趨化因子CCL5及其受體CCR5在川崎病中的表達(dá)及意義開(kāi)題報(bào)告

1、碩士研究生開(kāi)題報(bào)告學(xué) 院 專 業(yè) 研 究 生 姓 名 學(xué) 號(hào) 導(dǎo)師姓名、職稱 入 學(xué) 年 月 年 月 填寫說(shuō) 明一、學(xué)位論文開(kāi)題報(bào)告是研究生開(kāi)展學(xué)位論文工作的重要環(huán)節(jié),開(kāi)題報(bào)告一般于第三學(xué)期進(jìn)行，完成時(shí)間最遲不能超過(guò)第四學(xué)期。二、開(kāi)題報(bào)告評(píng)議小組由3-5名副高職以上職稱的專家組成。評(píng)議小組設(shè)秘書一人，協(xié)助組織和處理評(píng)議事宜，并做好詳細(xì)記錄，記錄由學(xué)院作為原始材料保存?zhèn)洳?。三、本開(kāi)題報(bào)告一式二份，學(xué)院、研究生處各留一份。一、論文開(kāi)題報(bào)告 （申請(qǐng)時(shí)間： 年 月 日 ）論文題目：趨化因子ccl5及其受體ccr5在川崎病中的表達(dá)及意義研究方向：臨床免疫學(xué)1 立論依據(jù)（所選課題的科學(xué)意義和應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)

2、外研究現(xiàn)狀分析）：一、研究意義：川崎病(kawasaki disease，kd)是一種急性全身性中小血管炎性綜合征，主要累及冠狀動(dòng)脈，可以引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈狹窄甚至心肌梗死，是兒童后天性心臟病的主要原因，并屬于自身免疫性疾病之一。其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，且發(fā)現(xiàn)該病至今其發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此，探尋與川崎病相關(guān)的細(xì)胞因子并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究具有重要的臨床意義。趨化因子與自身免疫性疾病的關(guān)系已經(jīng)成為人們?nèi)找嫜芯康臒狳c(diǎn)，但是趨化因子與川崎病的研究報(bào)告目前還較少，尤其是趨化因子ccl5及其受體ccr5在川崎病中的表達(dá)作用，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。二、川崎病研究現(xiàn)狀：川崎病(kawasaki d

3、isease，kd)，又稱為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征(mucocutaneous lymph node syndrome, mcls)，是一種好發(fā)于 5 歲以下兒童和嬰幼兒的急性全身性血管炎性疾病，可累及動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管，其中以冠脈受累最為嚴(yán)重。它導(dǎo)致冠脈擴(kuò)張、冠脈瘤、狹窄甚至閉鎖，冠狀動(dòng)脈損害包括冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張( 冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑 3 mm) 和冠狀動(dòng)脈瘤( 冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑 8 mm) ，已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國(guó)家中兒童獲得性心臟病的最常見(jiàn)原因1-3。川崎病的嚴(yán)重性取決于冠狀動(dòng)脈損傷程度，部分患兒發(fā)展為冠狀動(dòng)脈瘤后容易形成血栓，可進(jìn)展為冠狀動(dòng)脈阻塞性擴(kuò)張，從而引起心肌缺血甚至發(fā)生心肌梗死及青壯年猝死。自從上世

4、紀(jì)60年代日本醫(yī)生川崎富作首次報(bào)道后，世界各地均有報(bào)道，其發(fā)病率在日本、韓國(guó)、臺(tái)灣等亞洲地區(qū)5歲以下兒童中為69-213/100 000，并且近年來(lái)呈上升趨勢(shì)4-9。因此，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的探究，但尚未明確具體發(fā)生機(jī)制。目前研究顯示，川崎病發(fā)病主要與以下因素有關(guān)：微生物毒素類超抗原介導(dǎo)作用，某些微生物產(chǎn)物對(duì)t細(xì)胞有超強(qiáng)激活能力；免疫系統(tǒng)異常激活，t細(xì)胞和b細(xì)胞異常激活產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)引起血管內(nèi)皮損傷；種族遺傳因素等。其中，t細(xì)胞異?；罨谴ㄆ椴∶庖呦到y(tǒng)激活導(dǎo)致血管免疫損傷的始動(dòng)環(huán)節(jié)，川崎病急性期和亞急性期外周血t細(xì)胞亞群失衡，t淋巴細(xì)胞總數(shù)下降，cd4+t細(xì)胞數(shù)目

5、增多，cd8+t細(xì)胞數(shù)目減少，使細(xì)胞處于免疫活化狀態(tài)。異?；罨膖細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子、干擾素、白細(xì)胞介素 1、白細(xì)胞介素 6、白細(xì)胞介素 8、白細(xì)胞介素 10、內(nèi)皮素、血小板源生長(zhǎng)因子、超氧自由基、可溶性黏附分子 p-選擇素、一氧化氮等10，以上多方面因素影響損傷血管內(nèi)皮。綜上不難看出，川崎病的發(fā)生與cd4+輔助性t細(xì)胞有密切關(guān)系，由此推出ccr5作為活性th1淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志物，與其配體ccl5一起在川崎病的發(fā)病中占有相當(dāng)重要的地位。國(guó)外學(xué)者jhang11等已從基因多態(tài)性方面證實(shí)了ccr5與川崎病的關(guān)系，該研究發(fā)現(xiàn)ccr5( - 2135c /t )

6、啟動(dòng)子上t等位基因純合子的概率明顯高于先天性心臟病患兒，但2種基因型(cc+ct vs tt)在冠狀動(dòng)脈瘤患者和非冠狀動(dòng)脈瘤患者中比較無(wú)差異，提示 ccr5(-2135c/t )啟動(dòng)子多態(tài)性同kd的發(fā)病相關(guān)，但與冠狀動(dòng)脈瘤的發(fā)生無(wú)關(guān)。三、趨化因子ccl5及其受體ccr5的研究現(xiàn)狀：1.趨化因子及其受體的生物學(xué)特征：趨化因子（chemokines）是細(xì)胞因子超家族中的成員之一，是一類對(duì)細(xì)胞具有定向趨化吸引作用的小分子蛋白質(zhì)，它可以定向吸引免疫細(xì)胞參與免疫應(yīng)答和免疫病理過(guò)程12。到目前為止，至少有50種趨化因子被發(fā)現(xiàn)，其由70-125個(gè)氨基酸組成，分子量在8-11kd不等。大多數(shù)趨化因子含有4個(gè)保

7、守的半胱氨酸形成的兩個(gè)特征性的二硫鍵，故其有很相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)，c端為螺旋，n 端不規(guī)則，有比較高的生物學(xué)活性，與受體相結(jié)合。根據(jù)趨化因子n端4個(gè)保守半胱氨基酸的前兩個(gè)半胱氨基酸殘基的位置和數(shù)目，將其分為四類：若兩個(gè)保守的半胱氨基酸殘基位置相鄰時(shí)，歸類于cc家族，例如ccl5（rantes）、ccl3（mip-1）、ccl2（mcp-1）等。若兩個(gè)保守的半胱氨基酸殘基被一個(gè)任意的氨基酸隔開(kāi)，則屬于cxc家族，例如cxcl8（il-8）、cxcl10（ip-10）等，根據(jù)第一個(gè)半胱氨基酸前是否存在谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（elr）序列將其分為含elr的cxc 趨化因子和不含elr的cxc趨化因子。若

8、兩個(gè)保守的半胱氨基酸殘基被三個(gè)任意的氨基酸隔開(kāi)，則屬于cx3c家族，該家族只有一個(gè)成員即cx3cl1。只有一個(gè)保守的半胱氨基酸殘基，屬于 c家族。趨化因子受體（chemokines receptor）屬于 g 蛋白偶聯(lián)受體超家族，其結(jié)構(gòu)中均具有 7 個(gè)富含疏水氨基酸的跨膜片段，n 端與相應(yīng)的配體相結(jié)合，c 端位于細(xì)胞內(nèi)含有絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的激活與傳導(dǎo)，引起一系列的生理和病理活動(dòng)。趨化因子受體主要表達(dá)于骨髓來(lái)源的各種白細(xì)胞，也表達(dá)于上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。目前所知的趨化因子受體約有 19 種，根據(jù)與其結(jié)合的配體不同而命名，包括 1 種 xc 受體（xcr1）、6 種

9、 cxc 受體（cxcr1cxcr6）、11種 cc 受體（ccr1ccr11）和 1 種 cx3c 受體（cx3cr1），其中 cxcr 和 ccr研究較多13。一個(gè)亞家族內(nèi)，一種趨化因子可與幾種趨化因子受體相結(jié)合，一種趨化因子受體也可與幾種不同的趨化因子結(jié)合。ccr5的分子結(jié)構(gòu)：平均分子量為40.6kda，由352個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)上可分為：胞外n-末端，3個(gè)胞外環(huán)（el1-3），3個(gè)胞內(nèi)環(huán)（il1-3），7個(gè)跨膜螺旋和胞內(nèi)c-末端。圖1 ccr5結(jié)構(gòu)圖2.趨化因子及其受體與自身免疫性疾病的關(guān)系：趨化因子首先作為趨化性介質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，但隨著對(duì)趨化因子研究的深入，現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到趨化因子不但對(duì)

10、白細(xì)胞具有趨化作用，而且在免疫細(xì)胞和器官的發(fā)育、免疫應(yīng)答過(guò)程、炎癥反應(yīng)、病原體感染、創(chuàng)傷修復(fù)及腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮廣泛的生理和病理作用14-16。隨著近年來(lái)對(duì)趨化因子及其受體研究的深入，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者均已發(fā)現(xiàn)其二者結(jié)合在自身免疫性疾病中對(duì)t細(xì)胞的募集及趨化進(jìn)行作用，并將相應(yīng)t細(xì)胞聚集至靶器官發(fā)生組織器官損傷。wenzel17等在研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡（sle）時(shí)發(fā)現(xiàn)cxcl10及其受體cxcr3的結(jié)合可定向招募細(xì)胞毒性t 細(xì)胞進(jìn)入靶器官最終造成皮膚損害；barone 等18研究表明，干燥綜合征（ss）患者淚腺角膜上皮細(xì)胞cxcl9、cxcl10、cxcl11及受體cxcr3 表達(dá)均升高；gou

11、lvestre等19通過(guò)對(duì)甲狀腺組織中表達(dá)的細(xì)胞因子和相應(yīng)趨化因子研究，得出ccl21、cxcl12、cxcl13、ccl22在自身免疫性甲狀腺疾?。╝itd）患者的甲狀腺組織中的表達(dá)增加，其中自身免疫性疾病甲狀腺組織中有異位二級(jí)淋巴濾泡形成的cxcl12、cxcl13、ccl22的表達(dá)顯著增加。目前對(duì)于趨化因子及其受體的研究點(diǎn)在于趨化因子在自身免疫性疾病中所起的募集、趨化t細(xì)胞至靶器官的作用，但其在川崎病中的具體作用研究尚不多，本課題即以此為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)探討。3.趨化因子ccl5及其受體ccr5與自身免疫性疾病的關(guān)系：趨化因子ccl5，又稱為rantes（regulated upon ac

12、tivation normal t cell expressed and secreted ），屬于cc趨化因子家族的成員，是一類調(diào)節(jié)正常t細(xì)胞表達(dá)和分泌的細(xì)胞因子，具有介導(dǎo)t細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、nk細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞定向趨化的作用。ccl5 的受體有三個(gè)，分別是ccr1、ccr3和ccr5，其中以ccl5與ccr5的親和力最強(qiáng)，構(gòu)成了 ccl5/ccr5 生物軸。ccr5 屬于趨化因子受體的一種亞型，主要在記憶性靜止期 t 淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，是活性th1淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志物。ccr5的三個(gè)特異性配體為ccl5/rant

13、es、mip-1/ccl4和mip-1/ccl3，其中前兩者所引起的活化信號(hào)比mip-1要強(qiáng)的多。當(dāng)三個(gè)配體與ccr5 結(jié)合后，可以激活 g 蛋白引起細(xì)胞內(nèi)的 ca2+濃度的上升并活化蛋白激酶c，使得白細(xì)胞表現(xiàn)為趨化性及炎性反應(yīng)等20。 自1996年人們克隆該基因并發(fā)現(xiàn)ccr5可以作為hiv的共受體(coreceptor)參與hiv的感染，ccr5就引起人們極大的興趣并一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，后來(lái)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)在一些自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化及惡性腫瘤等的病程中ccr5可能起著關(guān)鍵作用。早期有學(xué)者在對(duì)于幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（jia）的研究中發(fā)現(xiàn)，趨化因子ccl5的表達(dá)

14、水平、表達(dá)部位在 jia 時(shí)發(fā)生了明顯的改變，且在體外誘導(dǎo)jia t細(xì)胞活化后，其表達(dá)更多的ccl5，且滑液中t細(xì)胞產(chǎn)生ccl5的能力顯著強(qiáng)于外周血中的t細(xì)胞，提示jia時(shí)關(guān)節(jié)局部t細(xì)胞在一定的促活化條件下，可產(chǎn)生大量的趨化因子ccl5，從而趨化ccr5陽(yáng)性 t細(xì)胞(主要為thl細(xì)胞)和單核細(xì)胞侵入病變關(guān)節(jié)部位，這種反饋機(jī)制使得關(guān)節(jié)的炎癥遷延不愈21,22。但是ccl5/ccr5生物軸在川崎病中的表達(dá)，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)告。研究?jī)?nèi)容、預(yù)期目標(biāo)或成果（具體說(shuō)明課題研究?jī)?nèi)容、要重點(diǎn)解決的關(guān)鍵問(wèn)題和本課題所要達(dá)到的目標(biāo)或要取得的成果）：一、研究?jī)?nèi)容：1檢測(cè)kd患兒表達(dá)ccl5、ccr5的具體細(xì)胞1).收

15、集kd患兒和正常對(duì)照組外周血 3 4 ml，pbmc分離：無(wú)菌肝素鈉抗凝血 3 4ml，經(jīng)ficoll 密度梯度離心法分離提取外周血單個(gè)核細(xì)胞( pbmcs)；2).分別用抗人ccl5及抗人ccr5抗體對(duì)細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行染色；3). 流式細(xì)胞技術(shù)（fcm）檢測(cè)分析t、b細(xì)胞和單核細(xì)胞中ccl5、ccr5陽(yáng)性細(xì)胞的比例。2檢測(cè)kd患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞ccl5mrna、ccr5mrna的表達(dá)1).pbmc總rna抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna；2).rt-pcr檢測(cè) kd 患兒外周血急性期 ccl5/ccr5的mrna水平。3檢測(cè)將t細(xì)胞活化后ccl5、ccr5的表達(dá)水平1).采用抗cd3單抗及

16、抗cd28單抗聯(lián)合刺激t細(xì)胞，使其活化增殖；2).fcm分析t細(xì)胞表面ccl5、ccr5的表達(dá)水平。4. 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析1.明確ccl5、ccr5分別在外周血pbmc中的具體表達(dá)細(xì)胞；2.對(duì)于活化前后的t細(xì)胞，ccl5、ccr5的表達(dá)水平有何變化；3.找到ccl5、ccr5之間在川崎病患兒中表達(dá)的聯(lián)系。經(jīng)過(guò)上述比較，研究ccl5與ccr5在川崎病患兒外周血中的表達(dá)變化，從而為川崎病發(fā)病機(jī)制和治療手段提供新的思路。二、關(guān)鍵問(wèn)題：1對(duì)研究對(duì)象的臨床數(shù)據(jù)資料和臨床標(biāo)本收集、整理以及實(shí)驗(yàn)分組。2對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。3闡明ccl5、ccr5與kd的相關(guān)性。三、預(yù)期目標(biāo)：1. 明確ccl5、ccr5分

17、別在外周血pbmc中的具體表達(dá)細(xì)胞。2. 找到活化前后的t細(xì)胞ccl5、ccr5的表達(dá)水平變化。3. 對(duì)ccl5、ccr5與kd的相關(guān)性得出結(jié)論。4. 在核心期刊發(fā)表論文2-3篇。擬采用的研究方法、技術(shù)路線、試驗(yàn)方案及可行性分析、現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)：一、研究方法：1進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)資料和臨床標(biāo)本收集、整理。采用病例-對(duì)照研究方法，采集入組kd患兒組和健康對(duì)照組兒童外周血3-4ml放置于0.2%edta抗凝管中，于-80凍存，備用。同時(shí)收集入選對(duì)象的臨床資料并進(jìn)行整理。2檢測(cè)kd患兒表達(dá)ccl5、ccr5的具體細(xì)胞1).pbmc分離：ficoll 密度梯度離心法分離提取外周血單個(gè)核細(xì)胞( pbmcs)；

18、2).分別用抗人ccl5及抗人ccr5抗體對(duì)細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行染色；3). 流式細(xì)胞技術(shù)（fcm）檢測(cè)分析t、b細(xì)胞和單核細(xì)胞中ccl5、ccr5陽(yáng)性細(xì)胞的比例。3檢測(cè)kd患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞ccl5mrna、ccr5mrna的表達(dá)1).pbmc總rna抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna；2).rt-pcr檢測(cè) kd 患兒外周血急性期 ccl5/ccr5的mrna水平。4檢測(cè)將t細(xì)胞活化后ccl5、ccr5的表達(dá)水平1).采用抗cd3單抗及抗cd28單抗聯(lián)合刺激t細(xì)胞，使其活化增殖；2).fcm分析t細(xì)胞表面ccl5、ccr5的表達(dá)水平。5用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析二、實(shí)驗(yàn)方案：1.標(biāo)本1.1

19、研究對(duì)象選取及分組1.1.1病例組選取2013年10月-2014年7月在三峽大學(xué)仁和醫(yī)院、宜昌市中心醫(yī)院及宜昌市二醫(yī)院就診的川崎病患兒20例，年齡波動(dòng)于6月8歲，平均年齡(2.101.83)歲，男：女=2:1。受檢對(duì)象按入選順序編號(hào)，如第1個(gè)入選對(duì)象編號(hào)為1。診斷標(biāo)準(zhǔn)選用美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)制定的川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)23:1)發(fā)熱持續(xù)5天以上，抗生素治療無(wú)效，不能被其他已知疾病所解釋；2)雙眼結(jié)膜充血(非滲出性)；3)口唇鮮紅、皸裂，口唇點(diǎn)膜彌散性充血，楊梅舌；4)多形性紅斑、皮瘆；5)在急性期有手足硬腫，掌距紅斑；在恢復(fù)期指(趾)端甲床皮膚移行處有膜狀脫皮；6)急性非化膿性頸淋巴結(jié)大，常為單側(cè)，其直徑1

20、.5cm或更大。以上標(biāo)準(zhǔn)至少滿足5項(xiàng)，可確診為川崎病，其中1)為必備條件。若患兒不明原因發(fā)熱超過(guò)5天，伴其他診斷標(biāo)準(zhǔn)中的3項(xiàng)，并經(jīng)二維超聲心動(dòng)圖或冠狀動(dòng)脈造影確診存在冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張或冠狀動(dòng)脈瘤，除外其他疾病，亦可確診。本研究中所有患兒均符合上述標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)亦滿足日本厚生省川崎病研究課題組第5版修訂川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)。參照美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)及日本衛(wèi)生部川崎病并冠狀動(dòng)脈損害診斷標(biāo)準(zhǔn)，將病例組分為冠脈損害組(6例)和冠脈無(wú)損害組(14例)。冠狀動(dòng)脈損害的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：1)冠狀動(dòng)脈壁輝度增強(qiáng)；2)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張標(biāo)準(zhǔn)：3歲以下患兒冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑2.5mm，3-9歲患兒冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑3mm，9-14歲患兒冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑義4m

21、m；冠狀動(dòng)脈某一節(jié)段內(nèi)徑超過(guò)相鄰段內(nèi)徑比值的1.5倍。3)冠狀動(dòng)脈瘤：冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張段內(nèi)徑超過(guò)相鄰段內(nèi)徑比值的1.5倍，且內(nèi)徑4mm；冠狀動(dòng)脈呈瘤樣擴(kuò)張,其形態(tài)呈囊袋形或梭形，內(nèi)徑8mm為巨大型冠狀動(dòng)脈瘤。1.1.2 對(duì)照組為同期以上三家醫(yī)院門診兒童20例，年齡波動(dòng)于6月7歲，平均年齡(2.321.75)歲，男：女=2:1，除外感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、川崎病等疾病家族史。所有入組成員均為漢族，在性別、年齡等方面均無(wú)顯著性差異，具有可比性。受檢對(duì)象按入選順序編號(hào)，如第3個(gè)入選對(duì)象編號(hào)為c3。1.2 對(duì)臨床數(shù)據(jù)資料和臨床標(biāo)本收集、整理采用病例-對(duì)照研究方法，采集入組kd患兒組和健康對(duì)照組兒童外周血

22、3-4ml放置于0.2%edta抗凝管中，于-80凍存，備用。同時(shí)收集入選對(duì)象的臨床資料并進(jìn)行整理。1.2.1血液的采集分別采集入組kd患兒和健康對(duì)照組兒童外周血3-4ml，以枸櫞酸鈉抗凝，于-80c保存?zhèn)溆?，其中kd組釆取時(shí)間為急性期（病程的10天內(nèi)），對(duì)照組為門診第1天，所有采集對(duì)象取血時(shí)均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)。1.2.2收集入選對(duì)象的臨床資料并進(jìn)行整理。2實(shí)驗(yàn)方法2.1檢測(cè)kd患兒表達(dá)ccl5、ccr5的具體細(xì)胞1).收集kd患兒和正常對(duì)照組外周血 3 4 ml，pbmc分離：無(wú)菌肝素鈉抗凝血 3 4ml，經(jīng)ficoll 密度梯度離心法分離提取外周血單個(gè)核細(xì)胞( pbmcs)；2).分別用抗人

23、ccl5及抗人ccr5抗體對(duì)細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行染色；3). 流式細(xì)胞技術(shù)（fcm）檢測(cè)分析t、b細(xì)胞和單核細(xì)胞中ccl5、ccr5陽(yáng)性細(xì)胞的比例。2.2檢測(cè)kd患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞ccl5mrna、ccr5mrna的表達(dá)1).pbmc總rna抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna；2).rt-pcr檢測(cè) kd 患兒外周血急性期 ccl5/ccr5的mrna水平。2.3檢測(cè)將t細(xì)胞活化后ccl5、ccr5的表達(dá)水平1).采用抗cd3單抗及抗cd28單抗聯(lián)合刺激t細(xì)胞，使其活化增殖；2).fcm分析t細(xì)胞表面ccl5、ccr5的表達(dá)水平。3 分析結(jié)果3.1明確ccl5、ccr5分別在外周血pbmc中的具體

24、表達(dá)細(xì)胞；3.2對(duì)于活化前后的t細(xì)胞，ccl5、ccr5的表達(dá)水平有何變化；3.3找到ccl5、ccr5之間在川崎病患兒中表達(dá)的聯(lián)系。經(jīng)過(guò)上述比較，研究ccl5與ccr5在川崎病患兒外周血中的表達(dá)變化，從而為川崎病發(fā)病機(jī)制和治療手段提供新的思路。三、技術(shù)路線：進(jìn)行臨床標(biāo)本和臨床數(shù)據(jù)資料收集、整理將研究對(duì)象分組采用抗cd3單抗及抗cd28單抗聯(lián)合刺激t細(xì)胞，使其活化增殖；fcm分析t細(xì)胞表面ccl5、ccr5的表達(dá)水平。檢測(cè)表達(dá)ccl5、ccr5的具體細(xì)胞；ficoll 密度梯度離心法分離提取外周血pbmcs；細(xì)胞染色；fcm檢測(cè)分析ccl5、ccr5陽(yáng)性細(xì)胞的比例外周血pbmc總rna抽提及逆

25、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna；rt-pcr檢測(cè) kd 患兒外周血急性期 ccl5/ccr5的mrna水平分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究ccl5與ccr5在川崎病患兒外周血中的表達(dá)變化四、可行性分析：1.本課題是根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基礎(chǔ)上充分論證提出的，有充分的理論依據(jù)。2.本課題擬在三峽大學(xué)免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及第二臨床醫(yī)院完成，指導(dǎo)老師具有良好的理論基礎(chǔ)和扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)知識(shí)。五、現(xiàn)有研究基礎(chǔ)：1.已采集了部分研究對(duì)象資料，并進(jìn)行了相對(duì)應(yīng)的分組及采血。2.國(guó)內(nèi)學(xué)者已進(jìn)行過(guò)ccl5、ccr5在其他疾病中的表達(dá)研究，可提供相應(yīng)的研究方法及路線參考。3.前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已分離出pbmc并成功進(jìn)行了t細(xì)胞的活化增殖。

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