《宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》（2021）要點(diǎn)匯總

1、本word文檔 可編輯 可修改84.宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)（2021）要點(diǎn)感染性疾病一直備受臨床關(guān)注。新型冠狀病毒肺炎全球大流行，給世界經(jīng)濟(jì)和人類健康帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，更讓病原的精準(zhǔn)快速檢測(cè)成為關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)，因物價(jià)、政策等方面的靈活性，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室已廣泛開展基于高通量測(cè)序（也稱新一代測(cè)序技術(shù)，NGS）的病原學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。NGS技術(shù)應(yīng)用的成功案例，對(duì)部分感染性疾病的病原學(xué)診斷起到?jīng)Q定性作用。然而目前，臨床對(duì)NGS應(yīng)用的適應(yīng)證認(rèn)識(shí)不足，送檢存在較大的盲目性和隨意性；操作過(guò)程復(fù)雜，缺乏規(guī)范；提供檢驗(yàn)的主體多元而檢測(cè)質(zhì)量良莠不齊；結(jié)果解釋缺乏可信的標(biāo)準(zhǔn)，誤導(dǎo)臨床的案例

2、屢見不鮮，限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用和普及。一、共識(shí)制定過(guò)程二、分類和術(shù)語(yǔ)（一）分類宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)（mNGS）通過(guò)對(duì)臨床樣本的DNA或RNA進(jìn)行鳥槍法測(cè)序，可以無(wú)偏倚地檢測(cè)多種病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲）。二代和三代測(cè)序平臺(tái)均可用于該項(xiàng)技術(shù)。按從臨床樣本中提取的核酸類型可以分為宏基因組測(cè)序和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。按照測(cè)序模式可以分為單端測(cè)序和雙端測(cè)序。（二）術(shù)語(yǔ)和定義NGS：也稱高通量測(cè)序，是一種可以同時(shí)對(duì)數(shù)十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)條DNA分子序列進(jìn)行讀取的測(cè)序技術(shù)。mNGS：m指宏基因組，也稱元基因組，是標(biāo)本中全部生物（人、微生物）基因組的總稱。診斷宏基因組學(xué)：指用于臨床診斷目的的宏基因組學(xué)。

3、臨床宏基因組學(xué)：含義與診斷宏基因組學(xué)類似，但應(yīng)用場(chǎng)景更為廣泛。微生物組：指某一個(gè)系統(tǒng)、生態(tài)環(huán)境或特定區(qū)域中全部微生物的總和。試劑盒基因組：游離脫氧核糖核酸（cfDNA）：讀長(zhǎng)：文庫(kù)：比對(duì)：深度：覆蓋率：相對(duì)豐度：Q值：標(biāo)定對(duì)照：無(wú)模板對(duì)照：檢出限（LOD）：正常無(wú)菌部位：三、mNGS技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病的適應(yīng)證（一）臨床適應(yīng)證共識(shí)1對(duì)常規(guī)微生物學(xué)檢查容易明確病原體的感染，如尿路感染通過(guò)尿培養(yǎng)手段，不建議mNGS。共識(shí)2患者表現(xiàn)為發(fā)熱或發(fā)熱癥候群，病因未明確（符合不明原因發(fā)熱定義），考慮感染或不除外感染，但規(guī)范性經(jīng)驗(yàn)抗感染治療無(wú)效，考慮應(yīng)用常規(guī)技術(shù)檢測(cè)的同時(shí)，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識(shí)3各

4、種原因?qū)е禄颊呒蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)，不除外感染所致，或考慮繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴(yán)重感染，建議常規(guī)檢測(cè)的同時(shí)，或在常規(guī)檢測(cè)基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識(shí)4免疫受損患者疑似繼發(fā)感染，常規(guī)病原學(xué)檢查未能明確致病原或/和規(guī)范性經(jīng)驗(yàn)抗感染治療無(wú)效，建議進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)的同時(shí)，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識(shí)5疑似局部感染，病原學(xué)診斷未明確、不及時(shí)處理則后果嚴(yán)重（危及生命或會(huì)導(dǎo)致局部功能不可逆性喪失）時(shí)，考慮常規(guī)檢測(cè)的同時(shí)，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。如眼部（角膜炎/潰瘍、眼內(nèi)炎、急性視網(wǎng)膜壞死等）、鼻部、耳部、喉部感染、糖尿病足、外傷累及深部組織等情況。共識(shí)6高度疑似感染性疾病，但病原學(xué)診斷未明確且常規(guī)抗感

5、染治療無(wú)效，建議進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)、處理原發(fā)感染灶（如拔去導(dǎo)管、外科引流或拔去引流管、玻璃體切除）、調(diào)整經(jīng)驗(yàn)抗微生物治療方案的同時(shí)開展mNGS。共識(shí)7慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者臨床表現(xiàn)相似、難以鑒別時(shí)，病情嚴(yán)重或抗感染治療療效不佳需要明確病因，建議在完善常規(guī)檢測(cè)、調(diào)整經(jīng)驗(yàn)治療的同時(shí)開展mNGS。共識(shí)8除以上共識(shí)27之外的患者人群，不建議無(wú)條件普遍進(jìn)行mNGS檢測(cè)；進(jìn)行mNGS檢測(cè)前請(qǐng)感染病學(xué)和/或臨床微生物學(xué)專家會(huì)診。共識(shí)9不建議應(yīng)用mNGS技術(shù)評(píng)估抗感染治療效果。（二）微生物學(xué)適應(yīng)證共識(shí)10針對(duì)微生物，考慮出現(xiàn)疑似新發(fā)病原體，或某特殊病原體，缺乏傳統(tǒng)技術(shù)或傳統(tǒng)技術(shù)手段不

6、能確定種屬時(shí)，建議常規(guī)檢測(cè)的同時(shí)，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識(shí)11臨床表現(xiàn)高度懷疑感染性疾病而多種傳統(tǒng)技術(shù)反復(fù)檢測(cè)不能明確致病微生物，但仍高度懷疑微生物所致，建議繼續(xù)完善更多檢測(cè)技術(shù)的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識(shí)12傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)的結(jié)果不能解釋臨床表現(xiàn)的全貌或/和抗感染治療的反應(yīng)，懷疑同時(shí)存在其他病原感染時(shí)，建議進(jìn)一步完善更多檢測(cè)技術(shù)的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識(shí)13感染性疾病的病原體已明確或高度懷疑某病原體，臨床表現(xiàn)提示該病原體可能具有特殊的毒力表型，需要了解其毒力因子的相關(guān)信息時(shí)，可以考慮對(duì)感染相應(yīng)臨床標(biāo)本進(jìn)行mNGS物種鑒定的同時(shí)，采用mNGS檢測(cè)毒力基因。（三）耐藥

7、學(xué)適應(yīng)證共識(shí)14感染發(fā)生在正常有微生物定植的部位，或檢測(cè)標(biāo)本采集有污染時(shí)（如支氣管肺泡灌洗液），不建議采用mNGS進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。共識(shí)15感染發(fā)生在正常無(wú)微生物定植的部位且標(biāo)本采集過(guò)程污染概率低時(shí)，可以考慮采用mNGS進(jìn)行物種鑒定的同時(shí)檢測(cè)耐藥基因，并通耐藥表型試驗(yàn)對(duì)耐藥基因進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)有菌種特異性的耐藥性基因，在測(cè)序深度足夠時(shí)，可以考慮應(yīng)用mNGS檢測(cè)獲得性的耐藥基因，預(yù)測(cè)耐藥表型。（四）流行病學(xué)和感染控制學(xué)適應(yīng)證共識(shí)16出現(xiàn)某種疾病的聚集性發(fā)病或暴發(fā)，懷疑是微生物導(dǎo)致的感染性疾病但病原不明，且常規(guī)快速檢測(cè)無(wú)結(jié)果時(shí)，建議完善常規(guī)檢測(cè)的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上開展mNGS明確致病微生物。共識(shí)17感染性

8、疾病患者有特殊區(qū)域（如北美地區(qū)有某些致病性真菌）旅居史，或有特殊職業(yè)工作史（如畜牧業(yè)、屠宰業(yè)、水產(chǎn)業(yè)等），感染病原未明，建議常規(guī)手段檢測(cè)的同時(shí)開展mNGS。四、mNGS的基本流程和管理要求（一）標(biāo)本采集共識(shí)18從正常無(wú)菌部位采集mNGS檢測(cè)標(biāo)本，應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免污染；從有菌定植或污染部位采集的標(biāo)本，應(yīng)采取必要措施，盡量減少污染；用于宏基因組RNA測(cè)序的標(biāo)本，應(yīng)添加核酸穩(wěn)定劑。mNGS標(biāo)本的運(yùn)送須防污染、防震蕩、冷鏈快速運(yùn)送；標(biāo)本如不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)保存于低于-70冰箱或液氮（血液標(biāo)本應(yīng)分離血漿后保存）。建議的常用臨床標(biāo)本采集要求和相關(guān)說(shuō)明見表1。（二）DNA/RNA提取共識(shí)19建議實(shí)驗(yàn)室的核

9、酸提取流程、病原體核酸提取試劑盒應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證；高宿主背景標(biāo)本提取時(shí)應(yīng)采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法去除宿主細(xì)胞或核酸；整個(gè)提取過(guò)程必須有防污染措施，包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照等。（三）建庫(kù)和測(cè)序共識(shí)20建議采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的流程進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序；建庫(kù)慎用各種擴(kuò)增方法，因?yàn)閿U(kuò)增會(huì)使正常菌群或污染病原體的序列擴(kuò)大，難以判斷真正病原體；測(cè)序原始數(shù)據(jù)應(yīng)進(jìn)行質(zhì)控，并且過(guò)濾掉低復(fù)雜度、低質(zhì)量的序列，確保測(cè)序原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量。（四）生物信息學(xué)分析共識(shí)21建議生物信息學(xué)分析流程應(yīng)進(jìn)行性能確認(rèn)和驗(yàn)證，包括數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)化、比對(duì)方法和比對(duì)參數(shù)的優(yōu)化等，確保準(zhǔn)確報(bào)告致病病原體。五、mNGS應(yīng)用于感染性疾病病原診斷的質(zhì)量管理保證（一）特殊病原體的

10、DNA/RNA提取技術(shù)要求共識(shí)22建議病毒核酸提取應(yīng)保證病毒核酸的完整性；對(duì)于細(xì)胞壁較厚的病原體應(yīng)采取常規(guī)方法以外的破壁方法。（二）標(biāo)本采集、DNA/RNA提取、建庫(kù)引入的實(shí)驗(yàn)室污染問(wèn)題共識(shí)23污染既包括標(biāo)本采集、核酸提取、建庫(kù)測(cè)序引入的污染，也包括生物信息學(xué)分析引入的污染；建議實(shí)驗(yàn)室自建有效的防污染策略，包括使用背景微生物庫(kù)的方法。（三）測(cè)序深度對(duì)結(jié)果的影響共識(shí)24建議實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證不同標(biāo)本、不同感染類型病原體檢測(cè)所需的測(cè)序深度。（四）生物信息學(xué)分析結(jié)果中疑似背景微生物對(duì)病原診斷結(jié)果的影響共識(shí)25建議實(shí)驗(yàn)室建立自己的背景微生物數(shù)據(jù)庫(kù)以控制假陽(yáng)性結(jié)果。（五）病原診斷閾值的設(shè)定共識(shí)26考慮建立mNG

11、S的診斷閾值以排除背景微生物的干擾、改善檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。（六）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)病原學(xué)診斷結(jié)果的影響共識(shí)27建議實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證自建的數(shù)據(jù)庫(kù)中物種的準(zhǔn)確性，過(guò)濾數(shù)據(jù)庫(kù)錯(cuò)誤和不正確的序列，并定期更新數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡最大可能完善病毒、真菌和寄生蟲數(shù)據(jù)庫(kù)，提高鑒定的敏感性和準(zhǔn)確性。六、mNGS應(yīng)用于感染性疾病病原診斷的性能驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化共識(shí)28對(duì)mNGS整個(gè)檢測(cè)和分析流程進(jìn)行性能驗(yàn)證是其應(yīng)用于臨床的瓶頸，建議對(duì)感染性疾病常見的“代表性”物種進(jìn)行檢出限、包容性、抗干擾、精密度、攜帶和交叉污染、穩(wěn)定性等的驗(yàn)證。七、mNGS應(yīng)用于感染性疾病的報(bào)告解讀共識(shí)29解讀報(bào)告考慮如下參數(shù)：測(cè)序質(zhì)量（是否去除低復(fù)雜度、低質(zhì)量序列，

12、Q20、Q30等）、讀長(zhǎng)、特異性讀長(zhǎng)、覆蓋率、深度、豐度、微生物序列的數(shù)據(jù)量、閾值等。共識(shí)30mNGS檢測(cè)報(bào)告中，建議結(jié)合不同標(biāo)本類型與檢出病原微生物的種類進(jìn)行解讀，區(qū)分無(wú)菌部位（血、無(wú)菌體液、組織、骨髓等）與正常有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口）。確認(rèn)致病微生物時(shí)，應(yīng)考慮檢出微生物是否為感染部位的潛在病原。如腦脊液檢出新型隱球菌，呼吸道標(biāo)本檢出結(jié)核分枝桿菌、腺病毒、流感病毒，關(guān)節(jié)液或血液標(biāo)本檢出布魯菌屬，均可認(rèn)為是致病微生物。注意排除常見定植菌、污染菌與工程菌的影響。共識(shí)31血漿樣本對(duì)cfDNA進(jìn)行mNGS檢測(cè)時(shí)，建議從臨床的角度鑒別檢出序列屬于致病微生物、樣本污染、死亡微生物裂解，還是

13、定植菌群所致的一過(guò)性菌血癥。共識(shí)32mNGS報(bào)告中常規(guī)容易培養(yǎng)的病原菌，建議臨床醫(yī)師結(jié)合傳統(tǒng)方法，綜合判斷其臨床價(jià)值。共識(shí)33建議對(duì)于在核酸提取過(guò)程中破壁困難的微生物，如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌）等，即使在檢測(cè)報(bào)告中讀長(zhǎng)數(shù)較低，也要考慮其為致病微生物的可能，并采用其他方法驗(yàn)證，如特異引物的PCR或一代測(cè)序等分子生物學(xué)檢測(cè)，G試驗(yàn)，GM試驗(yàn)，曲霉菌IgG抗體或隱球菌莢膜多糖抗原等血清學(xué)試驗(yàn)。共識(shí)34采用mNGS進(jìn)行病原微生物鑒定的同時(shí)，可以考慮檢測(cè)耐藥基因，但需要將耐藥基因準(zhǔn)確定位到具體的病原體上以明確其臨床價(jià)值。即通過(guò)對(duì)mNGS測(cè)得序列進(jìn)行具體病原

14、體基因組組裝之后，確定耐藥基因位于哪個(gè)病原體上，位于質(zhì)粒上還是位于染色體上。共識(shí)35mNGS對(duì)于新發(fā)或少見病原微生物的檢出具有重要價(jià)值。建議解讀報(bào)告單前應(yīng)了解比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的內(nèi)容，明確其是否涵蓋少見病原或新發(fā)病原。檢出高致病性病原微生物，應(yīng)及時(shí)與臨床聯(lián)系。共識(shí)36mNGS結(jié)果為陰性，對(duì)于排除感染常具有較好的陰性預(yù)測(cè)值。但對(duì)于某些病原微生物，如結(jié)核分枝桿菌等，原始樣本中含量較少，或核酸提取困難的病原微生物，應(yīng)考慮mNGS檢測(cè)靈敏度較低，陰性預(yù)測(cè)性差，并不一定優(yōu)于PCR等常規(guī)檢測(cè)方案。共識(shí)37建立mNGS病原診斷的閾值影響因素較多，包括測(cè)序平臺(tái)、測(cè)序流程、標(biāo)本類型、病原種類、患者狀況，目前尚無(wú)統(tǒng)一公認(rèn)的閾值，建議各實(shí)驗(yàn)室建立自已的閾值，并在臨床工作中加以驗(yàn)證。共識(shí)38不同病原微生物讀長(zhǎng)對(duì)結(jié)果判斷的影響：同等條件下（相同微生物，相同標(biāo)本），如某一微生物檢出的讀長(zhǎng)數(shù)量多，為致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因組大小不同（寄生蟲真菌細(xì)菌病毒），核酸提取效率存在差異難易程度：病毒/span革蘭陰性菌/span革蘭陽(yáng)性菌（不包括分枝桿菌、需氧放線菌等）/span真菌，致病力也相去甚遠(yuǎn)，因此不能僅僅依靠讀長(zhǎng)多少來(lái)判斷是否感染，建議同時(shí)考慮病原微生物種類差異與