2021浙科版選修1第一部分《實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離》word素材4

1、2021 浙科版選修 1 第一局部 ?實(shí)驗(yàn)一 大腸桿菌 的培養(yǎng)和別離? word 素材 4根底知識和操作過程梳理一、大腸桿菌 細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物。細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞 質(zhì)等。細(xì)菌無成型的細(xì)胞核，細(xì)胞壁由肽聚糖組成。由于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu) 不同，細(xì)菌可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽性菌細(xì)胞 壁厚，無莢膜，多產(chǎn)生外毒素；革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁薄，有莢膜，多產(chǎn)生 內(nèi)毒素。革蘭氏陽性菌對青霉素更為敏銳。大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一樣對 人無害，但任何大腸桿菌進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。大腸 桿菌在基因工程技術(shù)中被廣泛的應(yīng)用，它的質(zhì)粒是最常

2、用的運(yùn)載體，它也 是基因工程中常用的受體細(xì)胞。二、培養(yǎng)基配置 微生物生命活動過程中需要的化合物有碳源、氮源、生長因子、無機(jī) 鹽和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生長因子是微生物生長不 可缺少的微量有機(jī)物，但不一定需要外界補(bǔ)充，有的微生物能夠自身合成。 在提供上述幾種要緊營養(yǎng)物質(zhì)的根底上， 培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對 p H、專門營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。我們一樣用 LB 液體培養(yǎng)基來擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌， 培養(yǎng)后可在 LB 固體 培養(yǎng)基上劃線別離。以下為本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基配置步驟：1. 稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g,酵母提取物0.25g,氯化鈉0. 5g,加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基

3、時(shí)還需加1g瓊脂。2. 溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到 50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí) 還需加瓊脂，整個(gè)過程持續(xù)用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯 破裂。3. 調(diào)pH:用1mol/L NaOH溶液調(diào)劑pH至偏堿性。4. 滅菌：在兩個(gè)250ml的三角瓶中分不裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和5 0ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。5. 倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60C左右時(shí)在酒精燈火焰鄰 近操作進(jìn)行。其過程是：將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培 養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；用左手

4、將培養(yǎng)皿翻開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng) 基倒入培養(yǎng)皿，趕忙蓋上皿蓋；待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。倒過來放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表 面。向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移已火菌的培養(yǎng)基時(shí)，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否 那么，空氣中雜菌會在這些粘附培養(yǎng)基上繁育，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。三、滅菌和消毒1. 無菌技術(shù)：對實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒； 將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；為幸免周圍微生物 污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；幸免已滅菌處理的材料用具與 周圍的物品相接觸。2. 消毒方法：日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；對一些不耐高 溫的液體，那

5、么使用巴氏消毒法；對接種室、接種箱或超凈工作臺第一噴 灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒成效，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒； 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。3. 滅菌方法：接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；培養(yǎng) 基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；外表 滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。4.比擬消毒和滅菌:比擬項(xiàng)理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫順局部生活狀態(tài)的微生物不能火菌強(qiáng)烈全部微生物能5.考前須知：實(shí)驗(yàn)中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸 水后容易造成污染。滅菌后，通常在 6080C烘箱中除去滅菌時(shí)的水分；

6、 物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要第一翻開排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi) 冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排氣閥連續(xù)加熱，加熱 終止切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務(wù)必降至零時(shí)翻開鍋蓋，其目 的是防止容器中的液體暴沸；在用任何器皿轉(zhuǎn)接時(shí)，瓶塞和封口膜只能 夾在手上，不許放在臺面上，接種時(shí)要在酒精燈火焰旁操作；培養(yǎng)基一 定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否那么容易污染；接種時(shí) 要膽大心細(xì)，動作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵；接種后，培養(yǎng)皿必須倒 放蓋在下方在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放那么水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到 接種后的培養(yǎng)基外表，水流擴(kuò)散會使菌落擴(kuò)散，就專門難形成單菌落了。四、細(xì)菌的別離

7、1劃線別離法：用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上 劃線，在劃線過程中菌液逐步減少，細(xì)菌也逐步減少。劃線到最后，可使 細(xì)菌間的距離加大。在培養(yǎng)1020h后，可由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落 可不能重疊。如果再將每個(gè)菌落分不接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上， 在斜面上劃線，那么每個(gè)斜面的菌群確實(shí)是由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火 焰旁將培養(yǎng)皿略微翻開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液， 迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第 1 次平行劃線 35條，轉(zhuǎn) 動培養(yǎng)皿約 70角，用燒過冷卻的接種針，通過第 1 次劃線局部作第 2次

8、平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線局部作第三次平行劃 線和通過第三次平行劃線局部作第四次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平 板外表成 30角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃 破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線 外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種 和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼 燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者。2.涂布別離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到 10- 510- 7之 間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)

9、皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分 開的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿有 20個(gè)以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個(gè)菌落分 不接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。劃線別離法，方法簡單；涂布別離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜 些。細(xì)菌的兩種別離法各有優(yōu)點(diǎn) ,都可采納。五、菌落和菌種種類的識別單個(gè)細(xì)菌用肉眼是看不見的，然而，當(dāng)單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基 上大量繁育時(shí)，便會形成一個(gè)肉眼可見的、具有一定形狀結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群 體，叫做菌落。不同種類的細(xì)菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤 度、透亮度等方面具有一定的特點(diǎn)。細(xì)菌的菌落外表一樣是光滑而潮濕的，有黏稠性，多數(shù)透亮或半透亮， 但也有細(xì)菌的菌落外表是枯燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可 產(chǎn)生孢子，因此菌落外表是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺，長孢子后就成粉末狀， 由于菌絲和孢子有多種色素，因此在菌落培養(yǎng)基底部和菌落外表都有不同 的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動；酵母菌落類似于細(xì)菌菌落，外表光滑而 潮濕