分光光度法測定生鮮乳及乳粉中亞硝酸鹽方法優(yōu)化

1、 分光光度法測定生鮮乳及乳粉中亞硝酸鹽方法優(yōu)化 摘要：亞硝酸鹽是致癌物質，檢測食品中的亞硝酸鹽，對食品安全的意義尤為重要。其中乳及其乳制品的檢測方法，目前主要以gb 5009.33的檢測方法為主，其中第二法分光光度法術以使用廣泛，但國標法中分光光度法測定亞硝酸鹽存在取樣量大，批量操作過程復雜情況。本課題主要針對以上問題，用分光光度法對生鮮乳及乳粉中的亞硝酸鹽含量測定過程進行優(yōu)化。優(yōu)化后，樣品取樣量生鮮乳為18ml,奶粉為2g，加標回收實驗回收率達到88%以上；rsd值為1.06%1.93%，與國標法回收率90%；rsd值為0.66%1.44%。從回收率及rsd可以得出，優(yōu)化后的方法數據準確度與

2、國標法相當。操作過程中使用高速離心機，能更好分離提取溶液，能很好的提升工作效率并保證實驗的準確性，具有較好的操作性。關鍵詞：亞硝酸鹽；分光光度法；乳制品1.引言亞硝酸鹽是自然界環(huán)境中最普遍存在的含氮化合物之一1，是自然界常見的有害化學成分。因其具有作為發(fā)色劑、防腐劑以及增強產品的風味的作用而被添加到食品中來。牛奶及其制品因其中含有豐富而全面的營養(yǎng)物質，中國居民膳食指南推薦每日攝入300g及以上牛奶或其制品，是人們日常生活中重要的日常食品。事實上天然牛奶中一般不含或含極有少量的亞硝酸鹽，一般不會危害人體健康。牛奶中出現較高的亞硝酸鹽可能的來源主要有：來源一是草料在喂養(yǎng)奶牛后，在其消化系統消化過程

3、中產生，來源二是在飼喂過程產生，來源三是生產用水中存在，來源四是為了延長牛奶的保質期人為添加2 。由于亞硝酸鹽對人體健康有如此嚴重的危害，而牛奶及其奶制品與我們生活息息相關，因此，檢測其在乳及乳制品中的含量和可能被人體攝入量應引起高度重視。目前國內外測定食品中亞硝酸鹽含量的方法主要有熒光法、分光光度計法、離子色譜法及催化光度法等。分光光度法由于實用性強，設備常用，因此為國內外測定食品中亞硝酸鹽時常見選擇的方法3。但是目前國標法中的分光光度法實驗存在樣品使用量大、試劑消耗大、大量樣品操作不靈活、同時沉淀后過濾難等問題。為了減少樣品跟試劑的使用以及提高實驗的效率，本實驗對國標法的操作進行了適當的調

4、整優(yōu)化。2.材料與方法2.1實驗方法國家標準gb 5009.33-2016第二法中的分光光度法測定樣品的亞硝酸鹽的實驗原理是樣品中加入乙酸鋅溶液以除去蛋白質及脂肪。此時在弱酸環(huán)境下,對氨基苯磺酸會與亞硝酸鹽發(fā)生重氮化,得到的產物再與鹽酸萘乙二胺偶合反應形成紫紅色的特殊染料,在特定波長下，會呈現線性關系?；谙嗤膶嶒炘砬闆r下，參照卞玲娟等4對實驗的改進進行修改的實驗分析，對方法進行優(yōu)化，減少取樣量，便于大批量樣品的前處理，在沸水浴搖床上進行震搖能有效促進樣品與飽和硼砂溶液的混合。在沉淀蛋白和脂肪的操作中使用高速離心機，更有效地分離和沉淀，更方便之后的過濾操作。本次優(yōu)化實驗主要以鮮牛乳及奶粉作

5、為實驗對象，進行加標回收實驗，驗證方法的可行性。同時按照國標法實驗方法操作，作為對比實驗。2.2試劑配制亞硝酸鈉標準使用溶液（5.0g/ml）：吸取2.50ml亞硝酸鈉標準物質（200g/ml）于100ml容量瓶中，定容，搖勻。亞鐵氰化鉀溶液(106g/l)：在電子天平上稱106.0g亞鐵氰化鉀于小燒杯中,加去離子水溶解,稀釋至1000ml。乙酸鋅溶液(220g/l)：在電子天平上稱220.0g乙酸鋅于燒杯中,加入30ml冰乙酸進行溶解,加去離子水稀釋至1000ml。飽和硼砂溶液(50g/l)：在電子天平上稱5.0g硼酸鈉試劑,用100ml熱水進行溶解,冷卻后備用。鹽酸萘乙二胺溶液(2g/l)

6、：在萬分之一電子天平上準確稱取0.2g鹽酸萘乙二胺,加入去離子水定容到100ml,混勻后置于棕色瓶中進行避光低溫保存。鹽酸(20%):用量筒小心量取20ml鹽酸,加入去離子水稀釋至100ml。對氨基苯磺酸溶液(4g/l)：在萬分之一電子天平上準確稱取0.4g對氨基苯磺酸,加入濃度為20%鹽酸定容到100ml,小心混勻后置于棕色瓶中避光低溫保存。2.3儀器與設備uv1800型可見光分光光度計（日本島津公司），分析天平，sigma離心機2.4計算公式亞硝酸鹽(以亞硝酸鈉計)的含量計算:x1代表測試樣品中亞硝酸鈉的含量,單位為毫克每千克(mg/kg);v1代表測定用樣液體積,單位為毫升(ml);v2

7、代表試樣處理液總體積,單位為毫升(ml)；m2代表測定用樣液中亞硝酸鈉的質量,單位為微克(g);m3代表試樣質量,單位為克(g);1000代表轉換系數3.實驗步驟3.1優(yōu)化方法的加標回收實驗3.1.1樣品前處理生鮮乳樣品：取10支50ml離心管，用移液管往離心管準確取試樣18ml樣品，并用萬分之一天平稱重。分別加標0.0ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.4ug/ml各兩支，做好標記，各加2.5ml50g/l飽和硼砂溶液，加入70左右的去離子水12ml，混勻。乳粉：取10支50ml離心管，萬分之一天平稱取試樣2g(精確至0.001g)，分別加標0.0ug/ml

8、、0.9ug/ml、1.8ug/ml、2.7ug/ml、3.6ug/ml各兩支，做好標記。往各離心管加2.5ml50g/l飽和硼砂溶液，加入70左右的去離子水30ml，混勻。將上述離心管，放于搖床沸水浴加熱震搖15分鐘，取出置冷水浴中冷卻至室溫。再向離心管中加入1ml106g/l亞鐵氰化鉀溶液，置于振蕩器中振勻，再加入1ml220g/l乙酸鋅溶液并加水定容到40ml，振蕩器振勻，放置30分鐘后以25攝氏度，轉速r9000離心3分鐘。上清液用濾紙過濾，棄去少量初始濾液后，收集剩余濾液備用。3.1.2測定取8支10ml帶塞比色分別加入0.000、0.015、0.030、0.060、0.090、0.

9、120、0.150、0.180ml亞硝酸鈉標準使用液，另吸取4ml上述樣品濾液于10ml帶塞比色管中。于標準管與試樣管中分別加入0.6ml4g/l對氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置5min后，分別加入0.3ml2g/l鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min。用1cm 比色杯，以零管調節(jié)零點，于波長538nm 處測吸光度，繪制標準曲線。同時做試劑空白。3.2對照實驗3.2.1國標法樣品的前處理生鮮乳樣品：取10個250ml具塞錐形瓶，用天平稱取生鮮乳90g(精確至0.001g),置于250ml具塞錐形瓶中，分別加標0.0ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.

10、4 ug/ml各兩支，做好標記。分別往具塞錐形瓶中加入12.5ml飽和硼砂溶液，然后加入70左右的水約60ml，搖勻。乳粉：取10支150ml具塞錐形瓶，各稱取乳粉樣品10g(精確至0.001g),置于瓶中。分別加標0.0ug/ml、0.9ug/ml、1.8ug/ml、2.7ug/ml、3.6ug/ml各兩支，做好標記。各加入12.5ml飽和硼砂溶液,加入70左右的水150ml，混勻。將上述錐形瓶于沸水浴中反應15分鐘,取出置冷水浴中冷卻,并放置至室溫。定量轉移上述提取液至200ml容量瓶中,加入5ml106g/l亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,再加入5ml220g/l乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質。加水至刻

11、度,搖勻,放置30min,除去上層脂肪,上清液用濾紙過濾,濾液備用。3.2.2國標法的測定吸取0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml亞硝酸鈉標準使用液,分別置于50ml帶塞比色管中，另吸取40.0ml上述濾液于相同規(guī)格比色管中。于標準管與試樣管中分別加入2ml4g/l對氨基苯磺酸溶液,混勻,靜置3min5min后各加入1ml2g/l鹽酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混勻,靜置15min,用1cm比色杯,以零管調節(jié)零點,于波長538nm處 測吸光度,繪制標準曲線比較。同時做試劑空白。54.結果分析按照優(yōu)化后的方法和

12、國標方法進行對比，先取得足量生鮮乳樣品，各分成五份，一份樣品直接按測試方法進行測定分析，另外四份分別加標0.1、0.2、0.3、0.4ug/ml，每份樣品都進行6組平行測試，測定的結果見表1和表2。表1 生鮮乳優(yōu)化實驗加標回收結果樣品測定值（mg/kg）加標量（ug/ml）加標測定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.0290.10.12293.001.260.20.21191.001.190.30.29789.331.820.40.38188.001.55由表1可以看到，經過優(yōu)化后的試驗方法在測定生鮮乳的加標回收率在88%93%之間，相對標準偏差在1.19%1.82%之間。表2 生鮮乳

13、國家標準法測定加標回收結果樣品測定值（mg/kg）加標量（ug/ml）加標測定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.0310.10.12695.001.330.20.21893.500.790.30.30390.670.660.40.39390.500.81由表2中可以看出，國標方法對生鮮乳測定的回收率在90.5%95%之間，相對標準偏差在0.66%1.33%之間。按照優(yōu)化后的方法和國標方法進行試驗比較，取足量奶粉樣品，各分成五份，一份直接測試樣品含量，另外四份分別加標0.9、1.8、2.7、3.6ug/ml，每一份樣品都進行6組平行測試，測定的結果見表3和表4。表3 奶粉優(yōu)化實驗加標回

14、收結果樣品測定值（mg/kg）加標量（ug/ml）加標測定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.2520.91.10795.001.371.81.94494.001.062.72.70090.671.583.63.43888.501.93由表3可見，優(yōu)化后的測試方法在測定奶粉樣品的加標回收率在88.5%95%之間，相對標準偏差在1.06%1.93%之間。表4 奶粉國家標準法測定加標回收結果樣品測定值（mg/kg）加標量（ug/ml）加標測定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.2520.91.09894.001.081.81.87290.001.122.72.72791.671.2

15、63.63.50190.251.44表4是根據國標法對奶粉樣品進行加標回收測試，可以看出國標方法在測定奶粉的回收率在90.25%94%之間，其相對標準偏差在1.081.44之間。綜合表1以及表2的回收率發(fā)現，國標方法測得的回收率結果比優(yōu)化后的方法的結果略高一些，而從兩者的rsd值看，國標法rsd值0.66%1.33%也比優(yōu)化后的方法的rsd值1.19%1.82%小一些，但差別不大。而從表2、表3來看，兩種方法對奶粉的測定也有跟生鮮乳測試類似的結果。說明國標法比優(yōu)化后方法測得的結果相對更優(yōu)一些，從相對平均偏差來看也是國標法精密度更高一些，穩(wěn)定性更好一些。這其中原因可能是，經過優(yōu)化的試驗方法，其取

16、樣量比國標方法小很多，相對的樣品結果出現的誤差也會增大，樣品加標后，在處理過程中的損失也相對大一些。另外，從四個表中的數據看，隨著加標量的增加回收率有一個輕微下降的趨勢，可能的原因，一個是亞硝酸鹽相對不穩(wěn)定，加標量越多，損失越大，另外，由于隨著加標量的遞加，飽和硼砂溶液的添加量卻沒增加導致的，飽和硼砂溶液在實驗中是助提劑，可能會存在影響，后續(xù)可進行進一步的實驗研究。依據沒加標的樣品實驗結果看，生鮮乳樣品的亞硝酸鹽含量非常低，比國標的限量值低得多，而從肖琴等6的實驗結果看，正常生鮮乳得亞硝酸鹽在0.03140.1069mg/kg左右，遠低于國標的限制值。因此，用優(yōu)化后的實驗方法替代國標法進行實驗

17、有助于提高工作效率，減少試劑的使用，其實驗結果與國家標準方法的檢測結果的回收率和精密度并無太大差異。而奶粉的實驗結果也是同樣道理5.結論優(yōu)化后的實驗，生鮮乳取樣量僅18ml，乳粉取樣量僅2g，試劑的使用僅為國標法的1/5，同時在實驗過程中省去一步樣品容器之間的轉移過程，這樣的轉移步驟的減少可以減少亞硝酸鹽的損失，增加實驗的準確性。在去除樣品中的蛋白脂肪過程中，通過離心可以使蛋白質等沉淀，脂肪上浮，能快速得到澄清樣液，可以大幅提高過濾效率，在處理大量樣品量時有更大得效率提升。在提高了工作效率，減少試劑用量的同時，優(yōu)化后的方法的檢測結果與國標法檢測結果回收率基本相同，其精密度也差別不大，證明該方法實用可靠。后續(xù)可通過繼續(xù)增加實驗進一步驗證其方法的精密度及檢出限，或者拓寬檢測范圍，對其他產品進行驗證。參考文獻：1.丁曉雯,柳春紅.食品安全學.北京:中國農業(yè)出版社,2011.2.趙佳,董