配。 商品甲醛：商品甲醛：37374040甲醛水溶液。甲醛水溶液。 固定液的濃度：固定液的濃度：4 48 8（習(xí)慣上稱為（習(xí)慣上稱為1010或或2020的福爾馬的福爾馬 林）。林）。 固定時(shí)間：固定時(shí)間：常溫下固定常溫下固定24h24h48h48h?？焖俟潭ǎ杉訙氐??？焖俟潭?，可加溫到 70708080或者加溫煮沸或者加溫煮沸10min10min即可?？焖俟潭ǎM織塊不宜即可?？焖俟潭?，組織塊不宜 過(guò)厚或過(guò)大，缺點(diǎn)是組織收縮較嚴(yán)重。過(guò)厚或過(guò)大，缺點(diǎn)是組織收縮較嚴(yán)重。 固定液配制：固定液配制：甲醛甲醛1 1份與份與9 9份自來(lái)水混合即為份自來(lái)水混合即為1010（4%4%）濃度）濃

13、度 的甲醛固定液。的甲醛固定液。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作12 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：滲透力較強(qiáng)；滲透力較強(qiáng)；組織收縮?。唤M織收縮??；細(xì)胞核染色較好。細(xì)胞核染色較好。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 質(zhì)量較差的質(zhì)量較差的formalinformalin在低溫下久存容易產(chǎn)生一種白色的沉在低溫下久存容易產(chǎn)生一種白色的沉 淀物稱淀物稱“三聚甲醛三聚甲醛”（付醛），經(jīng)氧化成為甲酸而使溶液呈（付醛），經(jīng)氧化成為甲酸而使溶液呈 酸性，影響細(xì)胞核染色?？稍趥溆眉兹┤芤褐蟹湃脒m量的碳酸性，影響細(xì)胞核染色?？稍趥溆眉兹┤芤褐蟹湃脒m量的碳 酸鈣或碳酸鎂，簡(jiǎn)便的辦法可在溶液中投入適量的大理石或酸鈣或碳酸鎂，簡(jiǎn)便的辦法可在溶液中投入適量的大理石或

14、 者白色粉筆作為中和劑。者白色粉筆作為中和劑。 酸性福爾馬林固定的組織多易產(chǎn)生一種褐色或黑色細(xì)顆粒酸性福爾馬林固定的組織多易產(chǎn)生一種褐色或黑色細(xì)顆粒 狀物，稱為福爾馬林色素，在切片上形成黑色小顆粒，不溶狀物，稱為福爾馬林色素，在切片上形成黑色小顆粒，不溶 于水和酒精，影響染色效果和切片的觀察。于水和酒精，影響染色效果和切片的觀察。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作13 去掉福爾馬林色素顆粒方法：去掉福爾馬林色素顆粒方法： Schridde法法 25氨水氨水 l ml 75酒精酒精 200 ml 切片脫蠟經(jīng)切片脫蠟經(jīng)70酒精時(shí)，用上液浸泡半小時(shí)或稍長(zhǎng)一酒精時(shí)，用上液浸泡半小時(shí)或稍長(zhǎng)一 些時(shí)間，然后水洗再行

15、染色。些時(shí)間，然后水洗再行染色。 Verocay法法 l氫氧化鉀水溶液氫氧化鉀水溶液 l ml 70酒精酒精 100 ml 切片脫蠟經(jīng)酒精切片脫蠟經(jīng)酒精80時(shí)入上液處理時(shí)入上液處理10分鐘，經(jīng)分鐘，經(jīng)70酒酒 精入水后即可染色。精入水后即可染色。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作14 （三）水洗（三）水洗 1.1.用水道流水洗滌，徹底清除組織塊中的固定液。用水道流水洗滌，徹底清除組織塊中的固定液。 2.2.水洗時(shí)間數(shù)小時(shí)至水洗時(shí)間數(shù)小時(shí)至2424小時(shí)。小時(shí)。 3.3.根據(jù)材料多少、大小可靈活掌握水洗工具，可用水洗根據(jù)材料多少、大小可靈活掌握水洗工具，可用水洗 筐或用紗布包裹，防止水流過(guò)大將組織塊沖掉或丟

16、失。筐或用紗布包裹，防止水流過(guò)大將組織塊沖掉或丟失。 ( (四四) )脫水脫水 組織塊固定后雖然已經(jīng)硬化，但達(dá)不到切薄片的硬度，組織塊固定后雖然已經(jīng)硬化，但達(dá)不到切薄片的硬度， 必須制成石蠟組織塊，脫水是繼固定后的重要步驟。必須制成石蠟組織塊，脫水是繼固定后的重要步驟。 經(jīng)固定和水洗后的組織含大量水分，在這種情況下首先經(jīng)固定和水洗后的組織含大量水分，在這種情況下首先 必須除去組織內(nèi)部的水分，這種除水的過(guò)程叫做脫水，脫必須除去組織內(nèi)部的水分，這種除水的過(guò)程叫做脫水，脫 水使用的藥劑稱為脫水劑。水使用的藥劑稱為脫水劑。 脫水必須逐漸依次從低濃度酒開(kāi)始到高濃度酒，否則引脫水必須逐漸依次從低濃度酒開(kāi)始

17、到高濃度酒，否則引 起組織強(qiáng)烈收縮，變脆不利制片。脫水不徹底也很難浸進(jìn)起組織強(qiáng)烈收縮，變脆不利制片。脫水不徹底也很難浸進(jìn) 石蠟。石蠟。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作15 常用脫水劑：常用脫水劑：溶于水和透明劑的試劑，如酒精、丙酮、正丁醇溶于水和透明劑的試劑，如酒精、丙酮、正丁醇 等。等。 （1 1）酒精）酒精 步驟：步驟：7070 8080 9090 9595 100100 100100，一般數(shù)小時(shí)到，一般數(shù)小時(shí)到1212小時(shí)，更換一次酒精。小時(shí)，更換一次酒精。 配低濃度酒精時(shí)，可用市售配低濃度酒精時(shí)，可用市售9595酒精配制。酒精配制。7070酒精：酒精：9595 酒精酒精70ml70ml加蒸餾水

18、加蒸餾水25ml25ml至至95ml95ml；8080酒精：酒精：9595酒精酒精80ml80ml 加蒸餾水至加蒸餾水至95ml95ml，依次類推。，依次類推。 （2 2）丙酮）丙酮 脫水作用與酒精相似，雖其脫水作用比酒精強(qiáng)，但可引脫水作用與酒精相似，雖其脫水作用比酒精強(qiáng)，但可引 起組織塊的收縮較，價(jià)錢較貴，故不宜用于一般組織脫水，起組織塊的收縮較，價(jià)錢較貴，故不宜用于一般組織脫水， 它即有脫水作用又有透明作用，用丙酮固定的材料要小，脫它即有脫水作用又有透明作用，用丙酮固定的材料要小，脫 水水1 18 8小時(shí)即可。小時(shí)即可。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作16 （五）透明（五）透明 目的：目的：因?yàn)榫?/p>

19、精與蠟不能相交換需要借助石蠟誘導(dǎo)劑的媒介作因?yàn)榫凭c蠟不能相交換需要借助石蠟誘導(dǎo)劑的媒介作 用。石蠟誘導(dǎo)劑滲入之后組織塊往往呈現(xiàn)透明狀態(tài)，習(xí)慣上將用。石蠟誘導(dǎo)劑滲入之后組織塊往往呈現(xiàn)透明狀態(tài)，習(xí)慣上將 石蠟誘導(dǎo)劑滲入組織內(nèi)的過(guò)程叫透明，用于透明的試劑稱為透石蠟誘導(dǎo)劑滲入組織內(nèi)的過(guò)程叫透明，用于透明的試劑稱為透 明劑。明劑。 透明時(shí)間：透明時(shí)間：根據(jù)組織塊的大小而定，根據(jù)組織塊的大小而定，一般一般2020分鐘至分鐘至1 1小時(shí)小時(shí)。組織。組織 塊過(guò)大可延長(zhǎng)透明時(shí)間，透明好的材料如同油炸的感覺(jué)呈透明塊過(guò)大可延長(zhǎng)透明時(shí)間，透明好的材料如同油炸的感覺(jué)呈透明 狀。狀。 透明劑：透明劑：二甲苯、氯仿、甲苯

20、、香柏油等。二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。最常用二甲苯最常用二甲苯。 二甲苯：二甲苯：無(wú)色透明有機(jī)溶媒，有很強(qiáng)的刺激氣味，易揮發(fā)，無(wú)色透明有機(jī)溶媒，有很強(qiáng)的刺激氣味，易揮發(fā)， 長(zhǎng)期接觸對(duì)粘膜有刺激作用，透明作用很強(qiáng)，可使組織收縮變長(zhǎng)期接觸對(duì)粘膜有刺激作用，透明作用很強(qiáng)，可使組織收縮變 形，透明時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。如遇到組織塊內(nèi)部或某一個(gè)部位呈白形，透明時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。如遇到組織塊內(nèi)部或某一個(gè)部位呈白 色混濁狀態(tài)時(shí)說(shuō)明脫水不徹底，如果造成透明不徹底應(yīng)退回到色混濁狀態(tài)時(shí)說(shuō)明脫水不徹底，如果造成透明不徹底應(yīng)退回到 100100酒精中重新透明。酒精中重新透明。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作17 六、浸蠟與包理：六、

21、浸蠟與包理： 浸蠟的目的：浸蠟的目的：為了能制作薄切片做準(zhǔn)備，將透明為了能制作薄切片做準(zhǔn)備，將透明 好的組織塊浸到融化的石蠟中，使石蠟滲透到組好的組織塊浸到融化的石蠟中，使石蠟滲透到組 織細(xì)胞內(nèi)，將組織細(xì)胞內(nèi)的二甲苯完全徹底地取織細(xì)胞內(nèi)，將組織細(xì)胞內(nèi)的二甲苯完全徹底地取 代出來(lái)，再用石蠟將組織包埋，冷卻后，切成小代出來(lái)，再用石蠟將組織包埋，冷卻后，切成小 塊，修整好切面，這一過(guò)程為浸蠟與包埋。塊，修整好切面，這一過(guò)程為浸蠟與包埋。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作18 具體操作：具體操作： （一）浸蠟（一）浸蠟 石蠟箱溫度石蠟箱溫度5860左右，內(nèi)有標(biāo)明左右，內(nèi)有標(biāo)明、的蠟杯的蠟杯 或蠟缸，從透明的二甲

22、苯或蠟缸，從透明的二甲苯取出組織塊，放入取出組織塊，放入號(hào)蠟杯中號(hào)蠟杯中 2h3h，再將組織塊移入，再將組織塊移入號(hào)蠟杯（純蠟）號(hào)蠟杯（純蠟）2h4h，再，再 移入移入號(hào)蠟杯中（純蠟）半天或者稍降蠟箱溫度過(guò)夜，最號(hào)蠟杯中（純蠟）半天或者稍降蠟箱溫度過(guò)夜，最 后用融化的純蠟作為包埋用的蠟。后用融化的純蠟作為包埋用的蠟。 注意：注意：浸蠟時(shí)蠟杯不要顛倒順序使用，以免脫二甲浸蠟時(shí)蠟杯不要顛倒順序使用，以免脫二甲 苯不徹底。如遇特殊情況需要延長(zhǎng)浸蠟時(shí)間時(shí)可降低蠟箱苯不徹底。如遇特殊情況需要延長(zhǎng)浸蠟時(shí)間時(shí)可降低蠟箱 溫度或關(guān)閉蠟箱，需要時(shí)再開(kāi)。溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)組織溫度或關(guān)閉蠟箱，需要時(shí)再開(kāi)。溫度越高，

23、時(shí)間越長(zhǎng)組織 塊收縮越嚴(yán)重，而且材料脆而不易制作切片。塊收縮越嚴(yán)重，而且材料脆而不易制作切片。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作19 （二）包埋：（二）包埋： 包埋方法：包埋方法：石蠟包埋法、火棉膠包埋法、炭蠟包埋法、明膠石蠟包埋法、火棉膠包埋法、炭蠟包埋法、明膠 包埋法、環(huán)氧樹(shù)脂包埋法（電鏡用）等。包埋法、環(huán)氧樹(shù)脂包埋法（電鏡用）等。 步驟：純石蠟溶解后（步驟：純石蠟溶解后（60）倒入包埋框內(nèi)或紙盒內(nèi)，迅速）倒入包埋框內(nèi)或紙盒內(nèi)，迅速 將浸好的組織塊的切面向下、放平，依次擺入框內(nèi)，待蠟逐將浸好的組織塊的切面向下、放平，依次擺入框內(nèi)，待蠟逐 漸冷卻凝固后，將組織材料凝結(jié)在石蠟內(nèi)。然后按組織塊大漸冷卻凝固

24、后，將組織材料凝結(jié)在石蠟內(nèi)。然后按組織塊大 小切成蠟塊，組織四周蠟邊留小切成蠟塊，組織四周蠟邊留0.1厘米左右即可。厘米左右即可。 注意：注意：如果操作不熟練或在冬天包埋時(shí)最好用酒精燈。在材如果操作不熟練或在冬天包埋時(shí)最好用酒精燈。在材 料包入石蠟之前，稍在酒精燈上過(guò)一下加溫，以免材料與包料包入石蠟之前，稍在酒精燈上過(guò)一下加溫，以免材料與包 埋蠟溫度不符造成材料與包埋蠟間遺留縫隙，切片時(shí)產(chǎn)生分埋蠟溫度不符造成材料與包埋蠟間遺留縫隙，切片時(shí)產(chǎn)生分 離現(xiàn)象。離現(xiàn)象。 蠟塊背面要標(biāo)記例號(hào)等字樣的紙片，以長(zhǎng)期保存。切完蠟塊背面要標(biāo)記例號(hào)等字樣的紙片，以長(zhǎng)期保存。切完 的蠟塊表面要用燙片板，燙一下封閉材

25、料面，隔離空氣接觸的蠟塊表面要用燙片板，燙一下封閉材料面，隔離空氣接觸 可長(zhǎng)期保存材料不干。可長(zhǎng)期保存材料不干。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作20 （三）蠟的種類：（三）蠟的種類： 1蜂蠟：是動(dòng)物體內(nèi)提取的蠟，顏色微黃故也稱為黃蠟，蜂蠟：是動(dòng)物體內(nèi)提取的蠟，顏色微黃故也稱為黃蠟， 溶點(diǎn)在溶點(diǎn)在54左右。特點(diǎn)是潤(rùn)滑帶有粘性，冬天用量比夏天左右。特點(diǎn)是潤(rùn)滑帶有粘性，冬天用量比夏天 多。多。 2石蠟：是由礦物質(zhì)中提取，質(zhì)地較疏松，色白。根據(jù)蠟石蠟：是由礦物質(zhì)中提取，質(zhì)地較疏松，色白。根據(jù)蠟 的溶點(diǎn)不同又可分為軟蠟及硬蠟。的溶點(diǎn)不同又可分為軟蠟及硬蠟。 軟蠟：軟蠟：50以下的石蠟。硬蠟：溶點(diǎn)在以下的石蠟。硬

26、蠟：溶點(diǎn)在50以上的石蠟。以上的石蠟。 兩種蠟可以混合在一起使用。石蠟熔點(diǎn)有兩種蠟可以混合在一起使用。石蠟熔點(diǎn)有5254， 5658，5860，6062。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作21 七、切片七、切片 工具：工具：切片刀、磨刀機(jī)、切片機(jī)、水浴鍋，干燥箱等；載切片刀、磨刀機(jī)、切片機(jī)、水浴鍋，干燥箱等；載 薄片、手術(shù)刀、毛筆、彎鑷子、托盤(pán)、大平皿（展片使薄片、手術(shù)刀、毛筆、彎鑷子、托盤(pán)、大平皿（展片使 用）、烤片盒、蛋白甘油等。用）、烤片盒、蛋白甘油等。 （一）切片機(jī)種類：（一）切片機(jī)種類：輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、滑行式切片機(jī)（滑動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、滑行式切片機(jī)（滑動(dòng) 式）、冰凍切片機(jī)、超薄切片機(jī)等（電鏡用）。

27、式）、冰凍切片機(jī)、超薄切片機(jī)等（電鏡用）。 （二）構(gòu)造：（二）構(gòu)造：由四個(gè)基本部分組成：刀臺(tái)、標(biāo)本臺(tái)、旋轉(zhuǎn)由四個(gè)基本部分組成：刀臺(tái)、標(biāo)本臺(tái)、旋轉(zhuǎn) 輪、控制切片厚度的微動(dòng)裝置（標(biāo)有輪、控制切片厚度的微動(dòng)裝置（標(biāo)有 l25或或150的數(shù)字，的數(shù)字， 每一數(shù)字代表一個(gè)微米）。根據(jù)需要調(diào)節(jié)厚度，每一數(shù)字代表一個(gè)微米）。根據(jù)需要調(diào)節(jié)厚度，一般采用一般采用 5m7m。 蛋白甘油：蛋白甘油：用雞蛋清（不要雞蛋黃）用玻璃棒充分?jǐn)嚢韬笥秒u蛋清（不要雞蛋黃）用玻璃棒充分?jǐn)嚢韬?用數(shù)層紗布過(guò)濾后加等量的甘油攪均勻加數(shù)顆麝香草酚。用數(shù)層紗布過(guò)濾后加等量的甘油攪均勻加數(shù)顆麝香草酚。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作22 （三）切

28、片制作（三）切片制作 1將潔凈的載薄片涂薄層蛋白甘油放人烤片盒內(nèi)待用。將潔凈的載薄片涂薄層蛋白甘油放人烤片盒內(nèi)待用。 2將切割修整好的蠟塊用普通刀片先將蠟塊的組織切面暴露將切割修整好的蠟塊用普通刀片先將蠟塊的組織切面暴露 出來(lái)修平，固定在切片機(jī)上的標(biāo)本臺(tái)上并擰緊螺旋。出來(lái)修平，固定在切片機(jī)上的標(biāo)本臺(tái)上并擰緊螺旋。 3蠟塊先固定在標(biāo)本臺(tái)上切片刀固定于刀臺(tái)上，擰緊固定刀蠟塊先固定在標(biāo)本臺(tái)上切片刀固定于刀臺(tái)上，擰緊固定刀 的螺絲同時(shí)調(diào)整刀與蠟塊的切片距離使刀與蠟塊貼緊后再固定的螺絲同時(shí)調(diào)整刀與蠟塊的切片距離使刀與蠟塊貼緊后再固定 刀臺(tái)螺絲，刀的角度為刀臺(tái)螺絲，刀的角度為25度角。度角。 4調(diào)節(jié)微動(dòng)裝

29、置，調(diào)至切片所需厚度（一般為調(diào)節(jié)微動(dòng)裝置，調(diào)至切片所需厚度（一般為 5m7m）。）。 5修材。右手握旋轉(zhuǎn)輪搖把按順時(shí)針?lè)较蚓鶆虻負(fù)u動(dòng)直到組修材。右手握旋轉(zhuǎn)輪搖把按順時(shí)針?lè)较蚓鶆虻負(fù)u動(dòng)直到組 織塊切面完整暴露為止?？棄K切面完整暴露為止。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作23 （四）展片（四）展片 水浴鍋上平皿內(nèi)水溫升至水浴鍋上平皿內(nèi)水溫升至45左右，將已切好的連續(xù)左右，將已切好的連續(xù) 薄片切分成數(shù)片，放在水面，輕漂，水中展平，未展平時(shí)薄片切分成數(shù)片，放在水面，輕漂，水中展平，未展平時(shí) 可用小彎鑷子輕輕展開(kāi)，然后用涂有蛋白甘油的載片在水可用小彎鑷子輕輕展開(kāi)，然后用涂有蛋白甘油的載片在水 中選擇完整的切片進(jìn)行

30、撈片。中選擇完整的切片進(jìn)行撈片。 （五）注意事項(xiàng)（五）注意事項(xiàng) 1切片刀要鋒利，否則切片有切痕或組織破碎，甚至不能切片刀要鋒利，否則切片有切痕或組織破碎，甚至不能 制成切片。制成切片。 2展切片時(shí)水溫要適當(dāng)，水溫低，展不平切片，切片有皺展切片時(shí)水溫要適當(dāng)，水溫低，展不平切片，切片有皺 折，影響效果；如果水溫過(guò)高，切片入水后可發(fā)生溶化折，影響效果；如果水溫過(guò)高，切片入水后可發(fā)生溶化。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作24 實(shí)習(xí)四法醫(yī)病理學(xué)實(shí)習(xí)四法醫(yī)病理學(xué) 組織切片染色組織切片染色 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作25 目的要求：目的要求：掌握切片染色、封片等技術(shù)及操作過(guò)程。掌握切片染色、封片等技術(shù)及操作過(guò)程。 一、

31、染色前準(zhǔn)備工作一、染色前準(zhǔn)備工作 1染色：準(zhǔn)備的工具：染色缸或者染色：準(zhǔn)備的工具：染色缸或者12個(gè)盛各種不同濃度的個(gè)盛各種不同濃度的 酒精染色筐廣口瓶，染色缸及脫蠟、透明用的各二個(gè)二甲苯酒精染色筐廣口瓶，染色缸及脫蠟、透明用的各二個(gè)二甲苯 染色缸，蓋片，帶磨口蓋樹(shù)膠瓶一個(gè)，鑷子染色缸，蓋片，帶磨口蓋樹(shù)膠瓶一個(gè)，鑷子1把。把。 2染色需要的試劑及染色液的配制：染色需要的試劑及染色液的配制： 0.51鹽酸鹽酸酒精：酒精：用于細(xì)胞核染色分色。用于細(xì)胞核染色分色。 配制：配制：100ml的的7080酒精中加人酒精中加人0.5ml或者或者1ml的濃的濃 鹽酸。鹽酸。 蘇木素（蘇木素（hematoxyli

32、n）及伊紅（）及伊紅（eosin） 蘇木素：蘇木素：細(xì)胞核的染料，氧化后的蘇木素具有染色能力細(xì)胞核的染料，氧化后的蘇木素具有染色能力 的。蘇木素的配方：二種，一是自然氧化的蘇木素；二是加的。蘇木素的配方：二種，一是自然氧化的蘇木素；二是加 入氧化劑加速氧化的。入氧化劑加速氧化的。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作26 3蘇木素的配方蘇木素的配方 自然氧化（自然氧化（Ehrlieh）蘇木素：）蘇木素： 蘇木精蘇木精 2g 銨明礬銨明礬 3g 無(wú)水酒精無(wú)水酒精 100ml 甘油甘油 100ml 蒸餾水蒸餾水 100ml 將上述藥品配在一起后裝入玻璃瓶中，瓶口罩上數(shù)將上述藥品配在一起后裝入玻璃瓶中，瓶口罩上數(shù)

33、 層紗布以防灰塵落入染液，暴露于陽(yáng)光中或空氣中自然層紗布以防灰塵落入染液，暴露于陽(yáng)光中或空氣中自然 氧化（成熟過(guò)程），約氧化（成熟過(guò)程），約6周周8周以上，染液配制越久其周以上，染液配制越久其 染色能力越強(qiáng)，可以一次大量配制以備用。染色能力越強(qiáng)，可以一次大量配制以備用。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作27 自然氧化（自然氧化（Delafield）蘇木素：）蘇木素： 蘇木素蘇木素 4g 無(wú)水酒精無(wú)水酒精 25ml 銨明礬飽和水溶液銨明礬飽和水溶液 400ml 銨明礬飽和水溶液配法：銨明礬飽和水溶液配法：10銨明礬水溶液，或銨明礬水溶液，或1份銨明份銨明 礬加蒸餾水礬加蒸餾水11份。份。 配制過(guò)程：配制過(guò)

34、程：蘇木素溶入酒精后，加入銨明礬液，倒入玻蘇木素溶入酒精后，加入銨明礬液，倒入玻 璃瓶中敞開(kāi)瓶口，罩以數(shù)層紗布，置光線充足處璃瓶中敞開(kāi)瓶口，罩以數(shù)層紗布，置光線充足處3 5天天 后過(guò)濾，再加入后過(guò)濾，再加入甘油甘油100ml、甲醇甲醇100ml。置光線充足處。置光線充足處 經(jīng)經(jīng)l.52個(gè)月后成熟。染液可保存多年，染色時(shí)多采用蒸個(gè)月后成熟。染液可保存多年，染色時(shí)多采用蒸 餾水稀釋的染色液。餾水稀釋的染色液。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作28 加氧化劑的蘇木素配制加氧化劑的蘇木素配制 Harris蘇木素：蘇木素： 液液 蘇木精蘇木精 l g 無(wú)水酒精無(wú)水酒精 10 ml 液液 鉀（銨）明礬鉀（銨）明礬

35、20 g 蒸餾水蒸餾水 200 ml 氧化汞氧化汞 0.5 g 冰醋酸冰醋酸 8 ml 配制方法：配制方法：先將先將液用玻璃棒攪拌使蘇木素溶解，再將液用玻璃棒攪拌使蘇木素溶解，再將 液煮沸溶化去火，速加入液煮沸溶化去火，速加入液，再加火，煮沸后去火，立液，再加火，煮沸后去火，立 即加入氧化汞即加入氧化汞0.5g，再煮沸，迅速冷卻后加入冰醋酸，再煮沸，迅速冷卻后加入冰醋酸8ml過(guò)過(guò) 濾使用，組織學(xué)常用染色液。濾使用，組織學(xué)常用染色液。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作29 4伊紅（伊紅（eosin） 最常用的細(xì)胞質(zhì)染料之一，外觀為紅色粉末。分兩種：最常用的細(xì)胞質(zhì)染料之一，外觀為紅色粉末。分兩種： 酒溶性伊

36、紅；水溶性伊紅酒溶性伊紅；水溶性伊紅。 配法：配法：0.5水溶性伊紅水溶性伊紅 伊紅伊紅0.5g+蒸餾水蒸餾水100ml，溶解后使用。，溶解后使用。 0.5酒精溶性伊紅酒精溶性伊紅 伊紅伊紅0.5g+70酒精酒精100ml，溶解后使用。，溶解后使用。 一般病理組織學(xué)切片染色，染細(xì)胞核用蘇木素，染細(xì)一般病理組織學(xué)切片染色，染細(xì)胞核用蘇木素，染細(xì) 胞質(zhì)用伊紅，故一般稱這種染色法為胞質(zhì)用伊紅，故一般稱這種染色法為HE染色（蘇木素染色（蘇木素伊伊 紅染色法）。紅染色法）。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作30 二、染色方法及步驟二、染色方法及步驟 1. 脫蠟：二甲苯脫蠟：二甲苯10min20min；二甲苯；二甲

37、苯10min 20min。 2脫苯：脫苯：100無(wú)水乙醇脫苯無(wú)水乙醇脫苯2min5min；100無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇2min 5min。 3水化：水化：95酒精酒精90酒精酒精80酒精酒精70酒精各數(shù)秒至酒精各數(shù)秒至 1min，水，水 浸洗數(shù)分鐘。浸洗數(shù)分鐘。 4染細(xì)胞核：切片移入蘇木素染液中染染細(xì)胞核：切片移入蘇木素染液中染10min20min。 5水洗（水洗一下將浮在表面的染液去掉）。水洗（水洗一下將浮在表面的染液去掉）。 6分化：分化：l鹽酸酒精分化時(shí)間數(shù)秒鐘，觀察切片組織材料呈粉紅色。鹽酸酒精分化時(shí)間數(shù)秒鐘，觀察切片組織材料呈粉紅色。 7水洗：水道流水洗水洗：水道流水洗0.5數(shù)小時(shí)，切片從

38、粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r艷的藍(lán)色（藍(lán)數(shù)小時(shí)，切片從粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r艷的藍(lán)色（藍(lán) 化過(guò)程）。化過(guò)程）。 8染細(xì)胞質(zhì)：染細(xì)胞質(zhì)：0.5或或l伊紅溶液復(fù)染伊紅溶液復(fù)染1min5min。 9脫水：切片脫水由低濃度酒到高濃度酒精。將切片入脫水：切片脫水由低濃度酒到高濃度酒精。將切片入70酒精酒精80 9095。切片在酒精內(nèi)幾秒鐘，時(shí)間長(zhǎng)，伊紅易脫色。應(yīng)注意。切片在酒精內(nèi)幾秒鐘，時(shí)間長(zhǎng)，伊紅易脫色。應(yīng)注意 伊紅與蘇木素的對(duì)比染色的色調(diào)適合。伊紅與蘇木素的對(duì)比染色的色調(diào)適合。 10. 脫水：脫水：100酒精酒精5min10min；100酒精酒精 5min10min 11. 透明：入二甲苯透明：入二甲苯2min5min；

39、二甲苯；二甲苯2min5min。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作31 三、封片與染色結(jié)果三、封片與染色結(jié)果 用中性樹(shù)膠進(jìn)行封固切片，細(xì)胞核經(jīng)蘇木素染成鮮艷用中性樹(shù)膠進(jìn)行封固切片，細(xì)胞核經(jīng)蘇木素染成鮮艷 的藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)核仁、肌纖維、膠原纖維、紅細(xì)胞等呈紅的藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)核仁、肌纖維、膠原纖維、紅細(xì)胞等呈紅 色。色。 HE染色簡(jiǎn)化程序：（脫蠟、水化）二甲苯染色簡(jiǎn)化程序：（脫蠟、水化）二甲苯二甲苯二甲苯 無(wú)水酒精無(wú)水酒精無(wú)水酒精無(wú)水酒精95908070 水洗水洗蘇木素染色（染細(xì)胞核）（蘇木素染色（染細(xì)胞核）（10min20min）自來(lái)自來(lái) 水洗一下水洗一下1鹽酸酒精分化鹽酸酒精分化自來(lái)水洗（核分化）自來(lái)水洗（

40、核分化）伊紅伊紅 染色（染細(xì)胞質(zhì)）染色（染細(xì)胞質(zhì)）直接脫水直接脫水70809095（各（各 稍停片刻）稍停片刻）100100（徹底脫水）（徹底脫水） 透明，二透明，二 甲苯甲苯二甲苯二甲苯，中性樹(shù)膠封片。，中性樹(shù)膠封片。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作32 常規(guī)涂片染色的操作方法：常規(guī)涂片染色的操作方法： 基本與石蠟切片染色程序一樣。基本與石蠟切片染色程序一樣。 不同點(diǎn)：固定液不同，操作時(shí)間短。不同點(diǎn)：固定液不同，操作時(shí)間短。 步驟：步驟：涂片自然干燥或加溫干燥后甲醇固定，待固定液干燥涂片自然干燥或加溫干燥后甲醇固定，待固定液干燥 后，蘇木素染色后，蘇木素染色2min5min水洗一下去浮色水洗一下去浮色1鹽酸酒鹽酸酒 精分化（浸精分化（浸12次）次）流水洗切片（流水洗切片（5min以上）。以上）。 伊紅染色伊紅染色2min5min脫水：脫水：70酒精酒精809095 各數(shù)秒，各數(shù)秒，100100各稍停片刻（徹底脫水）各稍停片刻（徹底脫水）透透 明：二甲苯明：二甲苯二甲苯二甲苯，中性樹(shù)膠封片。，中性樹(shù)膠封片。 法醫(yī)病理學(xué)組織切片制作33 四、兩種常用的特殊染色方法四、兩種常用的特殊染色方法 （一）（一）Mallory染色染色 配方：配方： 酸性復(fù)紅酸性復(fù)紅 3克克 苯胺蘭苯胺蘭 1克克 桔黃桔黃G 3克克 磷鉬酸磷鉬酸 1克克 蒸餾水蒸餾水 200ml 法醫(yī)病理學(xué)組