幾種PCR擴(kuò)增的比較.doc

1、.普通 PCR、原位 PCR、反向 PCR和反轉(zhuǎn)錄 PCR的基本原理和操作步驟普通 PCR1 概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction)，簡稱 PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù) ，用于放大特定的 DNA 片段 ?？煽醋魃矬w外的特殊 DNA 復(fù)制。DNA 聚合酶（DNA polymerase I）最早于 1955 年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的 Klenow fragment of E. Coli 則是于 70 年代的初期由 Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性 , 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 現(xiàn)今所使用的酶(簡稱

2、 Taq polymerase), 則是于 1976 年從溫泉中的細(xì)菌（ Thermus aquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫， 是一個(gè)很理想的酶， 但它被廣泛運(yùn)用則于80 年代之后。 PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971 年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于 1983 由 Dr. Kary B. Mullis 發(fā)展出的， Dr. Mullis 當(dāng)年服務(wù)于 PE公司，因此 PE公司在 PCR界有著特殊的地位。 Dr. Mullis 并于 1985 年

3、與 Saiki 等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后， PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后 PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用， 成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。 Mullis 也因此獲得了 1993 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2 PCR原理PCR技術(shù)的基本原理類似于 DNA 的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由變性 -退火 -延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成 ：模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 93左右一定時(shí)間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，

4、為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板 DNA 與引物的退火 (復(fù)性 )：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； 引物的延伸： DNA 模板 -引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下， 以 dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈， 重復(fù)循環(huán)變性 -退火 -延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈” ，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24 分鐘， 23 小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。3. PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件3.1 標(biāo)準(zhǔn)

5、的 PCR反應(yīng)體系10擴(kuò)增緩沖液10 l4 種 dNTP混合物200l引物 10100 l模板 DNA 0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+ 1.5mmol/L1/11.加雙或三蒸水100 l3.2 PCR反應(yīng)五要素參加 PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即 引物 (PCR引物為 DNA 片段，細(xì)胞內(nèi) DNA 復(fù)制的引物為一段 RNA鏈)、酶、 dNTP、模板和緩沖液 （其中需要 Mg2+)。 PCR步驟標(biāo)準(zhǔn)的 PCR過程分為三步：1.DNA 變性（90-96）：雙鏈 DNA 模板在熱作用下， 氫鍵斷裂， 形成單鏈 DNA2.退火（ 25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA 模板結(jié)合，形成

6、局部雙鏈。3.延伸（ 70-75）：在 Taq 酶（在 72左右，活性最佳）的作用下，以 dNTP 為原料，從引物的 5端 3端延伸，合成與模板互補(bǔ)的 DNA 鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸， DNA 含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些 PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使 Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成， 因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在 60 -65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。4 PCR反應(yīng)特點(diǎn)4.1 特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 底物與模板 DNA 特異正確的結(jié)合；堿基配對原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 基因的特異性與保守性。其中引物與模板

7、的正確結(jié)合是關(guān)鍵。 引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。 聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及 Taq DNA聚合酶耐高溫性， 使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合 (復(fù)性 )可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。 再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。4.2 靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的， 能將皮克 (pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克 ( g=10-6)水平。能從 100 萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中， PCR的靈敏度可達(dá) 3 個(gè) RFU(空斑形成單位 )；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為 3 個(gè)細(xì)

8、菌。4.3 簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA 聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在 DNA 擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性 -退火 -延伸反應(yīng)，一般在 24 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。4.4 對標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及 RNA 均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等 DNA 擴(kuò)增檢測。2/11.5 PCR常見問題5.1 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性， 酶的質(zhì)量， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)

9、進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有 Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈， 特別是染色體中的組蛋白， 在提取制備模板時(shí)丟失過多， 或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理， 模板核酸提取過程出了毛病， 因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶， 或新舊兩種酶同時(shí)使用， 以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加 Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、 引物的濃度、 兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。 有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，

10、 兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 OD值，更要注重 引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)， 而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致， 如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做 PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高， 一條亮度低， 在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度 。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存， 防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分， 導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效 。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度： Mg2+濃度對 PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過

11、低則影響 PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCR擴(kuò)增采用的體積為 20ul、30ul、 50ul 或 100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定， 在做小體積如 20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對 PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性 ;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。靶序列變異： 如靶序列發(fā)生

12、突變或缺失， 影響引物與模板特異性結(jié)合， 或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其 PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。5.2 假陽性出現(xiàn)的PCR 擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適 ：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性， 因而在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的 PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。 靶序列太短或引物太短， 容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 ：這種污染有兩種原因： 一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，3/11.防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。 除酶及不能耐高溫的物

13、質(zhì)外， 所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前， 反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。5.3 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致， 或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)， 其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+濃度過高、退火溫度過低，及 PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。 其次是酶的質(zhì)和量，

14、 往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)， 酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。 降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法 (93變性， 65左右退火與延伸 )。5.4 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高， Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少 dNTP 的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。原位 PCR在科學(xué)研究中， 每一

15、項(xiàng)新技術(shù)的創(chuàng)立都會(huì)帶來一系列新的研究成果問世， 從而推動(dòng)著各學(xué)科的發(fā)展?？v觀形態(tài)研究領(lǐng)域， 50 年代電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀察領(lǐng)域，帶來了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平的深入研究； 60-70 年代，免疫組織化學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用， 又將觀察的水平由亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)推向了蛋白質(zhì)分子水平，使細(xì)胞內(nèi)眾多的活性物質(zhì)得以進(jìn)行細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位， 對醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展無疑產(chǎn)生了深刻的影響。 70 年代，分子生物學(xué)技術(shù)在形態(tài)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，隨著原位雜交技術(shù)的出現(xiàn)，使組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA 或 RNA 序列能夠被定位，將蛋白質(zhì)水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位， 從而使人類對許多生命現(xiàn)象在基因水平上的

16、認(rèn)識(shí)得以深化； 80 年代，分子生物學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)具有強(qiáng)大生命力的技術(shù) PCR多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)問世了， 很快地就被引入形態(tài)學(xué)觀察的領(lǐng)域，使細(xì)胞內(nèi)低拷貝或單拷貝的特定 DNA 或 RNA得以進(jìn)行定位及觀察。這一技術(shù)的問世， 必將帶來更多的研究成果， 使形態(tài)學(xué)的研究又向前邁出一大步。1 基本原理原位 PCR技術(shù)的基本原理，就是將PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來，從而在組織細(xì)胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA 或 RNA序列。PCR技術(shù)是在 DNA 聚合酶的作用下，經(jīng)過模板的變性、退火和引物延伸三種循4/11.環(huán)，將引物引導(dǎo)下的特異性靶序列迅速地進(jìn)行擴(kuò)增， 經(jīng)過擴(kuò)增的靶序列 （一般

17、能擴(kuò)增 106 倍），很容易在凝膠電泳或 Southern 印記雜交中顯示出來，因此， PCR 技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，隨著熱循環(huán)自動(dòng)化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)的操作簡便易行。但是， PCR技術(shù)是在液相中進(jìn)行的，在擴(kuò)增前，需將細(xì)胞破壞，從中提取核酸作為模板， 因此很難將 PCR的結(jié)果與組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，同時(shí)，也很難判斷含特異性靶序列的細(xì)胞類型。原位 PCR技術(shù)成功地將 PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，保持了兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢又彌補(bǔ)了各自的不足。 原位 PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定， 以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性， 當(dāng)進(jìn)行 PCR擴(kuò)

18、增時(shí)，各種成分，如引物， DNA 聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的 RNA或 DNA 為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大， 或互相交織， 不易穿過細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散， 從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定 DNA 或 RNA 序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。2 基本類型根據(jù)在擴(kuò)增反應(yīng)中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標(biāo)記， 原位 PCR技術(shù)可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉(zhuǎn)錄原位 PCR技術(shù)等。2.1 直接法原位 PCR技術(shù)直接法原位 PCR技術(shù)是將擴(kuò)增的產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子， 即使用標(biāo)記

19、的三磷酸腺苷或引物片斷。 當(dāng)標(biāo)本進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí)，標(biāo)記的分子就摻入到擴(kuò)增的產(chǎn)物中， 顯示標(biāo)記物，就能將特定的 DNA 或 RNA 在標(biāo)本（原位）中顯現(xiàn)出來。常用的標(biāo)記物有放射性同位素 35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標(biāo)記物所在位置。直接法原位 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便， 流程短，省時(shí)。缺點(diǎn)是特異性較差， 易出現(xiàn)假陽性，擴(kuò)增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點(diǎn)更為突出。因?yàn)樵谥破^程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會(huì)導(dǎo)致 DNA 的損害，而受損的 DNA 可利用反應(yīng)體系中的標(biāo)記三磷酸核苷進(jìn)行修復(fù)， 這樣標(biāo)記物就會(huì)摻入到 DNA的非靶序

20、列中，造成假陽性。若用標(biāo)記引物的方法進(jìn)行直接法原位 PCR，其擴(kuò)增的效率比不標(biāo)記更低。2.2 間接法原位 PCR技術(shù)間接法原位 PCR技術(shù)師現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行特定DNA 或 RNA擴(kuò)增，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應(yīng)用最為廣泛的原位 PCR技術(shù)。間接法原位 PCR與直接法不同的是，反應(yīng)體系與常規(guī) PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標(biāo)記物。 即實(shí)現(xiàn)先擴(kuò)增的目的， 然后用原位雜交技術(shù)去檢測細(xì)胞內(nèi)已擴(kuò)增的特定的 DNA 產(chǎn)物，因此，實(shí)際上是將 PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來的一種新技術(shù)，故又稱之為 PCR原位雜交 (PCR in situ hybridization

21、, PISH)。間接法 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高， 擴(kuò)增效率也較高。 缺點(diǎn)是操作步驟較直接5/11.法繁瑣。2.3 原位反轉(zhuǎn)錄 PCR技術(shù)原位反轉(zhuǎn)錄 PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的 RT-PC 技術(shù)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中的一種新技術(shù)， 與 RT-PCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄 PCR反應(yīng)之前，組織標(biāo)本要先用 DNA 酶處理，以破壞組織中的 DNA 酶，這樣才能保證擴(kuò)增的模板是從 mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA，而不是細(xì)胞中原有的 DNA。其它基本步驟與液相的 RT-PCR相似。3 基本步驟原位

22、 PCR技術(shù)的基本步驟包括標(biāo)本的制備。原位擴(kuò)增（ PCR）及原位檢測等基本環(huán)節(jié)，現(xiàn)分述如下（重點(diǎn)以石蠟切片為例） 。3.1 標(biāo)本的制備原位 PCR技術(shù)可應(yīng)用于細(xì)胞懸液、 細(xì)胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。 相比較而言，以懸浮的完整細(xì)胞做原位 PCR效果最好，石蠟切片效果最差。 隨著技術(shù)方面的一些問題被解決， 近年也有從石蠟切片中得到滿意的 PCR效率的報(bào)道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做 PCR，熱傳導(dǎo)較差，熱對流不均勻， TaqDNA 酶被玻璃片吸附等， 更為主要的原因， 可能是標(biāo)本經(jīng)制片后， 細(xì)胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴(kuò)增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導(dǎo)致擴(kuò)增的產(chǎn)物在原位不易保留。絕大多數(shù)的病理標(biāo)

23、本都是以福爾馬林固定， 石蠟包埋的形式保存的， 若能很好地解決石蠟切片原位 PCR的有關(guān)技術(shù)問題，意義顯然是十分重大的。組織細(xì)胞的固定 :一般認(rèn)為組織細(xì)胞以 10%的緩沖福爾馬林或 4%的多聚甲醛固定后進(jìn)行原位 PCR效果較好。固定的時(shí)間一般不宜過長， 視組織的大小，一般以 4 4-6 小時(shí)為宜。切片的厚度 :一般而言，切片若厚一些，原位 PCR的效果也較好一些，因?yàn)榍衅胶?，?DNA 的含量也就越多，同時(shí)膜結(jié)構(gòu)也較多，防止擴(kuò)增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切片細(xì)胞重疊多，形態(tài)學(xué)觀察的效果就差了，分辨率也將下降。玻片的處理 :為防止石蠟切片在 PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應(yīng)作防脫片處理，

24、常用的方法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。蛋白酶的消化作用 :在進(jìn)行原位擴(kuò)增之前，組織標(biāo)本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的組織細(xì)胞，可增加其通透性，充分允許反應(yīng)體系中的各成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并能很好的暴露靶序列，以利于擴(kuò)增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據(jù)組織固定的程度進(jìn)行調(diào)整。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除，因?yàn)橹灰猩倭康臍埩裘复嬖冢紝﹄S后進(jìn)行的PCR反應(yīng)體系的數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。蛋白酶消化處理組織細(xì)胞可提高通透性，有利于后續(xù)進(jìn)行的各反應(yīng)成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)， 但同時(shí)也使得擴(kuò)增產(chǎn)物的彌

25、散機(jī)會(huì)增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結(jié)果。原位擴(kuò)增（ PCR）原位擴(kuò)增即在組織細(xì)胞標(biāo)本上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其基本原理與液相PCR完全相同。6/11.引物 :PCR所用的引物一般為 15-30bp 為宜，擴(kuò)增的片斷為 100-1000bp 左右。原位 PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的 DNA 很少超過 400bp，RNA 很少超過 200bp，較長序列的擴(kuò)增易引起引物與模板的錯(cuò)配而導(dǎo)致非特異性反應(yīng)的出現(xiàn)。反應(yīng)體系 :原位 PCR的反應(yīng)體系與常規(guī)的液相 PCR基本相同，由于是在經(jīng)過固定的組織切片上進(jìn)行，為獲得較好的擴(kuò)增效果，有人主張反應(yīng)體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及 Mg2+的濃度均

26、應(yīng)高于液相的 PCR反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系中要加入牛血清白蛋白（ BSA） ,以防止 TaqDNA聚合酶與玻片的結(jié)合而降低了擴(kuò)增效率。熱循環(huán) :原位 PCR的熱循環(huán)可在專門的熱循環(huán)儀上進(jìn)行，操作簡便。也可在一般的 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行， 通常在樣品臺(tái)上覆蓋一層鋁箔， 制成平臺(tái)，樣品臺(tái)上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至于平臺(tái)上，即可進(jìn)行熱循環(huán)的步驟。為了保證進(jìn)行充分的擴(kuò)增，原位 PCR熱循環(huán)中每一步驟的時(shí)間可比常規(guī) PCR略長些，另外，也可采用熱啟動(dòng)（ hot start ）的方法，即玻片加熱到 80-94時(shí)，再立即加入 TaqDNA聚合酶。 為了保證反應(yīng)體系在熱循環(huán)過程不過多丟失，可用清亮的指

27、甲油，礦物油或 PAP筆把蓋片四周封閉起來。洗滌 :原位擴(kuò)增結(jié)束后，標(biāo)本應(yīng)清洗，以除去彌散到細(xì)胞外的擴(kuò)增產(chǎn)物。洗滌不充分，會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測時(shí)顯現(xiàn)， 造成背景過深或假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。 但是，洗滌過度，也會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的產(chǎn)物被洗脫， 是陽性信號減弱或丟失。 有作者在擴(kuò)增后用 4%多聚甲醛 2 小時(shí)或 2%戊二醛 5 分鐘進(jìn)行后固定， 以使擴(kuò)增的產(chǎn)物在檢測時(shí)能很好地保留在細(xì)胞內(nèi)，提高檢測的敏感性和特異性。原位檢測 :原位 PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，取決于原位 PCR的設(shè)計(jì)方案，直接法則根據(jù)標(biāo)記分子的性質(zhì)對擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測。 間接法則需用原位雜交的方法進(jìn)行檢測。4 原位 PCR技術(shù)的應(yīng)用

28、原位 PCR技術(shù)的突出優(yōu)勢，就是能在組織細(xì)胞原位檢測出拷貝數(shù)較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質(zhì)， 可將原位 PCR的應(yīng)用分為檢測外源性基因和內(nèi)源性基因兩方面。4.1 用于外源性基因的檢測4.1.1 病毒基因的檢測感染病毒的細(xì)胞常無較好的檢測手段， 但當(dāng)原位 PCR技術(shù)應(yīng)用后，使這一極為困難的問題有望解決。對 HIV、HPV、 HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、 生殖系統(tǒng)腫瘤、 肝炎及肝癌中的作用， 能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)受感染的人群。4.1.2 細(xì)菌基因的檢測最突出的應(yīng)用是在結(jié)核桿菌的檢測上， 當(dāng)結(jié)核病變不夠典型時(shí)， 經(jīng)過特殊染色的方法很難在鏡下找到結(jié)

29、核桿菌， 而應(yīng)用原位 PCR技術(shù)可幫助明確診斷， 當(dāng)結(jié)核桿7/11.菌很少時(shí)仍能在鏡下被很容易地找出來。4.1.3 導(dǎo)入基因的檢測在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中， 是否導(dǎo)入了基因， 在接受基因治療的患者體內(nèi)， 是否接受了導(dǎo)入的基因，均可用原位 PCR技術(shù)來證實(shí)。因此，原位 PCR技術(shù)成為重要的檢測手段。4.2 用于內(nèi)源性基因的檢測4.2.1 異?；虻臋z測機(jī)體內(nèi)基因的突變、 重排、也可用原位 PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排， 對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應(yīng)用前景。4.2.2 固有基因的檢測對于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝的低表達(dá)固有基因， 原位雜

30、交技術(shù)因基因拷貝數(shù)太少而無能為力， 液相 PCR雖可進(jìn)行擴(kuò)增檢測出來， 但不能確定含有該基因的細(xì)胞類型，原位 PCR技術(shù)則彌補(bǔ)了上述兩種技術(shù)的不足， 使得我們能夠?qū)θ祟惛鞣N基因進(jìn)行檢測，而完成人類基因圖的繪制。反向 PCR反向PCR(reversePCR)是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī) PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間 DNA 片段 .實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對該段 DNA 進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接， 再用一對反向的引物進(jìn)行 PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進(jìn)行分析研究 .反向 PCR的目的在于

31、擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向 PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA 區(qū)兩末端序列互補(bǔ)， 但兩引物 3端是相互反向的。 擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用 DNA 連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過反向 PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀 DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上 DNA 片段序列的識(shí)別十分重要。PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段，反向 PCR可

32、擴(kuò)增中間一段已知序列， 而兩端序列未知的基因片段不擴(kuò)增。反向 PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的 DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成 DNA。反向 PCR可用于研究與已知 DNA 區(qū)段相連接的未知染色體序列， 因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。 這時(shí)選擇的引物雖然與核心 DNA 區(qū)兩末端序列互補(bǔ)， 但兩引物 3端是相互反向的。 擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品 DNA，然后用 DNA 連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀 DNA 分子，通過反向 PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段； 現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀 DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和

33、基因8/11.庫染色體上 DNA 片段序列的識(shí)別十分重要。該方法的不足是： 需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA 片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或 Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向 PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。利用反向 PCR可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知DNA 片段的序列，并可將僅知部分序列的全長 cDNA 進(jìn)行分子克隆， 建立全長的 DNA 探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列 DNA 旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。

34、用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解 DNA。反向 PCR所擴(kuò)增的片段的大小由 PCR擴(kuò)增片段的大小決定，目前， PCR擴(kuò)增的實(shí)際上限為 3-4kb。在許多情況下，首先 需要進(jìn)行 Southern 雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向 PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向 PCR只能擴(kuò)增引物所定模板 (依賴于引物 )的上游 或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò)增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類 型決定的接點(diǎn) (例如，互補(bǔ)突頭連接與鈍頭連接 )。對于擴(kuò)增左翼或右翼序列，初試時(shí) 最好靠近識(shí)別上個(gè)堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向PCR從含有大量

35、不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入合適的酶切位點(diǎn)。用 T4 連接酶在稀 DNA 濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中，為產(chǎn)生對反向 PCR大小適當(dāng)?shù)?DNA 片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán) 化前需用 Klenow 或噬菌體 T4DNA聚合酶修理 (鈍化 )。連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切 酶失活。聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同，例如， 94-30 秒變性， 58-30 秒引物退火， Taq聚合酶 70延伸 3 分鐘，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)?？筛淖?PCR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測序時(shí)，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴(kuò)增引物更為有用，它使

36、測序引物擴(kuò)增部 分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點(diǎn)更近，減少了擴(kuò)增引物的干擾。描述一種大聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知成幾何級數(shù)擴(kuò)增用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的，以產(chǎn)生適合于擴(kuò)增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子的引物同源于環(huán)上核心區(qū) 的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)這種反向方法可用于擴(kuò)增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列 探針或測定邊側(cè)區(qū)域本身的上下游序列。逆轉(zhuǎn)錄 PCR1 概念RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄 RCR（ reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí) PCR（real time PC

37、R）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄 PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在 RT-PCR中，一條 RNA鏈被逆轉(zhuǎn)9/11.錄成為互補(bǔ) DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。由一條 RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ) DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴 RNA 的 DNA 聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后， DNA 的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA 的 DNA 聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被RNA酶 H 降解，留下互補(bǔ) DNA。RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種 RNA的含量。（檢測基因表達(dá)的方法，參見 Northern B