IRF9下調SIRT1在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究

1、IRF9下調SIRT1在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究1. 引言急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是由胰腺的急性炎癥所引發(fā)的一種疾病。該病在臨床上常見，國內外均報道具有很高的發(fā)病率和死亡率，發(fā)病過程中涉及多器官功能紊亂及細胞因子釋放增加1,2。近年來AP的發(fā)病率呈升高趨勢3，約20%30%的AP患者可發(fā)展為SAP。該病死亡率高達15%30%，導致局部及全身并發(fā)癥，且預后不良，嚴重威脅到人類生命健康4,5。AP6的起源被認為是胰腺腺泡細胞，發(fā)病原因是過度激活的胞內胰蛋白酶原轉化為胰蛋白酶消化胰腺組織，胰腺水腫或壞死而致胰腺炎。1896年，Chiari7發(fā)現(xiàn)十二指腸中的

2、胰蛋白酶可活化為胰蛋白酶而激活其他酶，以此提出酶過早激活消化胰腺的概念。敲除胰蛋白酶原7基因的小鼠被用來研究蛋白酶原的作用，該類小鼠早期腺泡內胰蛋白酶原的激活功能病理學缺失。該類小鼠對于研究胰蛋白酶原的激活可影響胰腺損傷過程。該小鼠與雨蛙素AP小鼠相比8，細胞死亡數(shù)明顯降低、腺泡壞死率降低50%。腺泡細胞的死亡與腺泡內胰蛋白酶原的活化有不可分割的作用，但該實驗卻缺乏腺病毒介導的活化胰蛋白酶在腺泡內表達引發(fā)小鼠的胰腺炎的機制說明。還有實驗研究9顯示，腺泡細胞的死亡，與腺病毒介導的活化胰蛋白酶原的表達具有重要聯(lián)系，但其中的機制模糊不清。IRF(interferon regulatory facto

3、r)對病毒誘導的IFN-和IFN-基因表達具有調節(jié)作用。后來發(fā)現(xiàn)IRF還能調控II型和III型干擾素基因的表達。迄今為止，已經發(fā)現(xiàn)了9種IRF：IRF1910。在過去數(shù)十年里，有足夠多的的實驗證明10,11,12,13顯示IRF對轉錄調控、免疫調控、細胞因子信號轉導、自穩(wěn)平衡等多方面發(fā)揮著不可替代的作用。IRF參與多種疾病的發(fā)生過程，包括炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、干燥癥以及腫瘤發(fā)生及心血管疾病等10,11,14,15,16。IRF9是干擾素刺激基因因子3的組成部分，參與啟動多個干擾素刺激基因，產生抗病毒應答作用。它在治療疾病、病原體分離中具有十分重要的作用，但目前對于其功能機

4、制研究，僅局限于STAT1和STAT2。對于其對轉錄、翻譯的調控機制以及促進和減少炎癥功能可作為未來研究方向。此外亦有研究證明17，c-Myc原癌基因上調了IRF9的表達，表明在腫瘤發(fā)生中有IRF9的參與作用。IRF9可在胰島素分泌以及損傷修復中發(fā)揮重要作用，但是其在AP的發(fā)揮的作用和機制暫未見相關文獻報道。SIRT1是sirtuin家族蛋白之一，是依賴于NAD+的HDAC，主要位于細胞核內。近期有文獻報道在急性胰腺炎小鼠模型中，SIRT1的表達顯著下調，乙酰化酶活性下降，p53及NF-B的?；皆黾?。SIRT1的敲低誘導了炎癥反應及細胞死亡，加重胰腺炎病程18。近年來有文獻報道IRF9能夠

5、直接下調組蛋白去乙酰化酶SIRT1的表達，抑制SIRT1的去乙酰化酶活性，增加下游靶蛋白，例如p53，NF-B等蛋白的乙酰化水平，從而參與炎癥反應、細胞凋亡、增殖以及遷移等過程19,20,21,22,23,24,25。例如，在AML患者中，IRF9表達下調，SIRT1表達上調，p53乙?；较陆登蚁掠伟谢虻谋磉_下調；敲低IRF9能夠上調SIRT1的表達，促進細胞克隆、增殖形成；過表達IRF9則有著相反的結果。IRF9是SIRT1的一個負調節(jié)因子，能夠靶向下調SIRT1的表達，增加p53的乙?；?，促進p53靶基因的表達，阻制細胞生長，誘導細胞凋亡，阻止AML的進一步發(fā)展25。因此IRF9

6、靶向下調SIRT1參與了細胞死亡、繁殖、遷移以及炎癥反應等過程，調節(jié)著多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在急性胰腺炎中，IRF9是否通過下調SIRT1的表達來調節(jié)細胞凋亡、增殖和遷移等過程，進一步影響細胞內炎癥反應，國內外未見相關報道。本實驗內容在于探究IRF9基因在AP中所起的效用，研究可能存在的分子機制。故本實驗將大鼠AR42J胰腺腺泡細胞系作為研究對象,選用雨蛙素誘導AR42J胰腺腺泡細胞，結合qRT-PCR、Western Blot、流式細胞術、MTT法、Transwell等手段，敲低IRF9后檢測SIRT1、p53及乙?；疨53水平，檢測細胞凋亡、增殖及遷移等情況，進一步探討IRF9靶向下調S

7、IRT1在AP的發(fā)生發(fā)展中的分子機制，通過對靶基因功能的理解,對疾病診斷和治療提供理論指導。2. 材料與方法2.1. 材料2.1.1.主要儀器與試劑主要儀器及試劑生產公司AR42J大鼠胰腺腺泡細胞系上海富衡細胞庫IRF9抗體proteintechSIRT1抗體 AbcamP53抗體、Ace-P53prproteintechRIPA裂解液谷歌生物山羊抗小鼠及山羊抗兔Ig G谷歌生物一抗、一抗稀釋液谷歌生物胰酶谷歌生物PCR試劑盒寶日醫(yī)生物si-RNA（IRF9沉默）上海生工PVDF膜MilliporeTRIzolAmbion逆轉錄試劑盒寶日醫(yī)生物雨蛙肽北京索萊寶BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天SD

8、S-PAGE凝膠配置試劑盒碧云天蛋白上樣緩沖液碧云天培養(yǎng)基HyCloneOpti-MEM(x1）、Lipofectamine 2000Life TechnologyELISA試劑盒武漢基因美生物DMSO、MTT檢測試劑盒塞維爾流式細胞凋亡試劑盒試劑盒上海七海復泰生物上海七海復泰生物離心機、移液器EppendorfCytoFLEX流式細胞儀BECKMAN 恒溫培養(yǎng)箱SHELLAB顯微鏡上海精密科學儀器公司酶標儀上海儀器公司恒溫金屬浴天力醫(yī)療器械PCR擴增儀ABIWestern Blot電泳儀上海天能2.2. 方法2.2.1. 細胞培養(yǎng):培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基100：胎牛血清10：青鏈霉素1），培

9、養(yǎng)箱環(huán)境為37、5%CO2，2天更換培養(yǎng)基一次。1） 驗收：在超凈臺中嚴格無菌操作，靜置2h，而后鏡下觀察，以80%匯合度為界限，未達到80%需要去除舊培養(yǎng)基添加新鮮培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。2） 復蘇：取出凍存的細胞，迅速于37水浴鍋中搖晃解凍，超凈臺中移入離心管并加入5ml培養(yǎng)基，以1000r/min離心5min，于超凈臺中倒出上清液，而后添加6ml新培養(yǎng)基，輕輕吹打制造細胞懸液，而后移入培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，視細胞狀態(tài)，考慮傳代。3）傳代：按如下步驟進行傳代：4）凍存：收集狀態(tài)良好的細胞（細胞匯合度達到80%），離心除去舊培養(yǎng)基，用含10%DMSO的血清使細胞重懸，同時轉存凍存管中病加入

10、細胞凍存液（含異丙醇），在-80穩(wěn)定凍存，或移入液氮罐凍存。2.2.2.細胞模型的構建及效果評價:細胞模型構建：取對數(shù)生長期的AR42J細胞接種于6孔板中，待其細胞密度達到60%-80%時，分為空白對照組和實驗組，每組設置3個復孔，空白對照組加入正常培養(yǎng)基，實驗組加入含100nmol/L雨蛙素培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)0、2、6、12、24、48小時。模型效果評價：分別提取不同時間段后的蛋白,用Western Blot法檢測各組TNF-蛋白的表達。另收集不同時間段的細胞上清用ELISA法檢測炎癥因子水平。蛋白提取步棸及Western Blot法下文會詳細敘述，在此詳細介紹ELISA實驗方法。ELISA法

11、檢測AMY、TNF-、IL-1濃度：1） 準備試劑以及微孔板；2） 使用1x洗液洗板，洗液在微孔板中持續(xù)浸泡30s；而后倒出洗液，而后立即使用微孔板；3） 標準品2倍稀釋，設置復孔空白孔并加入100l稀釋標準品；4） 使用移液槍將20l樣本加入樣本孔并加入80l 1x檢測緩沖液；5）抗體稀釋，每孔中加入50l稀釋抗體；6）封板振蕩（300 r/min），室溫孵育2h；7）倒出液體，再次洗板，重復6次；8）加入100l稀釋鏈霉親和素至每個孔；9）所有操作流程過后，封板震蕩，而后靜置45min；10) 再次洗板6次；11) 加入100l顯色底物，并避光，室溫下靜置30min；12) 加入100l終

12、止液，孔中顏色需由藍變黃。13）檢測OD值：30分鐘內檢測450nm以及570nmOD值；校準OD值=OD450-OD570。14）計算出數(shù)值。橫坐標：標準品濃度，縱坐標：校準OD值，使用EXCEL軟件制作標準曲線以及計算回歸方程，而后將校準OD值代入計算樣本濃度。2.2.3.IRF9-siRNA轉染AR42J細胞：沉默IRF9：使用Lipo2000 TM轉染IRF9沉默的si-RNA，空載作陰性對照。按如下步驟進行轉染：1） 胰酶消化；2） 消化后將細胞均勻接種到6孔板中（密度一致）；3） 加入2ml不含雙抗的培養(yǎng)液到6孔板中；4） 待細胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次；5） 避光向6孔板中

13、加入1500ul Opti-MEM(x1）；6） 設置分組，分為六組，上面3個孔分別為不用雨蛙素誘導的：正常的胰腺AR42J細胞為空白對照組,N-siRNA轉染的胰腺AR42J細胞為陰性對照組，siIRF9轉染的胰腺AR42J細胞為實驗組，下面3個孔分別為雨蛙素誘導的：急性胰腺AR42J細胞，N-siRNA轉染的胰腺AR42J細胞為陰性對照組，siIRF9轉染的胰腺AR42J細胞為實驗組。7） 分別將每組孔的藥加好：取6個無酶EP管，先加無雨蛙素誘導組的3個孔：空白對照組：每孔加入250l Opti-MEM，其中一管中加5l Lipofectamine2000，另一管不加。陰性實驗組：一管加5

14、l liop2000，另一管加5l N-siRNA 。陽性實驗組：其中一管加5l Lipofectamine2000，另一管加5l siIRF9充分混勻。有雨蛙素誘導組的3個孔：空白對照組、陰性實驗組和陽性實驗組三個孔加藥方法同無雨蛙素誘導的三個孔加藥方法一致；8） 加藥后避光靜置5min，藥物混勻再避光靜置20min；9） 分別將這6組藥加入分組為無雨蛙素誘導和有雨蛙素誘導的空白組、陰性實驗組以及陽性實驗組的板孔中；10） 加藥結束后，放入37，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，11） 培養(yǎng)結束后使用PBS洗2次，再換上2ml細胞培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J細胞)，培養(yǎng)24h

15、。此種siIRF9轉染AR42J細胞實驗重復無三次。注意事項：1）適當進行細胞傳代，以提高轉染效率、穩(wěn)定性并減少毒性，所有細胞傳代次數(shù)需要一致；2）為防止局部復合物濃度過高乃至高細胞毒性，不可使用其他試劑稀釋核酸或轉染試劑，直接將核酸及轉染試劑混勻。復合物以及培養(yǎng)基混勻后，靜置六孔板；3）使用無雙抗的opti培養(yǎng)基混合復合物，37恒溫培養(yǎng)6h拍照，而后更換普通培養(yǎng)基。若首次轉染效率不佳，可在轉染24h后再次添加復合物轉染，提升轉染率。2.2.4.qRT-PCR檢測IRF9-siRNA對胰腺AR42J細胞中IRF9mRNA、SIRT1mRNA相對表達量的影響：細胞成功轉染24h后，進一步提取RN

16、A,檢測IRF9mRNA、SIRT1mRNA的表達。步棸如下：提取總RNA：1） 超凈臺操作，使用移液器吸出六孔板中培養(yǎng)基，1ml PBS沖洗2次，而后吸凈殘留，加入1ml TRIzol試劑，置于搖床上慢搖10min，需低溫放置，促使其充分裂解。2） 使用移液槍將六孔板中混合試劑轉移至1.5ml 無酶EP管中，再加入TRIzol試劑體積的五分之一即200l氯仿，加入完成后，上下?lián)u晃15次，使其充分混勻。而后置于冰上靜置5min，待分層完全后放置于離心機（4，13200r/min）離心15min。3） 使用移液槍小心轉移200l上層水相至另一個1.5ml 無酶EP管中，同時加入等體積異丙醇，15

17、次上下振蕩，充分混勻后于-20冰箱中靜置30min，然后取出，于低溫離心機（4，13200r/min）離心15min。4） 棄上清，使用提前配好的75%乙醇1ml將所得RNA沉淀物洗滌，于低溫離心機（4，13200r/min）離心5min，而后棄上清，并將吸水濾紙剪成長條狀，伸入EP管中吸出可見的液體。5） 將EP管靜置30min，需倒置放于吸水濾紙上，干燥至一定程度（切忌不能完全干燥）后將20l DEPC水加入其中，充分振蕩混勻，保存于-80冰箱，處理后的樣本可于-80冰箱中長期保存。逆轉錄步驟：1） 從-80冰箱取出已經經過處理的樣本總RNA，使用定量PCR檢測儀對總RNA實施定量檢測。2

18、） 取200l無酶EP管一只，依靠定量檢測而后計算RNA溶液所需量，同時加DEPC水，總容量需至8l，而后將2ul Takara逆轉錄試劑盒中的Mix試劑加入其中，總體系容量需要達到10l，而后將100ul DEPC水加入其中，并將混合物充分振蕩混勻。3） 將混合所有試劑的EP管放置于逆轉錄使用儀器中，啟動逆轉錄程序，逆轉錄程序條件如下：37預熱16min，90解鏈5秒鐘，5退火12min。所有逆轉錄程序結束后，將逆轉錄所得cDNA放置于-80冰箱中保存。qRT-PCR步驟：1） 引物配制：實驗中所需要使用到的引物其序列如下圖所示。將裝有引物粉末的EP管放置于離心機（3000r/min）離心1

19、min，盡量使其不沾壁，而后取出后輕輕開啟EP管管蓋，根據引物說明書，將適量DEPC水加入到EP管中進行稀釋，而后蓋上瓶蓋，放置于振蕩儀上振蕩，使其充分混勻。再另取一200l無酶EP管，將190ul DEPC水加入其中，并使用移液槍吸取出5l正義引物及5l反義引物加到無酶EP管中，標記并且放置在振蕩儀上，充分混勻后將其置于-20冰箱中保存。mRNA引物序列IRF9正義引物：CTGCTCACCTTCATCTACAACG反義引物：ACTAGGATGCCCCTCTCAAGAPDH正義引物：TTGGTATCGTGGAAGGACTCA反義引物：TGTCATATTTGGCAGGTTT2） 取出逆轉錄后得到

20、的合格的cDNA樣品，在超凈臺中嚴格無菌操作，取無酶100l八聯(lián)排管，按表中反應體系制作反應試劑，而后將準備好的10l體系全部置于八聯(lián)排管中，使用迷你離心機使其振蕩充分混勻，而后將把臉排管置于熒光定量PCR儀中進行PCR反應，反應設置的條件為：95 加熱10min，95變性 15s，60 退火30s，此程序循環(huán)次數(shù)為45次。反應體系如下：體系體積2 x SYBR Green mixture5.2lcDNA1.6l引物3.2lTotal10l3） 整個PCR反應流程約需要2小時，待反應結束后，可依靠儀器獲取目的基因的CT值，使用2-Ct法可計算出目的基因相對表達值，計算出表達值后，使用電腦軟件繪

21、制柱狀圖。注意事項：1） 避免反復凍融所提取的RNA、cDNA以及逆轉錄試劑，可避免RNA的降解以及降低酶的活性。2） 使用前將逆轉錄試劑及相關PCR反應試劑上下顛倒以充分混勻其中各種試劑成分，可避免反應體系的總體積與實際不符，確保定量結果的準確性。此外，使用過程中吹打力度需要輕緩，若試劑產生泡沫，需要再次放于離心機中離心至無泡才可使用試劑。3）PCR試劑盒中含有熒光染料SYBR Green I，此物質遇光易揮發(fā)，故配制混合體系時應避光操作。4）空氣中微量DNA氣溶膠可能會導致靈敏度高的實驗試劑受到污染，從而導致實驗結果出現(xiàn)偏差甚至錯誤，為避免這種實驗試劑受到污染，應在超凈臺中配制相應反應體系

22、，嚴格按照無菌操作流程操作。另外，使用的相關器材需要保證無菌無霉。2.2.5.Western Blot法檢測IRF9-siRNA對胰腺AR42J細胞中IRF9、SIRT1、P53、乙?；疨53蛋白表達的影響：Western Blot法分別檢測無雨蛙素誘導的和有雨蛙素誘導的空白對照組、N-siRNA組、siIRF9轉染24h后的胰腺AR42J細胞中的IRF9、SIRT1、P53、乙?；疨53蛋白的表達情況。細胞蛋白提?。簩⒁认貯R42J細胞消化后，以相同的數(shù)量接種到6孔板中，待細胞貼壁，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入培養(yǎng)基至空白對照組(DMEM配的培養(yǎng)基用于AR42J細胞)，陰性實驗組加入N-si

23、RNA，陽性實驗組加入沉默siIRF9處理4h-6h后用PBS洗2次，再換上細胞培養(yǎng)基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J細胞)，每孔加2ml，培養(yǎng)24h。PBS清洗細胞，在培養(yǎng)板中加入蛋白裂解液裂解細胞，上離心機進行離心13200r/min，4,20min，上清液就是所要的蛋白液；提取的蛋白液要用BCA試劑盒檢測蛋白濃度后再分裝保存。根據測定的不同的蛋白濃度，加入5load-ingbuffer(比例為41)和相應體積的總蛋白樣品，混勻，蛋白液要在干浴鍋中煮10010min，變性后才能用，煮好的蛋白樣本放在20冰箱中保存。細胞蛋白Western Blot方法：1）SDS-PAGE電泳 將

24、已經過處理且變性的蛋白樣品使用移液器轉移至含有濃縮膠的孔中，而后將5l marker添加至另一個樣品加樣孔中。接通電泳儀電源，第一階段電泳：將電泳儀電壓設置為80V恒定電壓，電泳時間設置為30分鐘；第二階段：第一階段結束后，將電泳儀電壓調整為120V恒定電壓，持續(xù)電泳90分鐘。第二階段電泳持續(xù)到marker提示目的蛋白已于凝膠上分離，然后停止電泳。2）轉膜 電泳結束后，自電泳儀中小心取出凝膠，使用超純水將凝膠表面電泳液清洗干凈，注意保持凝膠完成性；事先需要準備好容器，并向容器中添加足量的轉膜液，而后將凝膠以及轉膜夾放入容器中浸泡；使用直尺及其他切膠器具將目的蛋白以及marker的凝膠切下，使用

25、直尺測量其大小，而后裁剪大小相當?shù)腜VDF膜覆蓋在膠條上（注意：PVDF膜在使用之前需要使用甲醇溶液浸泡30s激活），而后依次將凝膠和PVDF膜放在正負極明顯的轉膜夾中，轉膜夾需要設置6層，從陰極側到陽極側分別為海綿墊片、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊片（注意每一步都需要去除氣泡），放置好后將轉膜夾扣緊并轉入有足量轉膜液的電泳槽中，轉膜過程應保持低溫，故應在電泳槽周圍放入足量的冰渣，維持轉膜過程中的低溫環(huán)境，而后接通電源并將電流設置為200mA恒流，轉膜時間設置為120min。3）封閉 轉膜結束后，回收轉膜液，小心將轉膜夾取出，而后細心取出PVDF膜，放置于容器中（注意，條帶擺放不宜過于

26、集中，最好一格一個條帶），使用1 x TBST溶液將轉膜液洗4次，洗滌過程中將容器放于搖床上，每次震蕩5分鐘。而后使用TBST溶液與脫脂奶粉混合（脫脂奶粉5g，TBST溶液100ml），兩者混合后，使用震蕩儀使其充分混勻，然后將處理干凈的PVDF膜放置于混合物中開始封閉，室溫搖晃封閉1.5h。4）抗體孵育：一抗孵育：封閉結束后，小心將PVDF膜取出，用1 x TBST溶液將轉膜液洗4次，洗滌過程中將容器放于搖床上，每次震蕩5分鐘。洗滌結束后，將一抗IRF9、SIRT1、P53、乙?；疨53以及內參抗體-actin分別足量添加到入目的條帶中，然后將其放置于搖床上，于4環(huán)境下震蕩孵育24h。二抗孵

27、育：一抗孵育結束后，小心取出PVDF膜，使用1 x TBST溶液將留滯在PVDF膜表面的一抗洗去，洗4次，洗滌過程中將容器放于搖床上，每次震蕩5分鐘。洗滌結束后，將稀釋的二抗（使用TBST，稀釋比為1:5000）足量放入條帶中，然后在室溫下?lián)u晃震蕩60min。5）顯影 再次將條帶使用1 x TBST溶液洗滌4次，期間放在搖床上快搖，5min每次，將二抗溶液洗去。按照ECL發(fā)光試劑盒使用說明書制備顯影劑。而后取數(shù)個培養(yǎng)皿，將目的條帶逐個放入培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中的條帶滴加足量顯影劑（操作過程需要避光進行），而后將滴加足量顯影劑的條帶放入自動凝膠成像系統(tǒng)中進行自動曝光，同時保留圖像，使用Imaje

28、-J處理拍攝的圖像，分析目的蛋白的灰度值。注意事項：1) 顯色液必須要新鮮配置使用。2) 配膠時注意操作，有致癌液體，避免濺在身上。2.2.6.流式細胞儀檢測IRF9-siRNA對胰腺AR42J細胞凋亡的影響：把胰腺AR42J細胞消化，按1106接種到6孔板中，待細胞貼壁，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，分為雨蛙素誘導和無雨蛙素誘導的：空白對照組加入培養(yǎng)基，陰性實驗組加入N-siRNA，陽性實驗組加入沉默siIRF9,處理4h-6h后用PBS洗2次，再換上細胞培養(yǎng)基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J細胞)，每孔加2ml，培養(yǎng)24h。用不含EDTA的胰酶消化細胞，用15ml離心管收集，上離心機，

29、離心500g，5min，棄上清液，用1mlPBS輕輕重懸細胞并計數(shù)（細胞數(shù)量不少于105）然后500g離心5min，收集細胞。繼而加入400ulBinding Buffer重懸細胞，再加入5ulAnnexin V-FITC/PI，所有操作需要輕緩，室溫避光孵育染色15min。最后加入10ulPI染色，輕輕混勻冰浴避光5min。注意事項：1） 操作時注意避光，反應完畢后盡快在1小時內檢測。2） 檢測細胞數(shù)量需要達到1106個，但不宜過多。不足量細胞的樣本流動量大，檢測時會相應增加變異系數(shù)，導致實驗結果出現(xiàn)偏差甚至錯誤。同時，細胞數(shù)量過多，會導致按量配制的抗體或其他試劑相對不足，影響實驗結果。3）

30、 在實驗過程中，在確保實驗科學性以及準確性前提下，可適當縮減實驗工序。2.2.7.MTT試驗取轉染成功后的AR42J細胞,細胞分組同上，每組處理設三個重復，將細胞在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期時用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，配置細胞懸液，分別加入96孔板中每孔加入100l 500個細胞，放入CO2（5%）培養(yǎng)箱中37C下培養(yǎng)以貼壁。按照實驗需要，進行培養(yǎng)并給與10l雨蛙素誘導。待24小時后，每孔加入20l MTT工作液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4小時。四小時后待孔板底部出現(xiàn)少量紫色結晶并且40倍鏡下觀察細胞周圍也出現(xiàn)時，實驗課停止。而后吸取上清溶液（注意留存紫色結晶），待吸出干凈，加入

31、100l DMSO。 37孵育15min，待紫色結晶溶解完畢。在570nm測定吸光度。注意事項：1） 細胞的接種密度一定不能太大，一般每孔500-1000個左右就夠了，寧少勿多。尤其對于腫瘤細胞。10000/孔太多了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。2） 注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。3） 加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力，所以要熟練、快些上板。2.2.8.Transwell實驗取轉染后細胞，細胞分組同上（分為6組）

32、，實驗步棸如下：1）消化，而后終止消化并離心棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，無血清培養(yǎng)基（含BSA）重懸，細胞密度為3105。2）接種：a. 取200l細胞懸液到Transwell小室；b. 向24孔板下室加入600l的培養(yǎng)基（含15%FBS）；c. 培養(yǎng)24h。3）固定染色取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液。用PBS洗2遍，再用甲醛固定30分鐘。后清洗風干，取800l結晶紫于孔中，將小室放在上面25分鐘。最后清洗顯微鏡下拍照。3） 計數(shù)：取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)，本實驗選取3個視野，都是隨機選取。注意事項：1）細胞重懸時，個人認為不要超過5105，具體實驗室采用密度要自己摸索，因為不同細胞其

33、侵襲能力有別，細胞量過多過少都會導致難以計數(shù)；2）細胞數(shù)目差異會對實驗結果產生影響，故對細胞應該同時計數(shù)；3）細胞一般常規(guī)培養(yǎng)12-48h，主要依據侵襲能力而定。本實驗采用的最佳培養(yǎng)時間為24h。4）固定染色擦洗應擦凈膜表面上未遷移的細胞，但避免擦除膜底細胞，保證計數(shù)準確。2.2.9.熒光素酶基因實驗1 于轉染前24h將細胞接種于12孔板中（1105/孔），每孔細胞匯合度應達到60%，每組樣品3個重復。2 轉染前半小時將完全培養(yǎng)基換無血清培養(yǎng)基0.5ml。 3 A液，按照實驗需求進行分組，各三個復孔，各加入50l 無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜置5min。其中過表達質粒1g，啟動子質粒 1g，

34、 pRL-SV40質粒0.2g4 B液：脂質體使用前輕輕混勻，脂質體4ul與50l無血清培養(yǎng)基混勻，室溫放置5min； 5 將A液、B液混合，然后放置在震蕩儀上震蕩，使其充分混勻，而后室溫放置15min。放置結束后，將混合液均勻滴加至12孔板中； 6 將12孔板放置于37恒溫箱中培養(yǎng)6h，然后用完全培養(yǎng)基替換無血清培養(yǎng)，再次放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 7 螢光素酶報告基因檢測：在轉染后48h后，裂解細胞，使用雙螢光素酶檢測試劑盒，在化學發(fā)光儀上進行檢測。8 在以Renilla螢光素酶為內參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測定得到的LUC值除以Renilla螢光素酶測定得到的RLU值。根據得到比值來比較轉錄因

35、子對啟動子的活性。注意事項：1) 基因在檢測過程中易受到細胞及載體狀態(tài)、轉染及裂解效率、加樣精度等多重因素的影響，同批次樣品檢測值可因這些因素出現(xiàn)浮動。故實驗需要設置3個或3個以上復孔，同時使用其他基因作內參。2) 培養(yǎng)細胞的時間宜在12-36小時之間，不宜過長，長時間細胞培養(yǎng)可能會導致細胞難以裂解。3) 選擇目標基因a) 螢光蟲熒光素酶：選取pGL-3或pGL-4載體或自身構建載體；b) 海腎熒光素酶：選取phRL-TK或pGL-4代載體或自身構建載體。此外海腎載體不應使用諸如V40、CMV等強啟動子，應選用TK等中等強度的啟動子；4） 20-22為最佳的反應溫度，實驗時細胞裂解產物、底物工

36、作液等試劑的添加等操作都宜在適宜溫度下操；5） 細胞裂解產物在常溫下保存不宜超過6h，-20環(huán)境下不宜超過30天，-80環(huán)境下不宜超過180天；6） 手動快速使裂解產物與底物混合，并且混合的時間需要一致，以免熒光素酶衰變影響實驗結果的準確性以及真實性；7）檢測結果：樣品檢測OD值實際上應該比儀器背景值大得多，若樣品OD值與儀器背景值過于接近，表明熒光素酶在樣本中含量過少，可從轉染量、轉染效率、裂解效率等相關因素進行考慮。2.3統(tǒng)計處理實驗檢測數(shù)據均采用SPSS16.0軟件分析。計量資料以均數(shù)標準差(xs)顯示結果，使用獨立樣本t檢驗，檢驗標準為a=0.05。3. 結果3.1.細胞模型構建成功：

37、ELISA測定結果表明,AMS的水平,IL-1和TNF-增加(圖1 a、1 b和c)。Western Blot實驗結果提示：不同時間段雨蛙素誘導胰腺AR42J細胞與空白對照組相比，誘導24小時后的AR42J細胞TNF-升高明顯(圖1 d)，各組間差異明顯，具有有統(tǒng)計學意義（P0.05），這些結果表明，體外成功構建了急性胰腺炎細胞模型。圖1各炎癥因子水平3.2.qRT-PCR檢測結果：qRT-PCR檢測結果顯示與空白對照組相比，雨蛙素誘導后IRF9的mRNA水平明顯升高、SIRT1的mRNA水平下降。siIRF9轉染后IRF9的mRNA表達水平與空白對照組相比降低，較雨蛙素誘導組也降低，SIRT

38、1的mRNA表達水平升高,各組間差異具有統(tǒng)計學意義。（P0.05）（圖2）。即siIRF9轉染后IRF9的mRNA表達水平較雨蛙素誘導后IRF9的mRNA表達能力降低，SIRT1的mRNA表達水平較誘導前升高。圖2 雨蛙素（100 nmol/L）誘導及IRF9基因沉默的AR42J細胞IRF9及SIRT1的mRNA表達的影響3.3.Western Blot結果：用N-siRNA轉染24h后的胰腺AR42J細胞內的IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53蛋白的表達與空白對照組比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義，用siIRF9轉染胰腺AR42J細胞后蛋白表達與空白對照組相比：IRF9蛋白表達降低，S

39、IRT1蛋白水平升高、乙?；痯53/p53的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)（圖3）。圖3 Western blot 法檢測雨蛙素（100 nmol/L）誘導及IRF9沉默的AR42J細胞IRF9、SIRT1、P53及ace-P53蛋白的表達水平3.4.沉默的IRF9基因對AR42J細胞凋亡的影響:AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測的結果表明：無雨蛙素誘導的三組結果：空白組凋亡率是12.4730.353,N-siRNA實驗組凋亡率是8.8260.348,沉默IRF9實驗組凋亡率是7.4400.647。有雨蛙素誘導的三組結果：空白對照組凋亡率19.2571.668，N-si

40、RNA實驗組凋亡率是16.2282.471,沉默IRF9實驗組凋亡率是14.8173.069。與空白對照組和N-siRNA轉染24h后的胰腺AR42J細胞比較，siIRF9轉染24h后的胰腺AR42J細胞的凋亡率是明顯降低的（圖4）。圖4 雨蛙素（100 nmol/L）誘導及IRF9沉默后各組AR42J細胞凋亡率3.5.沉默的IRF9基因對AR42J細胞增殖的影響：MTT實驗結果顯示:N-siRNA組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義，siIRF9組的OD值較空白對照組及陰性對照組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）（圖5）,這說明siIRF9組細胞數(shù)明顯下降，細胞生長受到明顯抑制，siIRF

41、9組細胞自我復制能力下降。圖5 雨蛙素（100 nmol/L）誘導及IRF9沉默后各組AR42J細胞的吸光度3.6.IRF9基因沉默對AR42J細胞侵襲遷移的影響：采用transwell法檢測AR42J細胞的遷移。結果顯示，IRF9沉默組AR42J細胞活力明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)(圖6)。與空白對照組和陰性對照組相比，IRF9沉默組的遷移明顯減少。陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。IRF9基因沉默抑制AR42J細胞的遷移。圖6雨蛙素（100 nmol/L）誘導及IRF9沉默后各組AR42J細胞的遷移率3.7.雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：結果顯示IRF9抑

42、制了SIRT1的啟動子活性(圖7)。IRF9對SIRT1具有調控作用。圖7 IRF9-SIRT1表達4.討論AP的主要特征是胰腺局部炎癥或伴有全身多器官損傷，但其病理機制不明26。AP可分為MAP(輕度AP）以及SAP(重度AP)。其中SAP的病死率較高27,28，達到17%30%。目前SAP無特異性治療方法，需要依靠重癥監(jiān)護。為降低病死率以及增加治療效果，應盡早對AP病情程度進行預判。輕度AP為自限性疾病，但若治療不佳，會遷延不愈甚至成為SAP29。SAP伴有胰腺壞死及全身性炎癥反應，甚至會引起膿毒癥及器官功能障礙30。AP的發(fā)病機制研究是影響其防治方案以及致死率的一個重要影響因素31。為解

43、決這些問題，需要大力投入對AP發(fā)病機制研究。IRF同族首先被鑒定為I型轉錄調節(jié)因子干擾素系統(tǒng)。在哺乳動物中，這個家族由9名成員組成，從IRF1到IRF9。在過去幾十年來，越來越多的證據揭示了IRF家族在免疫反應，病理過程等方面的功能，包括癌變和心血管疾病32。IRF家族的功能人類AML也有報道。IRF3在人類AML中有著主要影響通過靶向miR-15533。IRF9是IRF家庭成員的另一名成員。IRF9介導先天免疫通過激活干擾素介導的靶基因轉錄反應34。此外，IRF9展出通過誘導針對干擾素誘導的p53依賴性細胞凋亡的抗增殖作用。IRF9還涉及抗腫瘤藥物耐藥性并促進細胞生長19,35。IRF9參與

44、細胞增殖、腫瘤形成、炎癥以及自身免疫性疾病等病理過程36,37,38。有研究表明39，IRF9與STAT1可形成復合物，其復合物的促炎作用作用結腸炎。IRF9在人類AP中的機制意義仍然未知。本實驗采用體外培養(yǎng)大鼠急性胰腺炎細胞AR42J作為研究對象。通過siRNA干擾技術成功敲減了AR42J細胞的IRF9基因，通過qRT-PCR和Western Blot發(fā)現(xiàn)雨蛙素誘導后，IRF9基因的mRNA及蛋白水平升高，SIRT1基因的mRNA及蛋白水平均較雨蛙素誘導前降低；乙酰化p53/p53蛋白水平較雨蛙素誘導前明顯上調，說明發(fā)生急性胰腺炎時IRF9基因、乙?；痯53/p53的表達水平均上調，而SIR

45、T1基因的表達水平下調。流式細胞實驗、MTT實驗及Transwell實驗顯示：雨蛙素誘導后IRF9沉默組細胞的凋亡率、遷移能力及增殖能力降低。雙熒光素酶基因實驗結果示：IRF9抑制了SIRT1的啟動子活性。這些結果表明AP發(fā)生時IRF9抑制SIRT1表達和增加了p53的乙?；?，促進AR42J細胞凋亡、增殖及轉移擴散。沉默IRF9基因能夠上調SIRT1，降低p53的乙?；剑种屏思毎蛲?、增殖及轉移擴散。我們猜測IRF9是SIRT1的負調節(jié)因子，通過抑制SIRT1的表達促進了p53的乙酰化，促進細胞凋亡、增殖及轉移擴散。這暗示著IRF9通過SIRT1-p53信號通路在AP病情進展中有著主要作

46、用。綜上所述，AP發(fā)生時IRF9基因可能通過IRF9-SIRT1-P53信號通路下調SIRT1的表達，增加P53乙?；?，提高細胞的增殖和轉移能力，進一步引起炎癥反應的發(fā)生。以IRF9為靶點有望在研究急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展上獲得新的認識，為尋找更好的臨床治療方法提供新的方向。5.結論：1） 體外AP模型中IRF9蛋白表達上升，而SIRT1表達下降，p53乙?；缴?。細胞凋亡增加、增殖及轉移擴散能力升高。2） 沉默IRF9基因能夠抑制SIRT1的表達，增加P53乙?；?，促進AR42J細胞發(fā)生凋亡，提高細胞的增殖和轉移能力，3） IRF9蛋白可通過調控SIRT1/p53信號通路進而參與AP的

47、發(fā)生發(fā)展。IRF9可能是治療AP的一個潛在的藥物靶點。參考文獻：1 Zhaorigetu S,Yang Z,Toma I,McCaffrey TA,Hu CA. Apolipoprotein L6, induced in atherosclerotic lesions, promotes apoptosis and blocks Beclin 1-dependent autophagy in atherosclerotic cells. J Biol Chem, 2011, 286 (31): 27389-27398.2 Cao Y,Yang W,Tyler MA,Gao X,Duan C,K

48、im SO,Aronson JF,Popov V,Takahashi H,Saito H,Evers BM,Chao C,Hellmich MR,Ko TC. Noggin attenuates cerulein-induced acute pancreatitis and impaired autophagy. Pancreas, 2013.,42 (2): 301-307. 3 Yadav D, Lowenfels AB. The epidemiology of pancreatitis and pancreatic cancer. Gastroenterology, 2013, 144

49、(6): 1252-12614 Peery AF,Dellon ES,Lund J,Crockett SD,McGowan CE,Bulsiewicz WJ,Gangarosa LM,Thiny MT,Stizenberg K,Morgan DR,Ringel Y,Kim HP, Dibonaventura MD,Carroll CF,Allen JK,Cook SF,Sandler RS,Kappelman MD,Shaheen NJ. Burden of gastrointestinal disease in the United States. Gastroenterology,2012

50、; 143 (5):1179-1187. 5 Gravante G,Garcea G,Ong SL,Metcalfe MS,Berry DP,Lloyd DM,Dennison AR. Prediction of mortality in acute pancreatitis: a systematic review of the published evidence. Pancreatology, 2009, 9 (5): 601-614. 6 Sah R P , Garg P , Saluja A K . Pathogenic mechanisms of acute pancreatiti

51、s. Current Opinion in Gastroenterology, 2012, 28(5):507-515.7 Chiari H. About the digestion of the human pancreas (in German). Zeits- chriftfu rHeilkunde 1896; 17:6996.8 Dawra R , Sah R P , Dudeja V , et al. Intra-acinar Trypsinogen Activation Mediates Early Stages of Pancreatic Injury but Not Infla

52、mmation in Mice With Acute Pancreatitis. Gastroenterology, 2011, 141(6):2210-2217.e2.9 Ji B , Gaiser S , Chen X , et al. Intracellular Trypsin Induces Pancreatic Acinar Cell Death but Not NF-B Activation. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17488-17498.10 Matta B,Song S,Li D,Barnes BJ. In

53、terferonregulatoryfactorsignaling in autoimmune disease. Cytokine,2017, 98:15-26. 11 Marsili G, Perrotti E, Remoli AL, Acchioni C, Sgarbanti M, Battistini A. IFNRegulatoryFactors and Antiviral Innate Immunity: How Viruses Can Get Better.JInterferonCytokine Res, 2016, 36 (7): 414-432.12 Abrams SI, Ne

54、therby CS, Twum DY, Messmer MN. Relevance ofInterferonRegulatoryFactor-8 Expression in Myeloid-Tumor Interactions. JInterferonCytokine Res, 2016, 36(7): 442-453.13 Chen YJ, Li J, Lu N, Shen XZ. Interferonregulatoryfactors: A key to tumour immunity. Int Immunopharmacol. 2017, 49: 1-5. 14 Zhang Y, Li

55、H. ReprogrammingInterferonRegulatoryFactorSignaling in Cardiometabolic Diseases. Physiology (Bethesda), 2017, 32 (3): 210-223.15 Alsamman K,El-Masry OS. Interferonregulatoryfactor1 inactivation in human cancer. Biosci Rep,2018, 38 (3). pii: BSR20171672. 16 Chen HH,Stewart AFR. Interferonregulatoryfa

56、ctor2 binding protein 2: a new player of the innate immune response for stroke recovery. Neural Regen Res,2017, 12 (11): 1762-1764.17 Fujii Y , Shimizu T , Kusumoto M , et al. Crystal structure of an IRF-DNA complex reveals novel DNA recognition and cooperative binding to a tandem repeat of core sequencesJ. Embo Journal, 1999, 18(18):5028-5041.18 Shen A,Kim HJ,Oh GS,Lee SB,Lee SH,Pandit A,Khadka D,Choe SK,Kwak SC,Yang.SH,Cho.EY,Kim.HS,Kim.H,Park.R,Kwak.TH,So.HS.NAD+augmentationamelioratesacutepancreatitisthroughregulationofinfl