臨床微生物學(xué)檢驗

1、臨床微生物學(xué)檢驗各種微生物的鑒定流程革蘭陽性菌的簡易鑒定流程接種不規(guī)則，棒狀桿菌屬24h觀察菌落形態(tài)Bap生長良好參閱革蘭陰性桿菌鑒定流程圖轉(zhuǎn)純MAC生長良好G+球菌 革蘭陽性球菌 成隊、成鏈排列 凝固酶陰性 葡萄球菌或微球菌 革蘭染色形態(tài)金葡菌CAMP實驗溶血李斯特桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌規(guī)則桿狀觸酶+G+桿菌觸酶-凝固酶陰性凝固酶陽性否B群鏈球菌 肺炎鏈球菌其他 草綠色鏈球菌或 腸球菌結(jié)果GP卡是其他鏈球菌 ，化膿鏈球菌調(diào)菌懸液0.85-0.9麥?zhǔn)宵c，上GP卡出結(jié)果G+圓形卵圓形YST卡結(jié)果革蘭陰性菌（非糞便中）簡易鑒定流程 接種 Bap生長良好MAC生長良好銅綠單胞菌粉紅色或紅色菌落 較

2、小、無色透明半透明菌落分純MAC24h菌落有金屬色澤 葡萄氣味OX陽性調(diào)菌懸液0.65-0.7麥?zhǔn)宵c，上GN卡BAP上/遷移生長24h出鑒定結(jié)果陰性是洋蔥伯克霍爾德菌 類鼻疽伯克氏菌、巴斯德菌、其他否是變形桿菌屬否大腸桿菌、沙雷菌, 枸櫞酸菌屬, 腸桿菌屬, 嗜麥芽窄食單胞菌, 不動桿菌屬, 部分洋蔥，其他上機接種MACTCBSSS24h無色、透明半透明菌落中心黑色菌落黃色菌落24h凝集G-,魚群排列的弧菌革蘭染色米泔水樣便凝集診斷學(xué)清可疑沙門菌可疑志賀菌KIA、MIU疑似霍亂弧菌診斷學(xué)清診斷學(xué)清上機凝集上報疾控中心及主管部門出結(jié)果聯(lián)系臨床，詢問病史扁平無色半透明蠟滴狀藍綠色疑似副溶血糞便中細

3、菌（腸道糞便菌）鑒定流程圖 巧克力平板用于分離，BAP平板上在沒有添加V因子的情況下不生長流感嗜血桿菌 腦膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌（卡他莫拉氏菌） 接種血瓊脂平板巧克力平板CO2培養(yǎng)箱24h光滑濕潤透明或半透明菌落結(jié)果GN卡上機OX陽性、H2O2陽性G-球菌雙球菌3種革蘭氏陰性雙球菌可能存在的部位 淋病奈瑟氏菌是陰道和咽部的致病菌,關(guān)節(jié)液中罕見 腦膜炎奈瑟氏菌是腦脊液、血標(biāo)本中的致病菌, 陰道(肛門)和痰中罕見 卡他莫拉氏菌是僅為痰、耳、眼睛和竇吸取物中的致病菌厭氧菌鑒定臨床標(biāo)本液體培養(yǎng)基（曾軍）厭氧血平板、選擇培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基需氧培養(yǎng)24h厭氧培養(yǎng)48h48 h挑4-6個形狀不同菌落，分別

4、接種厭氧需養(yǎng)血瓊脂平板確定是否厭氧菌接種平板需氧培養(yǎng)接種平板厭氧培養(yǎng)不生長生長涂片革蘭染色厭氧培養(yǎng)48h需氧培養(yǎng)分離，生化試驗，鑒定菌落觀察，形態(tài)染色專性厭氧菌兼性厭氧或需養(yǎng)生長L型細菌 細菌L型是細菌因變異而產(chǎn)生的細胞壁缺陷型。根據(jù)其細胞壁的缺陷程度不同可分為兩類：原生質(zhì)體和圓球體。 細菌L型呈桿狀、絲狀、圓形或卵圓形等多種形態(tài)，大小差別很大。因細胞壁缺失，革蘭染色常發(fā)生改變，革蘭陽性菌變?yōu)長型后，可染成陰性（有時仍為陽性）。在同一張片子上可同時見到革蘭陽性及陰性菌，著色不均。細胞壁染色，菌體呈深紫色。 細菌 L型需在高滲和營養(yǎng)豐富的條件下才能生長，生長緩慢，培養(yǎng)27天可見生長。在液體培養(yǎng)基

5、中，呈顆粒狀生長，顆粒可粘附于管壁或沉淀于管底。在固體培養(yǎng)基中，有3種類型：“油煎蛋”樣（L型）、顆粒狀（G型）菌落、 和絲狀（F型）菌落。 真菌培養(yǎng) 可疑隱球菌屬YST卡酵母菌陽性圓形卵圓形菌體革蘭染色24h沙保培養(yǎng)基標(biāo)本墨汁負染粘液淡褐色鑒定可疑霉菌屬可見分生孢子頭和足細胞24h厚膜孢子實驗上機鑒定牙管形成實驗少量菌落陰性陽性再培養(yǎng)24h白色念珠菌各種鑒定試驗革蘭染色 原理：細菌的不同顯色反應(yīng)是由于細胞壁對乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)決定的。經(jīng)結(jié)晶紫染色的細胞用碘液處理后形成不溶性復(fù)合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步結(jié)果是一樣的，但在G+細胞中，乙醇還能使厚

6、的肽聚糖層脫水，導(dǎo)致孔隙變小，由于結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物分子太大，不能通過細胞壁，保持著紫色。在G細胞中，乙醇處理不但破壞了胞壁外膜，還可能損傷肽聚糖層和細胞質(zhì)膜，于是被乙醇溶解的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物從細胞中滲漏出來，當(dāng)再用襯托的染色液復(fù)染時，顯現(xiàn)紅色。紅色染料雖然也能進入已染成紫色的G+細胞，但被紫色蓋沒，紅色顯示不出來。涂片龍膽紫液染色10s，水洗，甩干復(fù)染脫色初染媒染固定其作用是增強染料與細菌的親和力，更好地加強染料與細胞的結(jié)合。目的：1、殺死細菌；2、使菌體與玻片粘附牢固；3、菌體蛋 白變性，易于著色。經(jīng)火焰固定待干鏡檢目的是使脫色的細菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進行比較。幫助染料從

7、被染色的細胞中脫色。利用細菌對染料脫色的難易程度不同，而將細菌加以區(qū)分。革蘭陽性細菌不易被脫色劑脫色，而革蘭陰性細菌則易被脫色。酒精脫色10-20s，水洗，甩干碘溶液染色10s，水洗，甩干使細菌各成分著色砂黃溶液，8s，水洗，甩干紅色紫色革蘭陰性菌革蘭陽性菌抗酸染色 原理:分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達到染色目的。涂片固定復(fù)染脫色初染使各成分脫色，抗酸桿菌不易脫色鏡檢藍色背景下，染成紅色細長或略帶彎曲的桿菌，并有分支趨向。酸性酒精溶液，2min，水洗甩干使各成分著色石碳酸復(fù)紅

8、溶液，5min，水洗甩干經(jīng)火焰固定目的：1、殺死細菌；2、使菌體與玻片粘附牢固；3、菌體蛋 白變性，易于著色。復(fù)染各成分成藍色亞甲基藍溶液，30s，水洗甩干氧化酶實驗 原理：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化性細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。 步驟：取潔凈的濾紙一小塊，蘸取菌苔少許，加1滴10g/L鹽酸二甲基對苯二胺溶液于菌落上，觀察顏色變化。氧化酶陽性觸酶實驗 原理:具有觸酶(過氧化氫酶)的細菌，能催化過氧化氫，放出新生態(tài)氧，繼而形成分子氧，出現(xiàn)氣泡。 步驟：取3%過氧化氫溶液0.5ml，滴加于不含血液的細菌瓊脂

9、培養(yǎng)物上，或取13ml滴加入鹽水菌懸液中。觸酶陽性CAMP實驗 原理：B群鏈球菌具有“CAMP”因子，能促進葡萄球菌溶血素的活性,使兩種細菌在劃線處呈現(xiàn)箭頭形透明溶血區(qū)。 操作步驟：先用產(chǎn)溶血素的金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上劃一橫線，再取待檢的鏈球菌與前一劃線作垂直劃線接種，兩者相距0.51cm。置35C孵育1824小時，觀察結(jié)果。OPTOCHIN實驗 原理：Optochin可干擾肺炎鏈球菌葉酸的生物合成，抑制該菌的生長，故肺炎鏈球菌對其敏感，而其他鏈球菌對其耐藥。 操作步驟：將待檢的溶血的鏈球菌均勻地徒步在血瓊脂平板上，貼放Optochin紙片（含藥5ug），35C孵育1824小時，觀察抑菌

10、圈的大小。左側(cè)為奧普托欣檢測陽性，右側(cè)為陰性桿菌肽實驗 原理：A群鏈球菌對桿菌肽敏感，而其他群鏈球菌對桿菌肽耐藥。 方法：挑取被檢菌落，密涂于血瓊脂平板上，接種量應(yīng)大，以免出現(xiàn)假陽性。貼上桿菌肽紙片，35過夜。相關(guān)抗原抗體檢測肺炎支原體檢測原理：本培養(yǎng)和檢測根據(jù)肺炎支原體在宿主細胞內(nèi)代謝積累分解葡萄糖，通過化學(xué)顯色的方法在較短的時間內(nèi)快速檢測出肺炎支原體。干粉培養(yǎng)基1.5ml超純水置35-37溫箱孵育24小時充分溶解陰性孔加50ul棉拭子于培養(yǎng)瓶中攪動數(shù)次取出棉拭子，棄去混勻每空吸取50ul石蠟油液封觀察結(jié)果結(jié)果判斷沙眼衣原體抗原檢測 檢驗原理：用抗衣原體脂多糖單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗

11、體分別固定于固相硝酸纖維素膜，并和膠體金標(biāo)記的另一抗衣原體脂多糖單克隆抗體及其他試劑和原料制成，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心的形式建立的衣原體檢測方法，用于女性宮頸和男性尿道中沙眼衣原體抗原的檢測。結(jié)果判讀陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線（C）有一條紅線，檢測線（T）無紅線出現(xiàn)； 陽性結(jié)果：除質(zhì)控線外，另有一條紅線出現(xiàn)在檢測（T）； 無效結(jié)果：質(zhì)控線不出現(xiàn)紅線，則結(jié)果無效。沙門、志賀菌血清學(xué)實驗 原理：用已知的沙門菌或志賀菌診斷血清在載玻片上直接與細菌培養(yǎng)物或菌懸液混合，若出現(xiàn)肉眼可見的特異性凝集塊，表示該菌即為沙門菌或志賀菌。 操作步驟：沙門菌：1、首先用可凝菌與沙門菌O多價血清（A-F）進行凝

12、集，若呈明顯凝集，提示被檢菌株可能屬于AF6個O群范圍內(nèi)，再用H因子第一相（特異相）定型，最后用H因子第二相（非特異相）輔助定型。2、若生化反應(yīng)符合沙門菌，但AF多價血清不凝集，首先考慮是否出現(xiàn)表面抗原（Vi抗原），因為Vi抗原能阻斷O抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生凝集，加熱可將其破壞。應(yīng)將細菌制成菌懸液，放入沸水中加熱1530分鐘，冷卻后再次做凝集試驗。若去除Vi抗原后仍不凝集，此時應(yīng)考慮是否為AF以外菌群，應(yīng)送專業(yè)實驗室進行鑒定。 志賀菌：1、首先用志賀菌屬4種多價血清作玻片凝集，如凝集再進一步作血清定型（用福氏志賀菌16型、痢疾志賀菌12型、鮑氏志賀菌16型以及宋內(nèi)志賀菌鑒定到種、型）。一般先用福氏

13、志賀菌血清凝集，因我國以B群最為多見，如出現(xiàn)生化反應(yīng)符合志賀菌，而與4種多價血清不凝集的菌株，應(yīng)考慮為K抗原存在，將菌液加熱到100C1530分鐘后再進行凝集。2、與各型志賀菌血清不發(fā)生凝集，菌落特征與生化反應(yīng)似痢疾志賀菌，可考慮非典型痢疾血清型，應(yīng)送到專業(yè)實驗室進行鑒定。 結(jié)果判斷： 陰性：試驗一側(cè)及對照一側(cè)均勻混濁。陽性：對照一側(cè)均勻混濁，實驗一側(cè)明顯凝集。自凝：實驗一側(cè)及對照一側(cè)凝集?？咕幬锩舾行栽囼濳-B法藥敏實驗 方法原理：紙片擴散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成一種濃度梯度。在藥物擴散的同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的測試菌不能生長，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續(xù)生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈。不同抗菌藥物抑菌圈的直徑因受藥物在瓊脂中的擴散速率的影響而可能不同，抑菌圈的大小可反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關(guān)，即抑菌圈越大，MIC越小。 簡易操作程序： 選擇純培養(yǎng)菌落貼特定藥敏紙片藥敏平板平衡室溫涂布接種法接種藥敏平