葛根素與石杉?jí)A甲改善缺血-再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、葛根素與石杉?jí)A甲改善缺血-再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶 摘要 目的:觀察葛根素(pur)與石杉?jí)A甲(hup-a)單用及合用對(duì)缺血-再灌注(i/r)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響,并探討其作用機(jī)制。方法:反復(fù)夾閉小鼠頸總動(dòng)脈制備i/r模型,將小鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(sham)、缺血-再灌注模型組(i/r)、石杉?jí)A甲組(hup-a)、葛根素組(pur)及葛根素加石杉?jí)A甲聯(lián)合用藥組(purhup-a)。分別以跳臺(tái)法評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力,以高效液相法(hplc)測(cè)定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量,以流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果:pur(120 mg/kg)或hup-a(400 g/kg)都可提高i/r小鼠的學(xué)習(xí)記憶成

2、績(jī),pur組的作用優(yōu)于hup-a組,聯(lián)合用藥組(hup-a 200 g/kg+pur 60 mg/kg)作用最強(qiáng);各用藥組都可降低大腦皮層細(xì)胞凋亡率,升高大腦皮層某些單胺類遞質(zhì)水平,其中,聯(lián)合用藥組的大腦皮層細(xì)胞凋亡率低于hup-a組,大腦皮層高香草酸(hva)水平高于pur組。結(jié)論:在該給藥劑量下,pur改善i/r小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用強(qiáng)于hup-a,兩藥的作用機(jī)制與減少大腦皮層細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)大腦皮層單胺類遞質(zhì)水平有關(guān),聯(lián)合用藥組作用最強(qiáng)。 關(guān)鍵詞 葛根素;石杉?jí)A甲;缺血-再灌注;學(xué)習(xí)記憶 中圖分類號(hào) r285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼a 文章編號(hào)1673-7210(2009)03(a)-025-03

3、puerarin and huperzine a improve learning memory dysfunction induced by ischemia-reperfusion in mice shi rui-li, shen shu-ping, pang dong-wei, wang li-jun, zhao li-juan, gao li-jun (baotou medical college, baotou014010, china) abstract objective: to observe the effects of puerarin (pur) and huperzin

4、e a (hup-a) on learning memory dysfunction induced by ischemia-reperfusion (i/r) in mice and explore its mechanism. methods: i/r model in mice was performed by repetitious ligation of bilateral common carotid artery, and mice were randomly divided into five groups: sham group, i/r group, hup-a group

5、, pur group and purhup-a group.learning memory ability was evaluated by step-down test. monoamine nervous transmitter level and cortex neuron apoptosis were measured by hplc and flow cytometry respectively. results: both pur and hup-a improved learning memory ability of i/r mice, the effect of pur g

6、roup was better and the effect of combination group was the most significant. both pur and hup-a decreased neuron apoptosis and raised content of monoamine nervous transmitter of i/r mice. the cortex neuron apoptosis rate in combination group was lower than that in hup-a group,the homovanillic acid

7、(hva) level of cerebral cortex in combination group was higher than that of pur group. conclusion: learning memory dysfunction induced by i/r in mice could be improved by pur and hup-a, the effect of pur was better than that of hup-a with administered dose, the mechanisms of drugs might be related t

8、o reduction of neuron apoptosis and regulating of the monoamine nervous transmitter level in cerebral cortex, combination of pur and hup-a resulted in the most obvious effects. key words puerarin; huperzine a; ischemia-reperfusion; learning memory pur可顯著改善微循環(huán),增強(qiáng)腦i/r動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能,在臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。hup-a

9、是高效、高選擇性中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑,可改善多種認(rèn)知缺陷動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能,在國內(nèi)廣泛應(yīng)用于阿爾茨海默病的治療。由于作用機(jī)制不盡相同,為探討二者合用后能否通過作用于不同靶點(diǎn)而使藥效增強(qiáng),本研究通過制備i/r擬血管性癡呆模型,觀察pur和hup-a單用及合用對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響,并對(duì)藥物作用機(jī)制進(jìn)行探討。 1 材料與方法 1.1 藥品與試劑 葛根素注射液(浙江康恩貝制藥股份有限公司,批號(hào)030809),石杉?jí)A甲片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,批號(hào)040201),去甲腎上腺素(ne)、多巴胺(da)、3,4-二羥苯乙酸(dopac)、高香草酸(hva) 標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)異丙腎上腺素(sigma公司)。 1

10、.2 動(dòng)物 昆明小鼠,清潔級(jí),體重(225) g,雌雄各半,由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,許可證號(hào)碼為scxk(蒙)2002-0001。 1.3 儀器 高效液相色譜系統(tǒng):hplc泵(shimadzu,lc-6a,japan),電化學(xué)檢測(cè)器(bas amperometric detector,cc-4,usa),分離柱(dikma,diamond,c-18 ods,250 mm4.6 mm,usa);流式細(xì)胞儀(epics-xl,beckman coulter);olympus顯微鏡(c-35a);st-2型跳臺(tái)儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);自制自主活動(dòng)箱(直徑40 cm圓箱,底面劃分為2

11、1格)。 1.4 方法 1.4.1 分組及手術(shù)將小鼠隨機(jī)分5組:假手術(shù)組(sham)、缺血-再灌注模型組(i/r)、石杉?jí)A甲400 g/kg組(hup-a)、葛根素120 mg/kg組(pur)及葛根素60 mg/kg+石杉?jí)A甲200 g/kg聯(lián)合用藥組(pur+hup-a)。石杉?jí)A甲按10 ml/kg體重灌胃,葛根素腹腔注射,假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水,每天次,連續(xù)3 d。第3天給藥2 h后參照文獻(xiàn)1方法造模。分離小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈,夾閉血管20 min,松開10 min,反復(fù)3次,第1次缺血同時(shí)尾部放血約0.3 ml。保持小鼠肛溫于36左右。假手術(shù)組同上處理,但不夾閉動(dòng)脈,不放血

12、。 1.4.2 跳臺(tái)訓(xùn)練將小鼠放入跳臺(tái)儀,通38 v交流電,記錄小鼠第一次逃避到平臺(tái)上的潛伏期(escape latency)和5 min內(nèi)觸電時(shí)間(error time)和觸電次數(shù)(error frequency)作為學(xué)習(xí)成績(jī),如5 min內(nèi)未跳上平臺(tái),潛伏期以300 s計(jì);24 h后測(cè)試放于平臺(tái)上的小鼠第一次跳至銅柵上受電擊的潛伏期(step down latency)及3 min內(nèi)錯(cuò)誤時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù),作為記憶成績(jī)。測(cè)試時(shí),若小鼠在平臺(tái)上超過3 min,其潛伏期即以180 s計(jì)。 1.4.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)大腦皮層組織取材,置于70%乙醇中固定后制備細(xì)胞懸液,加入碘化丙啶(終濃度為100

13、g/ml),4避光染色30 min,過濾后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),應(yīng)用muticycle av分析軟件對(duì)dna細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析。測(cè)定細(xì)胞周期各期的dna含量,得出凋亡細(xì)胞所占的比例。 1.4.4 單胺類遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量測(cè)定樣品制備及測(cè)定:皮層組織稱重后立即加入冷0.4 mol/l高氯酸溶液中勻漿,離心15 min,吸取上清液,再加入1/2體積的鉀離子緩沖液,混勻后于冰浴中放置10 min,再離心10 min,取上清液20 l進(jìn)樣于hplc,用電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定,內(nèi)標(biāo)法定量,峰面積計(jì)算含量。色譜條件:泵流量0.9 ml/min;電化學(xué)檢測(cè)器工作電壓:+0.76 v。流動(dòng)相:0.1 mol/l檸

14、檬酸;0.1 mol/l醋酸鈉,ph 3.7,內(nèi)含15%甲醇;1.2 mmol/l辛烷基磺酸鈉;1.3 mmol/l二正丁胺。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以“均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差”(xs)表示,采用方差分析和q檢驗(yàn)分析。 2 結(jié)果 2.1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 由表1和表2可知,i/r組學(xué)習(xí)記憶各項(xiàng)成績(jī)均差于sham組;各給藥組都可提高i/r小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī),其中,pur組及pur+hup-a組的成績(jī)好于hup-a組,pur+hup-a組成績(jī)最好。 表1 葛根素和石杉?jí)A甲對(duì)缺血-再灌注小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)的影響(xs) table 1 effect of puerarin and huperzine a on learni

15、ng behavior of dementia mice induced by ischemia-reperfusion in step down test (xs) compared with sham group, #p0.01, #p0.001; compared with i/r group, *p0.01, *p0.001; compared with hup-a group, p0.05 表2 葛根素和石杉?jí)A甲對(duì)缺血-再灌注小鼠記憶成績(jī)的影響(xs) table 2 effect of puerarin and huperzine a on memory behavior of d

16、ementia mice induced by ischemia-reperfusion in step down test (xs) compared with sham group, #p0.01, #p0.001; compared with i/r group, *p0.05, *p0.01, *p0.001; compared with hup-a group, p0.05, p0.01 2.2 大腦皮層細(xì)胞凋亡 與sham組比較,i/r組小鼠大腦皮層細(xì)胞dna在細(xì)胞周期g0/g1期前的亞g1期含量明顯增加,說明細(xì)胞凋亡率明顯升高。各給藥組都可減少細(xì)胞凋亡,pur+hup-a組作用優(yōu)

17、于hup-a組(p0.05),見表3。 表3 葛根素和石杉?jí)A甲對(duì)缺血-再灌注小鼠大腦皮層細(xì)胞凋亡的影響(xs,n=5,%) table 3 effects of puerarin and huperzine a on neuron apoptosis in cerebral cortex of ischemia-reperfusion mice(xs,n=5,%) compared with sham group, #p0.001; compared with i/r group, *p0.05, *p0.01; compared with hup-a group, p0.05 2.3 大腦皮

18、層單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量 i/r組小鼠大腦皮層ne、da及hva含量下降;各給藥組ne、da及hva含量有不同程度的回升;pur+hup-a組hva含量明顯高于pur組;各組dopac含量變化不明顯,見表4。 表4 葛根素和石杉?jí)A甲對(duì)缺血-再灌注小鼠大腦皮層ne、da、dopac及hva的影響(xs,n=10,ng/g腦組織) table 4 effects of puerarin and huperzine a on ne, da, dopac and hva in cerebral cortex of ischemia-reperfusion mices (xs,n=10, ng/

19、g brain tissue) compared with sham group, #p0.05, #p0.01; compared with i/r group, *p0.05; compared with pur group, p0.05 3 討論 血管性癡呆的智能障礙主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶能力減退,正如本實(shí)驗(yàn)所制備模型動(dòng)物的表現(xiàn),說明造模成功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,hup-a和pur單用或合用都能不同程度地提高i/r小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī),pur(120 mg/kg)的藥效又好于hup-a(400 g/kg),聯(lián)合用藥組作用最強(qiáng)。 細(xì)胞凋亡參與了多種老年性疾病的發(fā)病進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示,hup-a和

20、pur單用或合用都可減少i/r小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用,其中hup-a作用較差。類似的研究表明,hup-a可以上調(diào)抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因bax和p53的過度表達(dá)2,也可在蛋白水平降低caspase-33活性。pur可通過上調(diào)bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)bax、caspase-3等蛋白的表達(dá)4,5,抑制i/r所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂在vd的發(fā)展和預(yù)后過程中發(fā)揮重要作用。本研究中觀察到i/r小鼠的大腦皮層ne、da及hva水平明顯降低,可能因?yàn)槿毖竽芰咳狈?,單胺類遞質(zhì)的合成、貯存和重?cái)z取功能都嚴(yán)重降低,已合成的遞質(zhì)大量釋放,進(jìn)一步被降解或帶入體液中,致使

21、腦實(shí)質(zhì)中單胺類遞質(zhì)的含量明顯下降,同時(shí)缺血時(shí)鈣離子內(nèi)流的增加也促進(jìn)了單胺類遞質(zhì)的進(jìn)一步釋放6,單胺類遞質(zhì)異常釋放又可加速組織脂質(zhì)過氧化,促使線粒體氧化磷酸化脫耦聯(lián),加重腦缺血7。本研究結(jié)果顯示,hup-a和pur都可明顯阻止i/r時(shí)大腦皮質(zhì)na、da及hva的減少,可能是通過減少i/r期間腦組織單胺類遞質(zhì)異常釋放而發(fā)揮作用,由此產(chǎn)生兩個(gè)方面的后果,一方面減弱了單胺類遞質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用,減輕i/r引起的腦損傷,發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用;另一方面,因?yàn)槟I上腺素能系統(tǒng)能夠廣泛調(diào)節(jié)腦區(qū)的突觸傳入活動(dòng),提高注意力,也促進(jìn)信息的鞏固和再現(xiàn),da對(duì)記憶也有維護(hù)作用8,所以,hup-a和(或)pur可通過提高n

22、e和da的含量而改善動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力。有資料表明,i/r期間單胺類遞質(zhì)異常釋放,可通過誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣超載及自由基大量產(chǎn)生,最終參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡9;而本研究結(jié)果提示,hup-a和pur可能通過減少i/r小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步維持神經(jīng)細(xì)胞的正常功能,從而穩(wěn)定腦組織中單胺類遞質(zhì)的水平。 有些學(xué)者認(rèn)為,大腦遭到i/r損傷時(shí),表現(xiàn)為ache活力上升,使乙酰膽堿降解加快,膽堿能神經(jīng)功能下降10。膽堿能假說認(rèn)為,中樞膽堿系統(tǒng)功能下降導(dǎo)致認(rèn)知能力受損。hup-a是一種高效、高選擇性中樞ache抑制劑,故可有效提高動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力。pur或pur與hup-a合用對(duì)ache活性的影響尚需進(jìn)一步研究。 參考文獻(xiàn) 1

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